一种ETGE多肽在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中的应用

摘要

本发明涉及一种ETGE多肽在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中的应用。通过靶向NRF2的ETGE基序开发出一种ETGE多肽，使其作为强有效的NRF2特异性激活剂，将该ETGE多肽应用在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中，为预防和治疗包括但不限于肝脏的多种器官缺血再灌注损伤提供了新的治疗策略。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种ETGE多肽在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术：

肝脏缺血再灌注(ischemia and reperfusion,I/R)损伤常发生于肝脏移植、肝脏切除手术、休克等，是造成手术失败甚至是患者死亡的重要原因。再灌注时期产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，导致细胞膜结构中的脂质和蛋白质被氧化，最终导致细胞膜和线粒体膜通透性发生改变，进而引发细胞凋亡和坏死。因此，再灌注时期的氧化应激与抗氧化系统失衡是引发肝脏I/R损伤的重要原因。而目前临床上除了基础的抗炎保肝药，并没有针对I/R损伤的预防或治疗用药。

NRF2(nuclear factor erythroid 2like 2)是细胞内非常重要的转录因子，在维持细胞内氧化还原稳态上发挥着重要的调控作用。NRF2能调控200多个基因的表达，发挥重要的抗氧化作用。许多研究表明NRF2能在心、肝、肺、肾、脑等多种脏器I/R中减轻氧化应激引起的损伤。在静息状态下，细胞质中的NRF2通过其蛋白序列上的ETGE基序与KEAP1-Clu3E3泛素连接酶复合体结合，随后NRF2被泛素化并降解，无法发挥抗氧化的功能。因此强有效的NRF2特异性激活剂，可以预防和治疗包括但不限于肝脏的多种器官缺血再灌注损伤。

此外，氧化应激反应通过激活一系列信号通路参与细胞凋亡、炎症反应或细胞功能的改变等，参与机体多种疾病病理性改变，如癌症、衰老、心脏病、关节炎、糖尿病、阿兹海默症、帕金森病及多种口腔疾病等。因此寻找强有效的NRF2特异性激活剂，是预防和治疗氧化应激引起的多种疾病的重要策略。

发明内容：

(一)解决的技术问题

针对上述背景，本发明提出一种ETGE多肽在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中的应用，通过靶向NRF2的ETGE基序开发出ETGE多肽，可用于预防或治疗包括但不限于肝脏的多种器官的缺血再灌注损伤，此外也可用于预防和治疗氧化应激引起的多种疾病。

(二)技术方案

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种ETGE多肽在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中的应用，所述ETGE多肽氨基酸序列为FITC-C6-Ala-Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Thr-Gly-Glu，所述药物用于预防或治疗包括但不限于肝脏的多器官缺血再灌注损伤。

进一步地，所述ETGE多肽的合成方法如下：

S1，合成树脂，根据合成多肽的摩尔数称取树脂放入反应器中，加入3-5倍体积的N,N-二甲基甲酰胺，浸胀30分钟；

S2，脱保护及洗涤，将树脂中的Fmoc保护基脱去，使其露出活泼的NH2基，并洗涤；

S3，脱保护后进行茚三铜检测反应，树脂显示出的颜色和连接时有明显区别，则说明脱保护反应进行完全；

S4，连接，下一个氨基酸的羧基被活化剂所活化，活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键；

S5，连接后的NT检测，检测连接完全后的树脂颜色，判断是否连接完全；

S6，重复步骤S1-S5，直到一条肽链完成；

S7，将多肽从树脂上洗脱下来，其保护基团被脱保护剂洗脱和脱保护。

S8，应用反相HPLC色谱法，根据不同多肽分子的疏水性差异将其分离，纯化序列为FITC-C6-Ala-Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Thr-Gly-Glu的ETGE多肽及序列为FITC-C6-Pro-Glu-Ala-Pro-Ala-Thr-Glu-Glu-Gly的Scramble多肽，即乱序重排多肽，使纯度超过95％。

