法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-07-01
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于医学和药学领域，尤其涉及小分子多肽和老年痴呆学习记忆障碍的改善和治疗，具体涉及一种小分子多肽TAT-siP-Add1及其在制备治疗用于改善老年痴呆学习记忆障碍药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)也称老年痴呆，已成为全球范围内威胁老年人健康的一大杀手，是仅次于心血管病之后威胁老年人生命健康的高发疾病。AD患者在日常生活中会表现出记忆减退、视空间机能损害甚至性情和行为巨变。随着患者病情的不断加重，病人会逐渐失去日常生活的自理能力，这不仅给社会和家庭带来沉重的经济负担，而且还会对病人及其身边亲人的情绪和心理造成莫大的影响。因此，在人口老年化问题日益突出的现在，加强对AD的病理基础研究和药物开发愈发急迫。
AD最典型的临床病理学特征是患者死后大脑尸检中发现的老年斑和神经纤维缠结，此外还会伴有大量的神经元丢失、海马和皮质的萎缩等。基于老年斑和神经纤维缠结这两个病理学特征，提出了淀粉样蛋白级联假说和Tau蛋白过磷酸化假说，且已在实验室中进行了大量研究，并有相应的药物进行了临床试验，但遗憾的是迄今为止，尚没有明确的药物能有效延缓或治疗AD。最近不断有报道指出在AD早期就已经开始出现了进行性认知功能和记忆力减退，而此时往往还没有出现老年斑和神经纤维缠结。因此对AD早期的病理变化机制的深入研究可能会为AD的治疗和早期诊断带来新的突破。
神经突触是神经元之间在功能上产生相互联系的部位，也是神经元信息传递和交流的关键之处。突触是大脑中的基本单位，突触活动可以刺激蘑菇状树突棘的成熟并形成新的突触，使突触强度能够适应内外环境的变化，进而在学习和记忆中发挥重要作用。突触丢失和功能障碍意味着突触在信息的存储、加工和传输等方面受到影响，进而导致整个神经环路和网络中信息流的中断，并表现为神经功能紊乱或者痴呆。已有研究指出在AD脑中，特别是在早期阶段，就已经能够发现突触活动中断和突触丢失。多项研究表明与老年斑和神经纤维缠结相比，以突触丢失和突触活性降低为特征的突触障碍与AD的认知障碍之间具有更高的相关性。因此，针对AD中突触障碍的治疗策略已是当前的一大方向。
TAT细胞穿膜多肽(cell penetrating peptides)，是近年来发现的一种高效运输载体。TAT能够穿透细胞膜、细胞核膜，携带多肽、蛋白质以及DNA分子等通过受体转运方式进入胞质和胞核发挥相应的生物效应。目前研究显示HIV-TAT，能够穿过所有组织细胞，且无明显的毒副作用。TAT能将与之相连的多肽在数分钟内带入细胞，而且可以跨越血脑屏障进入神经元内，被带入细胞的多肽则保留了它们原有的生物活性，从而发挥生物学作用。
发明内容
本发明的任务是提供一种小分子多肽，使其具有改善老年痴呆学习记忆障碍之作用，能用于制备治疗老年痴呆的药物。
本发明提供的小分子多肽为TAT-siP-Add1，其序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，序列如下：YGRKKRRQRRRKKKKFRTPSFLKKSKKK。
TAT-siP-Add1的对照为TAT-scramble，其序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，序列如下：YGRKKRRQRRRRPKKTKFFKKSKKLKKS。
TAT-siP-Add1多肽和对照TAT-scramble多肽由本专利申请的发明人通过委托强耀生物科技有限公司合成制备。
