一种许氏平鲉IL-6重组蛋白、可溶表达方法及应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种许氏平鲉IL‑6重组蛋白、可溶表达方法及应用，所述许氏平鲉IL‑6重组蛋白包括IL‑6成熟肽氨基酸序列、N端的促溶短肽以及C端6×组氨酸标签；优选地，所述IL‑6重组蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述IL‑6成熟肽氨基酸序列为SEQ ID NO：2，所述编码N端促溶短肽、IL‑6成熟肽氨基酸以及C端连接肽及His标签的DNA序列为SEQ ID NO：3。本发明首次构建了许氏平鲉IL‑6的原核表达载体pET‑IL6‑His，能够得到氨基酸序列与IL‑6成熟肽一致的许氏平鲉IL‑6重组蛋白，该许氏平鲉IL‑6重组蛋白能够用于许氏平鲉的催产育苗中。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种许氏平鲉IL-6重组蛋白、可溶表达方法及应用。

背景技术

目前，许氏平鲉(Sebastes schlegelii)隶属于鲉形目(Scorpaeniformes)、平鲉科(Sebastidae)、平鲉属(Sebastes)，是我国北方重要的冷温性经济鱼类之一。许氏平鲉繁殖方式为卵胎生，雌雄发育不同步，雄鱼于每年11月性成熟(雌鱼此时未熟)，雌雄鱼在11～12月完成交配，精子在雌鱼体内可储存4个月，并在次年3～4月雌鱼卵巢成熟，发生体内受精，胚胎在雌鱼体内发育大约1个月时长，于4月末至5月初分娩产出仔鱼。

卵胎生硬骨鱼的分娩属于典型的自发性炎症反应，白介素6(interleukin 6，IL-6)属于一种典型的炎症因子，在分娩中IL-6基因(il6)及其受体IL-6R基因(il6r)相对表达水平达到最高，并在分娩24h后显著下调(P＜0.05)。IL-6可通过直接通过JAK/STAT3细胞信号通路上调前列腺素合成酶COX2基因(ptgs2)的表达水平，提高前列腺素的水平，间接调控分娩进程。在许氏平鲉育苗中，雌鱼若状态不佳，容易发生难产而死亡。因此可通过注射IL-6蛋白促进分娩进程。与其他脊椎动物相同，许氏平鲉IL-6为经典的分泌蛋白，具有典型的N端信号肽序列。在细胞中，新生肽链的信号肽一旦合成就会被信号识别颗粒(SRP)识别并暂停翻译，SRP与肽链、核糖体三者一同停泊于粗面内质网表面，翻译得以继续进行。新生肽链一边合成一边进入内质网同时信号肽被切除。最终肽链经过内质网、高尔基体的折叠与加工，不含信号肽的IL-6被分泌至细胞外。此外许氏平鲉IL-6具有1个二硫键结构。

在基因工程领域中，大肠杆菌(Escherichia coli)是原核表达系统常用的工程菌，属于一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，其生长周期短，遗传背景清晰，培养操作简单、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。通过使用强力的启动子，外源蛋白表达可在大肠杆菌中高水平表达，表达量最高可达菌体总蛋白的40～50％。但是，大肠杆菌表达外源蛋白的速率远远高于真核生物，重组蛋白表达速率过快，新生肽链常常不能及时正确折叠，而错误折叠的蛋白疏水部分暴露、相互聚集，形成无活性包涵体。

包涵体形成是原核表达中的常见问题。目前已有人、豚鼠等动物IL-6重组蛋白原核表达的报道。然而，这些报道中IL-6重组蛋白均为无活性的包涵体，需要繁琐的变复性操作才能恢复生物活性。鉴于包涵体变复性操作繁琐耗时，变性剂尿素能够对重组蛋白的氨基共价修饰造成不利影响。如果能够诱导大肠杆菌表达可溶的、有活性的重组蛋白可以大大简化蛋白纯化的操作流程，节约生产成本与时间，具有重要的现实意义。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)大肠杆菌的重组蛋白表达速率过快，新生肽链常常不能及时正确折叠，而错误折叠的蛋白疏水部分暴露、相互聚集，形成无活性包涵体。