进一步地，所述ETGE多肽作为激活剂激活NRF2抗氧化通路，减轻氧化应激及其引起器官缺血再灌注损伤。

进一步地，所述药物由所述ETGE多肽和药学上可接受的药用辅料制成药学上可接受的剂型。

进一步地，所述药用辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂、表面活性剂、吸收促进剂和润滑剂中的一种或几种。

进一步地，所述剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或注射剂。

进一步地，所述ETGE多肽还可用于制备治疗由氧化应激水平升高引起的癌症、衰老、心脏病、关节炎、糖尿病、阿兹海默症、帕金森病及多种口腔疾病的药物。

(三)有益效果

本发明产生的有益效果是：通过靶向NRF2的ETGE基序开发出一种ETGE多肽，使其作为强有效的NRF2特异性激活剂，将该ETGE多肽应用在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中，为预防和治疗包括但不限于肝脏的多种器官缺血再灌注损伤提供了新的治疗策略，另外，该ETGE多肽还可用于预防和治疗氧化应激水平升高引起的癌症、衰老、心脏病、关节炎糖尿病等疾病以及神经退化性疾病如阿兹海默症、帕金森病及多种口腔疾病，应用范围广。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为多肽HPLC纯化结果图，图A为Scramble多肽，图B为ETGE多肽；

图2为多肽质谱鉴定结果图，图A为Scramble多肽，图B为ETGE多肽；

图3为抗氧化效果检测图，图A为western blot实验检测NRF2及其下游抗氧化蛋白水平结果图，图B为流式检测活性氧ROS结果图；

图4为竞争性IP实验检测与KEAP1-HA相互作用的NRF2-Myc的蛋白量结果图；

图5为NRF2-Myc的泛素化水平检测结果图；

图6为流式细胞术检测LO2肝细胞凋亡情况检测结果图，其中图A为ETGE多肽对缺氧复氧诱导LO2肝细胞凋亡的影响，图B为图A的统计图；

图7为ETGE多肽减轻小鼠肝脏缺血再灌注(I/R)模型引起的肝脏损伤结果图，其中图A为ETGE多肽治疗方案的示意图，图B为血清ALT检测图，图C为血清AST检测图；

图8为小鼠肝脏切片的组织结构检测图，其中图A为HE染色，图B为图A中坏死区域面积统计图；

图9为小鼠肝脏切片的细胞凋亡检测图，其中图A为TUNEL染色，图B为图A中TUNEL阳性细胞统计图；

图10为小鼠血清炎症因子检测结果图，其中图A为ETGE多肽对小鼠I/R后血液中IL-6的影响，图B为ETGE多肽对MCP1的影响，图C为ETGE多肽对IFN-γ的影响，图D为ETGE多肽对TNF的影响，图E为ETGE多肽对IL-12p70的影响；

图11为小鼠肝脏组织中NRF2及下游抗氧化蛋白表达量检测图；

图12为心肌细胞和肾细胞中NRF2及下游抗氧化蛋白表达量检测图，其中图A为ETGE多肽对H9C2心肌细胞蛋白表达的影响，图B为ETGE多肽对HK-2肾细胞蛋白表达的影响；

图13为心肌细胞和肾细胞凋亡情况检测图，其中图A为ETGE多肽对缺氧复氧诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响，图B为图A的统计图，图C为ETGE多肽对缺氧复氧诱导HK-2肾细胞凋亡的影响，图D为图C的统计图。

具体实施方式：

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

一种ETGE多肽在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中的应用，所述ETGE多肽氨基酸序列为FITC-C6-Ala-Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Thr-Gly-Glu，所述药物用于预防或治疗包括但不限于肝脏的多器官缺血再灌注损伤。

所述ETGE多肽作为激活剂激活NRF2抗氧化通路，以减轻氧化应激引起器官缺血再灌注损伤。

所述药物由所述ETGE多肽和药学上可接受的药用辅料制成药学上可接受的剂型。

所述药用辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂、表面活性剂、吸收促进剂和润滑剂中的一种或几种。