基于申请人最近的研究与TAT技术，申请人合成了一个由与Add1蛋白竞争性结合Rock2激酶的氨基酸序列组成的膜渗透性小分子多肽TAT-siP-Add1，通过运用到在体的AD小鼠模型上，有效地阻断Add1与Rock2的结合，使得Add1的磷酸化水平下降，增强肌动蛋白骨架的稳定性，从而改善AD小鼠的突触损伤和学习记忆障碍，为改善AD的症状提供了方法。本发明将TAT穿膜肽(YGRKKRRQRRR)与siP-Add1(KKKKFRTPSFLKKSKKK)连接，得到具有生物活性的TAT-siP-Add1多肽(SEQ ID NO.1:YGRKKRRQRRRKKKKFRTPSFLKKSKKK)。利用TAT的穿膜功能将siP-Add1多肽输送进入血液穿过血脑屏障，并被大脑神经细胞摄取从而发挥其生物学功能。
本发明的另一个目的在于提供了一种小分子多肽TAT-siP-Add1在改善老年痴呆学习记忆障碍中的应用，将其通过腹腔注射，发现其可有效阻断Add1与Rock2的结合，使得Add1的磷酸化下降，增强肌动蛋白骨架的稳定性，从而改善AD小鼠的突触损伤和学习记忆障碍，为改善AD的症状提供了方法。
本专利申请的发明人发现，减少Add1和Rock2激酶相互结合，可以明显提高AD小鼠的学习记忆。针对这一发现，发明人将TAT穿膜肽(YGRKKRRQRRR)与siP-Add1(KKKKFRTPSFLKKSKKK)连接，得到具有生物活性的TAT-siP-Add1多肽，通过在体腹腔注射方式，使TAT-siP-Add1多肽进入血液穿过血脑屏障并被大脑神经细胞摄取发挥其生物学功能。
小分子多肽TAT-siP-Add1在改善老年痴呆学习记忆障碍中的应用，其应用过程如下：
APP/PS1转基因小鼠是目前最常用的AD模型小鼠之一。APP/PS1小鼠在9月龄之后开始出现认知障碍，而在此之前会发生突触丢失。我们选取体重相近的8月龄APP/PS1和C57小鼠，随机分为两组，其中实验组的小鼠腹腔注射给予15mg/kg TAT-siP-Add1多肽溶液，对照组小鼠给予15mg/kg TAT-scramble多肽溶液，C57小鼠腹腔注射给予相同体积的注射用生理盐水，连续注射14天，溶液均由多肽粉末用生理盐水按指定浓度进行稀释配置，现配现用。随后进行Morris水迷宫实验，发现注射了TAT-scramble对照溶液的APP/PS1小鼠的学习记忆能力低于C57小鼠，而注射了TAT-siP-Add1多肽溶液的小鼠学习记忆能力与C57小鼠相近。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：(1)本发明所涉及的小分子多肽TAT-siP-Add1纯度高，完全可溶，适合静脉注射，无毒副作用。(2)本发明公开的TAT-siP-Add1多肽，TAT可以携带siP-Add1蛋白多肽经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，可以转化应用于神经系统，调控突触功能，使其具有实际操作的可行性。(3)本发明小分子多肽TAT-siP-Add1能改善老年痴呆的学习记忆障碍，能用于制备治疗或预防老年痴的药物。具体结合药学上可接受的赋形剂或/和载体可制备用于改善低老年痴呆学习记忆障碍的药物制剂。
附图说明
缩写说明
图1为一种小分子多肽TAT-siP-Add1的人工合成MS分析图。
图2为AD患者中Rock2和Add1磷酸化水平异常，其中：图2A为AD患者和正常人脑组织免疫印迹图。将脑组织样本用预冷至0-4℃PBS(phosphate buffer saline PH 7.4)迅速冲洗后，加入RIPA强裂解液于冰上匀浆，提取组织总蛋白，测定蛋白含量后备用。分别检测脑组织中Rock2、Add1-S726、Add1和Actin蛋白的表达量。其中Actin为内参条带，证明蛋白上样量的一致性。通过比较发现，AD患者脑中Rock2和磷酸化的Add1(Add1-S726)的含量明显高于对照组，而Add1没有改变。图2B为统计图。图2C为相关性分析图，说明Rock2与Add1-S726的磷酸化之间有较强的相关性。