(2)目前已有人、豚鼠等动物IL-6重组蛋白原核表达的报道，但该报道中IL-6重组蛋白均为无活性的包涵体，需要繁琐的变复性操作才能恢复生物活性。

(3)鉴于包涵体变复性操作繁琐耗时，变性剂尿素能够对重组蛋白的氨基共价修饰造成不利影响。

解决以上问题及缺陷的难度为：大肠杆菌缺乏真核生物的内膜系统以及翻译后修饰，表达的IL-6重组蛋白常常会错误折叠而没有活性。而且大肠杆菌胞质呈还原性，不利于IL-6二硫键的形成。

解决以上问题及缺陷的意义为：二硫键对于IL-6结构至关重要，若能正确形成二硫键，并诱导可溶的、有活性的重组IL-6，将可以大大缩短蛋白纯化步骤，在生产上可以大大节约时间和试剂成本。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种许氏平鲉IL-6重组蛋白、可溶表达方法及应用，尤其涉及一种大肠杆菌表达系统生产可溶的、有生物活性的许氏平鲉白介素6(IL-6)重组蛋白及其在许氏平鲉育种中的应用。

本发明是这样实现的，一种许氏平鲉IL-6重组蛋白，所述许氏平鲉IL-6重组蛋白包括IL-6成熟肽氨基酸序列、N端的促溶短肽以及C端6×组氨酸标签(6×His标签或简称His标签)；优选地，所述IL-6重组蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

进一步，所述IL-6成熟肽氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

进一步，所述较短的、带负电荷的短肽；优选地，所述N端促溶短肽序列为MGDEDNSG；更优选地，所述C端连接肽及His标签序列为GTSGNGSGHHHHHH。

进一步，所述编码N端促溶短肽、IL-6成熟肽氨基酸以及C端连接肽及His标签的DNA序列为SEQ ID NO：3。

本发明的另一目的在于提供一种表达所述的许氏平鲉IL-6重组蛋白的表达载体，所述表达载体包括所述IL-6重组蛋白的编码基因和骨架质粒，所述骨架质粒由pET-32a(+)改造得到。

本发明的另一目的在于提供一种表达所述的许氏平鲉IL-6重组蛋白的重组工程菌，所述重组工程菌包括所述表达载体。

进一步，所述重组工程菌的宿主菌选自Rosetta-gami B(DE3)。Rosetta-gami B(DE3)是完整的表达菌的名称，指的是具有λ噬菌体基因组DE3区段溶原性的Rosetta-gamiB大肠杆菌。括号内DE3语义上是补充说明而不是释义，不能说成是Rosetta-gami B，即DE3。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的许氏平鲉IL-6重组蛋白的许氏平鲉IL-6重组蛋白的可溶表达方法，所述许氏平鲉IL-6重组蛋白的可溶表达方法包括以下步骤：

(1)构建所述IL-6重组蛋白编码基因后，连到到骨架质粒上构建得到IL-6重组蛋白的表达载体；

(2)将所述表达载体转化到宿主菌中，诱导表达IL-6重组蛋白；

(3)基于所述IL-6重组蛋白的His标签亲和层析分离得到IL-6重组蛋白；

(4)将纯化得到的蛋白溶液透析至1×PBS，加入牛血清白蛋白，-80℃保存；或脱盐后冻干，-20℃保存。

进一步，所述步骤(3)中的牛血清白蛋白BSA的终浓度为0.1％。

本发明的另一目的在于提供一种所述的许氏平鲉IL-6重组蛋白在许氏平鲉育种中的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供一种许氏平鲉IL-6重组蛋白，包含：IL-6成熟肽氨基酸序列、连接在N端的促溶短肽、C端的6×组氨酸标签肽段。本发明还提供了编码该重组蛋白的基因、表达该重组蛋白的载体和重组工程菌，基于该重组蛋白制备许氏平鲉IL-6蛋白的方法，以及该重组蛋白或制备的许氏平鲉IL-6蛋白在许氏平鲉育种中的应用。本发明的重组蛋白可通过原核细菌大量诱导表达获取可溶性重组蛋白，有利于后续工业化提取和纯化，并且纯化后不需要切除标签即有生物活性，能够有效的用于许氏平鲉育种。