所述剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或注射剂。

所述ETGE多肽还可用于制备治疗氧化应激水平升高引起的癌症、心脏病、骨关节炎、风湿性关节炎、糖尿病、阿兹海默症、帕金森病及多种口腔疾病的药物。

一、ETGE多肽合成方法

S1，合成树脂，根据合成多肽的摩尔数称取树脂放入反应器中，加入3-5倍体积的N,N-二甲基甲酰胺，浸胀30分钟；

S2，脱保护及洗涤，将树脂中的Fmoc保护基脱去，使其露出活泼的NH2基，并洗涤；

S3，脱保护后进行茚三铜检测反应，树脂显示出的颜色和连接时有明显区别，则说明脱保护反应进行完全；

S4，连接，下一个氨基酸的羧基被活化剂所活化，活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键；

S5，连接后的NT检测，检测连接完全后的树脂颜色，判断是否连接完全；

S6，重复步骤S1-S5，直到一条肽链完成；

S7，将多肽从树脂上洗脱下来，其保护基团被脱保护剂洗脱和脱保护；

S8，应用反相HPLC色谱法，根据不同多肽分子的疏水性差异将其分离，纯化序列为FITC-C6-Ala-Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Thr-Gly-Glu的ETGE多肽及序列为FITC-C6-Pro-Glu-Ala-Pro-Ala-Thr-Glu-Glu-Gly的Scramble多肽，即乱序重排多肽，使纯度超过95％。

合成后的多肽的表征：HPLC纯化结果如图1，质谱鉴定结果如图2。

二、ETGE多肽在细胞水平减轻氧化应激的实验

1、ETGE多肽增加NRF2及下游抗氧化蛋白表达量实验

实验分组：ETGE多肽：0、15、20、25、30、35μg/ml(各组用Scramble多肽补齐总量)

将对数期的LO2肝细胞接种于12孔板，12小时后分别加入对应的多肽，6小时后更换培养基再加一次多肽。收集细胞提取细胞总蛋白，进行western blot实验检测NRF2及其下游抗氧化蛋白水平，如图3中A所示。上述结果表明，ETGE多肽以浓度依赖的方式增加NRF2及其下游抗氧化蛋白表达量。

2、ETGE多肽抑制活性氧ROS产生的实验

将对数期的LO2肝细胞接种于6孔板，12小时后进行缺氧。将细胞培养基更换成无血清无糖培养基且分别加入浓度为20μg/ml的Scramble多肽和ETGE多肽，并置于缺氧培养箱(1％氧分压)中缺氧培养6小时后，更换成正常培养基且再加一次多肽，并置于正常培养箱(20％氧分压)中复氧培养1小时。在孔板中用PBS漂洗细胞2次，加荧光探针CM-H2DCFDA(浓度为1mol/ml)，37℃避光孵育30min。收集细胞，用PBS洗2次，用200目滤网过滤至流式管中，1小时内上机检测。

使用BECKMAN公司的cytoflex流式细胞仪检测ROS，使用CytExpert软件以FSC为横轴以SSC为纵轴寻找并选取细胞主群体。再以FITC为横轴，记录细胞主群体荧光强度，用FlowJo软件进行分析数据，如图3中B所示。上述结果表明，在缺氧条件下，ETGE多肽能够减少ROS水平。

3、ETGE多肽抑制NRF2与KEAP1的结合实验

实验分组：第一组：KEAP1-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽0μg/ml

第二组：KEAP1-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽15μg/ml

第三组：KEAP1-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽20μg/ml

第四组：KEAP1-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽25μg/ml

(各组用Scramble多肽补齐总量)