图3在Neuro2a细胞中Rock2促进Add1-S72位点的磷酸化的免疫印记图，其中：图3A为在Neuro2a细胞中转染过表达Rock2或者对照的空载质粒，48小时后，收集细胞，并使用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，测定蛋白含量后备用。分别检测裂解样本中Rock2、Add1-S726、Add1和Actin蛋白的表达量。通过比较发现，过表达Rock2的实验组中Rock2的含量明显高于对照组，说明质粒过表达成功，同时实验组中Add1-S726的磷酸化水平也显著高于对照组，说明Rock2确实能促进Add1-S726位点的磷酸化，而Add1没有改变。图3B为统计图。
图4为TAT-siP-Add1多肽在同时共转Rock2和Add1过表达质粒的HEK293T细胞中抑制Add1-S726磷酸化的免疫印记图，其中：图4A为TAT-siP-Add1多肽和对照多肽TAT-scramble的序列设计图。图4B为在HEK293T细胞中转染过表达Rock2和Add1的质粒，48小时后，在细胞培养基中给与0-20μM不同浓度的TAT-siP-Add1和TAT-scramble多肽处理3小时，随后收集细胞，并使用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，测定蛋白含量后备用。分别检测裂解样本中Add1-S726、Add1和Actin蛋白的表达量。通过比较发现，给与不同浓度TAT-scramble多肽处理的对照组中，Add1和Add1-S726位点的磷酸化水平均没有明显的变化，而在给予TAT-siP-Add1的实验组中，从5μM浓度开始，Add1-S726的磷酸化水平就出现轻微下降，但尚无统计学差异，在10-20μM浓度时，Add1-S726的磷酸化水平显著降低，并且在15μM浓度时下降最为明显，说明TAT-siP-Add1确实能拮抗Rock2对Add1-S726位点的磷酸化促进作用。图4C为统计图。
图5为TAT-siP-Add1多肽在APP/PS1小鼠中抑制Add1-S726磷酸化的免疫印记图，其中：图5A为实验流程图。将体重、月龄相近的APP/PS1小鼠随机分为两组，在适应期后，对实验组每天通过腹腔注射的方式以15mg/kg的浓度注射TAT-siP-Add1溶液，对照组以相同方式和浓度注射TAT-scramble溶液，连续注射两周，6天后对小鼠进行麻醉，快速断头取出脑组织置于0-4℃PBS内，使用镊子快速分离双侧海马，使用RIPA强裂解液匀浆提取海马总蛋白，测定蛋白含量后备用。图5B为注射TAT-siP-Add1和TAT-scramble多肽的两组小鼠海马组织免疫印迹图。分别检测海马组织中Add1-S726、Add1和Actin蛋白的表达量。通过比较发现，注射TAT-siP-Add1多肽的小鼠海马组织中Add1-S726的含量明显低于对照组，表明TAT-siP-Add1多肽在在体情况下也能有效拮抗Rock2对Add1-S726位点的磷酸化促进作用。图5C为统计图。
图6为TAT-siP-Add1多肽增加APP/PS1小鼠海马树突棘密度结果图，其中：图6A为实验流程图。选择体重、月龄相近的C57小鼠(WT)和APP/PS1小鼠(A/P)，随机分为三组，在适应期后，对APP/PS1小鼠每天通过腹腔注射的方式以15mg/kg的浓度注射TAT-siP-Add1或TAT-scramble溶液，WT小鼠以相同方式和剂量注射生理盐水，连续注射两周，之后进行空间记忆能力的行为学实验、高尔基染色和电生理检测等实验。图6B为三组小鼠高尔基染色展示海马树突棘密度图。三组小鼠麻醉后，剪开胸腔和隔膜，暴露心脏，使用预冷的生理盐水进行心脏灌流，直至小鼠肝脏变白，随后断头剥离出脑组织，将其切成小块，使用试剂盒进行高尔基染色实验，随后将脑组织切片，使用光学显微镜观察神经元树突棘形态，并统计数目。高尔基染色发现，与WT小鼠相比，注射TAT-scramble多肽的APP/PS1小鼠海马神经元树突棘密度显著减少，并且其中成熟的蘑菇型树突棘比例也大幅降低了一半；而与之相较，注射TAT-siP-Add1多肽的APP/PS1小鼠海马神经元树突棘密度明显增多，并且其中成熟的蘑菇型树突棘比例也有较高的提升。图6C为图6B中海马神经元树突棘密度的统计图。图6D为图6B中海马神经元蘑菇型树突棘所占百分比的统计图。