本发明首次构建了许氏平鲉IL-6的原核表达载体pET-IL6-His，并且将该载体转染Rosetta-gami B(DE3)大肠杆菌，得到的pET-IL6-His/Rosetta-gami B(DE3)表达菌株，通过37℃扩培、0℃冷激以及16℃诱导表达，能大量诱导表达获取可溶的重组蛋白；通过组氨酸标签亲和纯化后，可得到纯度高达90％的重组蛋白，纯化后蛋白不需要切除标签即有生物活性。利用本发明所述方法能够得到氨基酸序列与IL-6成熟肽一致的许氏平鲉IL-6重组蛋白；在生产上，纯化可溶蛋白操作简便省时、节约试剂，相比于常规的包涵体变性和稀释复性，纯化IL-6可溶蛋白可以节约1～2天的时间，并且不需要耗费大量的尿素用于变复性，产量约为20mg/L培养基。

在许氏平鲉的苗种繁育中，因为许氏平鲉为体内受精、卵胎生鱼类，生产上难以做到繁殖同步，雌鱼产仔不同步会增加人力物力成本。通过注射IL-6重组蛋白，达到催产的效果实现产仔同步化，大大节约育苗成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的许氏平鲉IL-6蛋白结构及其基因开放阅读框(ORF)克隆示意图。

图1A是本发明实施例提供的许氏平鲉IL-6由26个氨基酸的信号肽和211氨基酸的成熟肽组成示意图；其中，aa：氨基酸。

图1B是本发明实施例提供的IL-6的ORF序列及其翻译的氨基酸序列，浅灰色区域为成熟肽氨基酸序列示意图。

图2是本发明实施例提供的通用载体pET-HTH图谱，由pET-32a(+)改造得到。

图2A是本发明实施例提供的pET-HTH载体组成示意图。

图2B是本发明实施例提供的pET-HTH多克隆酶切位点附近序列示意图；

图中：MCS：多克隆酶切位点；LacO：乳糖操纵子操纵序列；RBS：核糖体结合位点；LacI：乳糖操纵子调节基因I；rop：引物阻遏子基因；pBR322 Origin：pBR322复制起点；AmpR：氨苄青霉素抗性基因。

图3是本发明实施例提供的许氏平鲉IL-6重组蛋白表达载体图谱、重组蛋白构成及重组蛋白ORF序列示意图。

图3A是本发明实施例提供的许氏平鲉IL-6重组蛋白表达载体图谱。

图3B是本发明实施例提供的IL-6重组蛋白结构示意图。

图3C是本发明实施例提供的重组蛋白ORF及其翻译氨基酸序列示意图(部分密码子已优化)；浅灰色区域为IL-6成熟肽，深灰色区域为His标签；

图中：LacO：乳糖操纵子操纵序列；RBS：核糖体结合位点；LacI：乳糖操纵子调节基因I；rop：引物阻遏子基因；pBR322 Origin：pBR322复制起点；AmpR：氨苄青霉素抗性基因。

图4是本发明实施例提供的IL-6重组蛋白表达、纯化SDS-PAGE凝胶电泳图；

图中：M：蛋白分子量标准；1：IPTG诱导前细菌总蛋白；2：0.3mM IPTG16℃诱导14h后细菌总蛋白；3：诱导后细菌裂解液沉淀；4：诱导后细菌裂解液上清；5：NTA-Ni亲和纯化流穿液；6：洗杂液；7：洗脱液(含目的蛋白，纯度＞90％)；黑色箭头指示IL-6重组蛋白条带(分子量～26kDa)。

图5是本发明实施例提供的许氏平鲉许氏平鲉脾脏原代细胞以及不同浓度IL-6重组蛋白刺激后下游基因ptgs2相对表达水平变化示意图。

图5A是本发明实施例提供的许氏平鲉脾脏原代细胞形态示意图。

图5B是本发明实施例提供的0～500ng/mL的IL-6重组蛋白刺激后下游基因ptgs2相对表达水平变化示意图。

图6是本发明实施例提供的许氏平鲉IL-6重组蛋白的可溶表达方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种许氏平鲉IL-6重组蛋白、可溶表达方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图6所示，本发明实施例提供的许氏平鲉IL-6重组蛋白的可溶表达方法包括以下步骤：