将对数期的293T细胞接种于6cm皿，12小时后按分组所示进行质粒转染，12小时后更换新鲜培养基，12小时后按分组所示加入对应多肽，6小时后更换培养基再加一次多肽同时加入10μM MG132，6小时后收集细胞进行竞争性IP实验。收集细胞沉淀用600μl IPbuffer重悬细胞，置于冰上裂解15分钟，冰上超声(4s/1s，25％，1min)，再置于冰上裂解15分钟。随后4℃12000rpm离心15分钟。取上清，取60μl作为input，取剩余上清液加入60μlbeads和1μl HA抗体，置于4℃风车旋转孵育过夜。随后4℃1000rpm离心1分钟，弃上清，加入1ml IP buffer洗beads 3次。最后一次4℃1000rpm离心1分钟，弃上清，向beads中加入上样缓冲液loading buffer 75μl，作为IP。将input和IP样品进行western blot实验检测与KEAP1-HA相互作用的NRF2-Myc的蛋白量，如图4。上述结果表明，ETGE多肽以浓度依赖的方式减少NRF2与KEAP1的相互作用。

4、ETGE多肽降低NRF2的泛素化实验

实验分组：第一组：Ub-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽0μg/ml

第二组：Ub-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽15μg/ml

第三组：Ub-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽20μg/ml

第四组：Ub-HA 1μg+NRF2-Myc 4μg+ETEG多肽25μg/ml

(各组用Scramble多肽补齐总量)

将对数期的293T细胞接种于6cm皿，12小时后按分组所示进行质粒转染，12小时后更换新鲜培养基，12小时后按分组所示加入对应多肽，6小时后更换培养基再加一次多肽同时加入10μM MG132，6小时后收集细胞进行泛素化实验。收集细胞沉淀用50μl IP buffer重悬细胞，加入6μl 10％SDS混匀，95℃加热变性30分钟。随后加入500μl IP buffer置于冰上超声(4s/1s，25％，1min)。随后4℃12000rpm离心15分钟。取上清，取60μl作为input，取剩余上清液加入60μl beads和1μl Myc抗体，置于4℃风车旋转孵育过夜。随后4℃1000rpm离心1分钟，弃上清，加入1ml IP buffer洗beads 3次。最后一次4℃1000rpm离心1分钟，弃上清，向beads中加入上样缓冲液loading buffer 75μl，作为IP。将input和IP样品进行westernblot实验检测NRF2-Myc的泛素化水平，如图5。上述结果表明，ETGE多肽以浓度依赖的方式减少NRF2的泛素化。

综上，ETGE多肽和NRF2竞争与KEAP1的结合，减少NRF2与KEAP1的结合，从而减少KEAP1对NRF2的泛素化和降解，从而激活NRF2及其下游抗氧化蛋白的表达，从而减轻氧化应激水平。

三、ETGE多肽减轻缺氧复氧(H/R)引起的肝细胞凋亡实验

1、LO2肝细胞缺氧复氧(H/R)模型构建

实验分组：第一组：LO2细胞+ETGE多肽0μg/ml+常氧(n＝3)

第二组：LO2细胞+ETGE多肽15μg/ml+常氧(n＝3)

第三组：LO2细胞+ETGE多肽20μg/ml+常氧(n＝3)

第四组：LO2细胞+ETGE多肽0μg/ml+H/R(n＝3)

第五组：LO2细胞+ETGE多肽15μg/ml+H/R(n＝3)

第六组：LO2细胞+ETGE多肽20μg/ml+H/R(n＝3)

(各组用Scramble多肽补齐总量)

将对数期的LO2细胞接种于6孔板，4×10

2、肝细胞凋亡检测

使用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD，559763)对上述各组细胞进行染色，检测肝细胞凋亡情况。

a)收集细胞培养基，用PBS洗涤一次。

b)用胰酶消化细胞，用培养基终止消化，并和之前的培养基收集在一起。

c)1000g离心5分钟，弃掉上清，用PBS洗涤一次。

d)用1x binding buffer重悬细胞，1000g离心5分钟，弃掉上清。

e)用100μl binding buffer重悬细胞，加入3μl PE和7AAD染料，室温静置15-30分钟。

f)向每管细胞中加入400μl binding buffer重悬细胞，用200目滤网过滤至流式管中，1小时内上机检测。

使用BECKMAN公司的cytoflex流式细胞仪检测细胞凋亡，使用CytExpert软件以FSC为横轴以SSC为纵轴寻找并选取细胞主群体。再以PC5.5为横轴，PE为纵轴，记录细胞主群体荧光强度并分析数据，如图6。其中图A为ETGE多肽对缺氧复氧诱导LO2肝细胞凋亡的影响，图B为图A的统计图。