图7为TAT-siP-Add1多肽增加APP/PS1小鼠海马树突复杂性结果图，其中：图7A为图6中的三组小鼠高尔基染色展示海马神经元形态图。高尔基染色发现，与WT小鼠相比，注射TAT-scramble多肽的APP/PS1小鼠海马神经元树突数量和分支显著减少，树突复杂性降低；而与之相较，注射TAT-siP-Add1多肽的APP/PS1小鼠海马神经元树突数量和分支明显增多，树突复杂性升高，说明注射TAT-siP-Add1多肽能有效改善APP/PS1小鼠神经元的树突复杂性。图7B为图7A中海马神经元树突分支的sholl分析统计图。图7C为图7A中海马神经元树突分支的树突复杂性指数(Dendritic Complexity Index,DCI)统计图。
图8为TAT-siP-Add1多肽改善小鼠的电生理结果统计图，其中：图8A为LTP记录图。图6中的三组小鼠麻醉后断头，迅速取出脑组织放入冷冻的人工脑脊液(aCSF)中，根据实验需求小鼠脑组织修块，用振动切片机将组织切成300μm厚的组织片，室温孵育1h。选择合适的刺激和记录电极位置，稳定记录LTP(Long Term Potentiation)基线15-30分钟，随后使用间隔10s秒2串持续1秒的高频刺激(100Hz)进行诱导，并继续记录1小时。通过LTP电生理的记录发现，与WT小鼠相比，注射TAT-scramble多肽的APP/PS1小鼠海马神经元LTP诱导的幅度显著降低，仅能达到1.1倍；而注射TAT-siP-Add1多肽的APP/PS1小鼠海马神经元LTP诱导的幅度比TAT-scramble组的小鼠明显增强，能够达到1.4倍，说明注射TAT-siP-Add1多肽能有效改善APP/PS1小鼠神经元的LTP电生理活性。图8B为LTP结果统计图。
图9为TAT-siP-Add1多肽改善小鼠的学习记忆能力结果统计图：图6中的三组小鼠采用Morris水迷宫测试系统进行行为学实验。Morris水迷宫包括圆形水池直径120cm，高60cm；圆柱形有机玻璃平台直径10cm，高40cm。水池中水面高约45cm，室温及水温均保持在22±2℃，平台放置于某一象限的中心位置，并没于水面下约2cm。训练时将小鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，检测其潜伏期(即小鼠从入水起到找到平台所用的时间)、路径作为衡量小鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只小鼠每天在3个象限共训练3次，每次游泳时限为60s,即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为60s，由测试者引导其上台，休息20s后进行下一次训练。首先训练时间为6天，每天记录小鼠找到平台期所需时间，记录为小鼠找到平台所需潜伏期。休息一天后，去掉平台，计算60s内小鼠在目标象限的停留时间并分析其在平台所在位置的穿越次数，以评价其记忆能力。其中：图9A为三组小鼠在水迷宫实验第8天的运动轨迹图；图9B为三组小鼠水迷宫实验前6天训练阶段的潜伏期统计结果图。在第4-6天的学习阶段中，注射TAT-scramble多肽溶液的APP/PS1小鼠到达平台的潜伏期延长；而与之相比，给予TAT-siP-Add1多肽溶液注射的APP/PS1小鼠到达平台的潜伏期明显减小；图9C为三组小鼠水迷宫实验第8天检测阶段的潜伏期统计结果图。在第8天的检测中，注射TAT-scramble多肽溶液的APP/PS1小鼠到达平台的潜伏期延长；而与之相比，给予TAT-siP-Add1多肽溶液注射的APP/PS1小鼠到达平台的潜伏期明显减少；图9D为三组小鼠水迷宫实验第8天检测阶段的平台穿越次数统计结果图。在第8天的检测中，注射TAT-scramble多肽溶液的APP/PS1小鼠穿越平台的次数显著降低；而与之相比，给予TAT-siP-Add1多肽溶液注射的APP/PS1小鼠穿越平台的次数有明显的提高。说明注射TAT-siP-Add1多肽能有效改善APP/PS1小鼠的学习记忆功能。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：