上述结果表明ETGE多肽能够减轻H/R引起的肝细胞凋亡，并且，在一定范围内ETGE多肽浓度越高效果越好。

四、ETGE多肽减轻缺血再灌注(I/R)引起的肝脏损伤实验

1、小鼠肝脏I/R模型构建

实验分组：第一组：sham+ETGE多肽0mg/kg(n＝6)

第二组：sham+ETGE多肽5mg/kg(n＝6)

第三组：sham+ETGE多肽10mg/kg(n＝6)

第四组：sham+ETGE多肽15mg/kg(n＝6)

第五组：I/R+ETGE多肽0mg/kg(n＝6)

第六组：I/R+ETGE多肽5mg/kg(n＝6)

第七组：I/R+ETGE多肽10mg/kg(n＝11)

第八组：I/R+ETGE多肽15mg/kg(n＝12)

(各组用Scramble多肽补齐总量)

在层流手术间，1％戊巴比妥钠溶液(60mg/kg体重)腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠固定在清洁手术台上，腹部正中上1/3经腹白线进腹，充分显露肝门区，分离支配肝脏的门静脉及肝动脉，置无创血管夹阻断血流，补生理盐水0.5mL，覆盖温润纱布暂时封闭腹腔，置于恒温箱中。60分钟后再次开腹，取血管夹，恢复小鼠肝脏血供，缝合关闭腹腔，置于恒温箱中，作为I/R组。模型采用缺血1小时，再灌注6小时的方案。sham组同样完成开关腹手术，并置于恒温箱中，但不进行血管夹置入。在缺血前11、前7、前3小时和再灌注时，将多肽通过尾静脉注射方式给药。I/R结束后再次开腹，心尖取血，收集血清，分装保存于-80℃冰箱。分别取黄豆大小缺血叶肝脏组织分装迅速置于液氮中，然后保存于-80℃冰箱备用。再取黄豆大小缺血叶肝脏组织用4％多聚甲醛于4℃固定12小时，然后进行石蜡包埋切片。sham组则取等量相同部位肝脏组织做相同处理。ETGE多肽治疗方案如图7A。

2、肝功能检测：血清ALT和AST检测

分别使用ALT试剂盒(南京建成，C009-2-1)和AST试剂盒(南京建成，C010-2-1)检测上述各组小鼠血清中ALT和ASL的含量。使用96孔板，在测定孔中加入20μl基质液，加入5μl血清；对照孔中加入20μl基质液，混匀，于37℃静置30分钟。随后，在测定孔中加入20μl苯肼；对照孔中加入20μl苯肼，加入5μl血清，混匀，于37℃静置20分钟。随后加入200μl 4MNaOH溶液，混匀，室温静置15分钟。最后用酶标仪检测510nm处的吸光值，根据标准曲线计算出血清中ALT或AST的含量。结果如图7所示，其中图B为血清ALT检测图，图C为血清AST检测图。上述结果表明ETGE多肽能够减轻I/R引起的肝损伤，并且，在一定范围内ETGE多肽浓度越高效果越好。

3、肝脏组织学检测

肝脏组织石蜡包埋

a)固定：将新鲜肝脏组织固定于4％多聚甲醛12-24小时。

b)脱水：将肝脏组织从固定液中取出放于脱水盒内，将脱水盒放进吊篮里于脱水机中依次在梯度酒精中进行脱水。75％酒精4小时-85％酒精2小时-90％酒精2小时-95％酒精1小时-无水乙醇I30分钟-无水乙醇II30分钟-醇苯5～10分钟-二甲苯I5～10分钟-二甲苯II5～10分钟-蜡I1小时-蜡II1小时-蜡III1小时。

c)包埋：将浸好蜡的肝脏组织在包埋机中进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前放好组织并贴上标签，在-20℃冻台冷却，待蜡凝固后将蜡块取出并修整。

d)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。将切片在40℃温水上展平，用载玻片捞起，放入60℃烘箱内烤片，待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