实验材料
本发明通过随机选取小鼠进行腹腔注射TAT-siP-Add1溶液，可以阻断Add1与Rock2的结合，使得Add1的磷酸化下降，增强肌动蛋白骨架的稳定性，改善AD小鼠的突触损伤和学习记忆障碍。
具体操作步骤如下：
一、TAT-siP-Add1多肽在改善老年痴呆中的应用。
实验对象：雄性APP/PS1小鼠(购买自Jackson Laboratory)，C57/BL小鼠6-8月龄(购买自北京维通利华实验动物有限公司)，SPF级，体重20-25克，常规环境饲养。
研究方法：①小鼠空间记忆检测：腹腔注射及水迷宫；②定量小鼠海马相关蛋白含量：免疫印迹；③TAT-siP-Add1多肽拮抗Rock2磷酸化Add1的S726位点：免疫印迹；④小鼠海马LTP：电生理；⑤小鼠海马神经元树突树和树突棘检测：高尔基染色、sholl分析。
实验结果：见附图1至附图9，附图中标注的*和#的注释如下：
*P<0.05，与Con/WT组比较；
**P<0.01，与Con/WT组比较；
***P<0.001，与Con/WT组比较；
#P<0.05，与TAT-scramble(Scr)组比较；
##P<0.01，与TAT-scramble(Scr)组比较；
###P<0.001，与TAT-scramble(Scr)组比较。
TAT-siP-Add1的序列如SEQ ID NO:1所示，由江苏强耀生物科技有限公司人工合成，MS分析如图1所示，分析结果显示合成的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1一致。合成的TAT-siP-Add1多肽的纯度为98.67％，一支10mg，为白色粉末状，完全可以溶于水，密封避光保存于-20℃。使用前，用注射用生理盐水按指定浓度进行稀释配置，现配现用。TAT-scramble序列如SEQ ID NO.2所示，也为该公司合成。
AD病人中Rock2和Add1磷酸化水平异常：见图2。将AD患者和正常人脑组织样本用预冷至0-4℃PBS迅速冲洗后，加入RIPA强裂解液于冰上匀浆，提取组织总蛋白，进行蛋白的表达定量。我们发现，AD患者脑中Rock2和Add1-S726的含量明显高于对照组，并且两者之间有较强的相关性。
Neuro2a细胞中Rock2促进Add1-S72位点的磷酸化：见图3。在Neuro2a细胞中转染过表达Rock2或者对照的空载质粒，48小时后，收集细胞蛋白，进行蛋白的表达定量。免疫印记发现Rock2确实能促进Add1-S726位点的磷酸化。
TAT-siP-Add1多肽在HEK293T细胞中抑制Add1-S726磷酸化：见图4。在HEK293T细胞中转染过表达Rock2和Add1的质粒，48小时后，使用不同浓度的TAT-siP-Add1和TAT-scramble多肽处理3小时，随后收集细胞。免疫印记检测发现，15μM浓度的TAT-siP-Add1能有效拮抗Rock2对Add1-S726位点的磷酸化促进作用。而TAT-scramble多肽则没有这种效果。
TAT-siP-Add1多肽在APP/PS1小鼠中抑制Add1-S726磷酸化：见图5。将体重、月龄相近的APP/PS1小鼠随机分为两组，对两组小鼠每天通过腹腔注射的方式以15mg/kg的浓度注射TAT-siP-Add1或TAT-scramble多肽溶液，连续注射两周，6天后对小鼠麻醉断头，快速分离双侧海马，使用RIPA强裂解液匀浆提取海马总蛋白。免疫印迹表明TAT-siP-Add1多肽在在体情况下也能有效拮抗Rock2对Add1-S726位点的磷酸化促进作用。
TAT-siP-Add1多肽增加APP/PS1小鼠海马树突棘密度：见图6。选择体重、月龄相近的C57小鼠(WT)和APP/PS1小鼠(A/P)，随机分为三组，在适应期后，对APP/PS1小鼠每天通过腹腔注射的方式以15mg/kg的浓度注射TAT-siP-Add1或TAT-scramble溶液，WT小鼠以相同方式和剂量注射生理盐水，连续注射两周，之后进行高尔基染色。高尔基染色发现，注射TAT-scramble多肽的APP/PS1小鼠海马神经元树突棘密度和蘑菇型树突棘比例也大幅下降；而注射TAT-siP-Add1多肽的APP/PS1的小鼠能显著改善树突棘密度和蘑菇型树突棘比例的降低。
TAT-siP-Add1多肽增加APP/PS1小鼠海马树突复杂性：见图7。图6中的三组小鼠高尔基染色后对海马神经元形态进行分析。结果发现，注射TAT-scramble多肽的APP/PS1小鼠海马神经元树突复杂性降低；而与之相较，注射TAT-siP-Add1多肽的小鼠海马神经元树突复杂性显著提高，表明TAT-siP-Add1多肽能有效改善APP/PS1小鼠神经元的树突复杂性。
TAT-siP-Add1多肽改善小鼠的电生理：见图8。图6中的三组小鼠麻醉后断头，迅速取出脑组织放入冷冻的人工脑脊液(aCSF)中，用振动切片机切片。选择合适的刺激位置和刺激强度，稳定记录LTP(基线15-30分钟，随后使用高频刺激诱导，并继续记录1小时。通过LTP电生理的记录发现，注射TAT-siP-Add1多肽的APP/PS1小鼠海马神经元LTP诱导的幅度比TAT-scramble组的小鼠明显增强，说明注射TAT-siP-Add1多肽能有效改善APP/PS1小鼠神经元的LTP电生理活性。
小鼠的学习记忆能力：见图9。图6中的三组小鼠采用Morris水迷宫测试系统进行行为学实验。结果发现，在第4-6天的学习阶段中，注射TAT-scramble多肽溶液的APP/PS1小鼠到达平台的潜伏期延长；而与之相比，给予TAT-siP-Add1多肽溶液注射的小鼠到达平台的潜伏期明显减少。
在第8天的检测中，注射TAT-scramble多肽溶液的APP/PS1小鼠到达平台的潜伏期延长、穿越平台的次数降低，学习记忆能力差；而与之相比，给予TAT-siP-Add1多肽溶液注射的APP/PS1小鼠到达平台的潜伏期明显减少、穿越平台的次数有明显的提高，学习记忆能力增强。
以上结果表明，通过腹腔注射TAT-siP-Add1多肽溶液可以明显提高APP/PS1小鼠的神经元树突棘密度、树突复杂性、电生理。免疫印迹检测表明TAT-siP-Add1多肽可以明显抑制APP/PS1小鼠Add1-S726位点的磷酸化。而在Morris水迷宫中，注射TAT-siP-Add1多肽溶液的APP/PS1小鼠潜伏期明显缩短，穿越平台的次数明显增加，学习记忆能力增强。以上实验证明TAT-siP-Add1多肽可以通过拮抗Rock2对Add1-S726磷酸化的促进作用，使得神经元树突棘密度、树突复杂性增加，电生理增强，从而引起小鼠学习记忆的改善。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以下为本发明专利申请涉及的氨基酸序列的序列表，其中：序列1为本发明提供的小分子多肽TAT-siP-Add1；序列2为对照TAT-scramble多肽；序列3为TAT穿膜肽；序列4为siP-Add1多肽。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种多肽及其在改善老年痴呆学习记忆障碍中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Phe
1 5 10 15
Arg Thr Pro Ser Phe Leu Lys Lys Ser Lys Lys Lys
20 25
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Lys Thr
1 5 10 15
Lys Phe Phe Lys Lys Ser Lys Lys Leu Lys Lys Ser
20 25
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Lys Lys Lys Phe Arg Thr Pro Ser Phe Leu Lys Lys Ser Lys Lys
1 5 10 15
Lys