肝脏切片HE染色

a)石蜡切片脱蜡：将肝脏组织切片放入吊篮中依次在梯度酒精中进行脱蜡。二甲苯I10分钟-二甲苯II10分钟-无水乙醇I5分钟-无水乙醇II5分钟-95％酒精5分钟-90％酒精5分钟-80％酒精5分钟-70％酒精5分钟-蒸馏水。

b)苏木素染细胞核：将切片放入苏木素中染3-8分钟，自来水洗，1％盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，自来水冲洗。

c)伊红染细胞质：将切片放入伊红染液中染1～3分钟。

d)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I5分钟-95％酒精II5分钟-无水乙醇I5分钟-无水乙醇II5分钟-二甲苯I5分钟-二甲苯II5分钟中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树脂封片。

在显微镜下观察各组肝脏切片的组织结构，如图8。上述结果表明ETGE多肽能够减轻I/R引起的肝脏组织坏死，并且，在一定范围内ETGE多肽浓度越高效果越好。

4、肝脏细胞凋亡检测

使用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)(碧云天，C1090)对肝脏组织石蜡切片进行染色，检测肝细胞凋亡情况。

a)石蜡切片脱蜡：将肝脏组织切片放入吊篮中依次在梯度酒精中进行脱蜡。二甲苯I10分钟-二甲苯II10分钟-无水乙醇I5分钟-无水乙醇II5分钟-95％酒精5分钟-90％酒精5分钟-80％酒精5分钟-70％酒精5分钟-蒸馏水。

b)滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20～37℃作用15～30分钟，用PBS洗涤三次。

c)加入0.3％过氧化氢的PBS，室温孵育20分钟，用PBS洗涤三次。

d)在样品上加入50μl TUNEL检测液(5μl TdT酶+45μl荧光标记液)，37℃避光孵育1小时，用PBS洗涤三次。

e)用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。Cy3的激发波长为550nm，发射波长为570nm(红色荧光)。

在显微镜下观察各组肝组织的染色情况，如图9。上述结果表明ETGE多肽能够减轻I/R引起的肝脏组织中的细胞凋亡，并且，在一定范围内ETGE多肽浓度越高效果越好。

5、血清炎症因子检测

使用Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Inflammation Kit(BD,552364)试剂盒检测各组小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-12p70的含量。

a)制备细胞因子标准品：将一瓶冻干的细胞因子标准品小球转移至15ml离心管中，用2ml Assay Diluent溶解小球，室温平衡至少15分钟，标记为最高浓度标准品(5000pg/ml)。将最高浓度标准品进行1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256等比稀释。最后取一管加入Assay Diluent作为阴性指控管(0pg/ml)。

b)混合微球：确定样本数，例如8个待测样本，9个标准品，1个阴性对照，共计18管。充分混匀每种捕获微球，涡旋5-15秒。按照7μl/样品吸取每种捕获微球，例如样本数为18，则每种细胞因子捕获微球的量为126μl，将所有微球混合于一支流式管中，充分涡旋混匀。

c)样本孵育：向每个流式管中加入40μl混合微球和50μl标准品或待测样品，避光孵育3小时。

上机检测：每管加入1ml洗液清洗样本，200g离心5分钟。小心弃上清，每管加入300μl洗液重悬细胞。使用BECKMAN公司的cytoflex流式细胞仪检测各种炎症因子含量，使用CytExpert软件以FSC为横轴以SSC为纵轴寻找并选取细胞主群体。再以PE为横轴，APC为纵轴，记录细胞主群体荧光强度，用FCAP Array v1.0进行标准曲线绘制和数据分析，如图10。其中图A为ETGE多肽对小鼠I/R后血液中IL-6的影响，图B为ETGE多肽对MCP1的影响，图C为ETGE多肽对IFN-γ的影响，图D为ETGE多肽对TNF的影响，图E为ETGE多肽对IL-12p70的影响。上述结果表明ETGE多肽能够减轻I/R引起的炎症反应，并且，在一定范围内ETGE多肽浓度越高效果越好。

6、NRF2及下游基因的蛋白表达量检测

通过western blot实验检测上述各组小鼠肝脏组织中NRF2及下游抗氧化蛋白表达量，如图11。上述结果表明ETGE多肽能增加小鼠肝脏内NRF2及其下游抗氧化蛋白表达量，并且，在一定范围内ETGE多肽浓度越高效果越好。

综上，ETGE多肽通过激活NRF2减轻小鼠肝脏I/R引起的肝损伤、肝细胞凋亡、炎症反应，并且，在一定范围内ETGE多肽浓度越高治疗效果越好。

五、ETGE多肽减轻缺氧复氧(H/R)引起的心肌细胞和肾细胞的凋亡实验

1、ETGE多肽对H9C2心肌细胞和HK-2肾细胞的NRF2及下游抗氧化蛋白的影响

H9C2细胞分组：ETGE多肽：0、15、20、25μg/ml(各组用Scramble多肽补齐总量)

HK-2细胞分组：ETGE多肽：0、15、20、25μg/ml(各组用Scramble多肽补齐总量)

通过western blot实验检测上述各组细胞中NRF2及下游抗氧化蛋白表达量，如图12，其中图A为ETGE多肽对H9C2心肌细胞蛋白表达的影响，图B为ETGE多肽对HK-2肾细胞蛋白表达的影响。上述结果表明ETGE多肽能增加心肌细胞和肾细胞中NRF2及其下游基因的蛋白表达量。

2、H9C2心肌细胞和HK-2肾细胞缺氧复氧(H/R)模型构建

H9C2细胞分组：第一组：H9C2细胞+ETGE多肽0μg/ml+常氧(n＝3)

第二组：H9C2细胞+ETGE多肽15μg/ml+常氧(n＝3)

第三组：H9C2细胞+ETGE多肽20μg/ml+常氧(n＝3)

第三组：H9C2细胞+ETGE多肽0μg/ml+H/R(n＝3)

第四组：H9C2细胞+ETGE多肽15μg/ml+H/R(n＝3)

第四组：H9C2细胞+ETGE多肽20μg/ml+H/R(n＝3)

(各组用Scramble多肽补齐总量)

HK-2细胞分组：第一组：HK-2细胞+ETGE多肽0μg/ml+常氧(n＝3)

第二组：HK-2细胞+ETGE多肽15μg/ml+常氧(n＝3)

第三组：HK-2细胞+ETGE多肽20μg/ml+常氧(n＝3)

第四组：HK-2细胞+ETGE多肽0μg/ml+H/R(n＝3)

第五组：HK-2细胞+ETGE多肽15μg/ml+H/R(n＝3)

第六组：HK-2细胞+ETGE多肽20μg/ml+H/R(n＝3)

(各组用Scramble多肽补齐总量)

使用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD，559763)对上述各组细胞进行染色，检测方法同上，检测心肌细胞和肾细胞凋亡情况，如图13。其中图A为ETGE多肽对缺氧复氧诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响，图B为图A的统计图，图C为ETGE多肽对缺氧复氧诱导HK-2肾细胞凋亡的影响，图D为图C的统计图。上述结果表明，ETGE多肽能够减轻H/R引起的心肌细胞和肾细胞凋亡。

综上所述，本发明提出一种ETGE多肽在制备治疗多器官缺血再灌注损伤药物中的应用，通过靶向NRF2的ETGE基序开发出ETGE多肽，可用于预防或治疗包括但不限于肝脏的多种器官的缺血再灌注损伤，也可用于预防和治疗氧化应激引起的多种疾病。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。