S101，构建所述IL-6重组蛋白编码基因后，连到到骨架质粒上构建得到IL-6重组蛋白的表达载体；

S102，将所述表达载体转化到宿主菌中，16℃诱导表达IL-6重组蛋白；

S103，基于所述IL-6重组蛋白的His标签亲和层析分离得到IL-6重组蛋白；

S104，将纯化得到的蛋白溶液透析至1×PBS，加入终浓度0.1％的牛血清白蛋白，-80℃保存；或脱盐后冻干，-20℃保存。

本发明提供了一种许氏平鲉IL-6重组蛋白可溶诱导表达的方法，包含：IL-6重组蛋白氨基酸序列，以及IL-6原核表达载体构建方法以及蛋白纯化方式。优选地，所述IL-6重组氨基酸序列为SEQ ID NO：1:mgdednsgvedlptdspvsgepsgeeevwpsdllsssqywdivieatkrhqqefenefqneveyiflehyrisslpagcppsnfskeaclhrlaqgllvytvllkhvekeypsssihsqaryysnilinlikekmrnpeqvtaptssqetqllrdldnsdtfqrrmtahsimrklhfflidgkraiskrektrgsmanrstptisfyiqklkdgsinqlgtsgngsghhhhhh

IL-6成熟肽氨基酸序列为SEQ ID NO：2：vedlptdspvsgepsgeeevwpsdllsssqywdivieatkrhqqefenefqneveyiflehyrisslpagcppsnfskeaclhrlaqgllvytvllkhvekeypsssihsqaryysnilinlikekmrnpeqvtaptssqetqllrdldnsdtfqrrmtahsimrklhfflidgkraiskrektrgsmanrstptisfyiqklkdgsinql。

在根据本发明的一个实施方案中，在重组蛋白N端添加带负电荷的促溶短肽序列MGDEDNSG，可以抑制蛋白聚沉，促进蛋白的可溶表达，提升表达水平。

在根据本发明的一个实施方案中，在重组蛋白C端添加连接肽以及His标签，期氨基酸序列为GTSGNGSGHHHHHH。6×His标签(HHHHHH)可用于蛋白镍柱亲和层析纯化蛋白；在IL-6与His标签之间添加了8个氨基酸GTSGNGSG作为连接肽，使得防止His标签被IL-6遮蔽而能够充分暴露于溶液中，以便于在非变性条件下亲和纯化重组蛋白。

上述N端和C端短肽标签均较小，不会影响蛋白活性，不需要切除标签。

本发明还提供了上述的IL-6重组蛋白的编码基因，包含：N端促溶短肽、IL-6成熟肽、连接C端连接肽以及His标签；所述编码IL-6成熟肽氨基酸的核苷酸序列为SEQ ID NO：3:atgggtgttgaagatctgccaactgattctccggtgagcggcgaaccgagcggtgaagaggaggtgtggccctctgacctgctgagctcctctcagtactgggacatagtcatcgaagcaaccaaacgccaccagcaggagtttgaaaatgaattccaaaatgaggtggaatatatttttctggagcactacaggatctcctcacttccagcaggctgccctccctccaacttcagcaaggaggcttgtctccacaggttggcacaaggcctgctggtttacacggttcttctcaagcatgtggagaaggagtaccccagcagctccatccactcacaggccaggtactacagcaacatcctgatcaacctcatcaaagaaaagatgaggaaccctgaacaggtcacggcaccgaccagcagccaggagacgcagctgctgagggacctcgacaactccgacactttccagagaaggatgaccgcacacagcatcatgcgcaagctccacttcttcctgatcgacggcaaaagagcgattagcaaacgcgaaaaaacccgcggcagcatggcgaaccgtagcaccccgaccattagcttttatattcagaaactgaaagatggcagcatcaaccagctgggtacctctggtaacggttctggccatcaccatcaccaccactaa。

本发明进一步提供了一种用于表达IL-6重组蛋白的表达载体，包含如上所述的IL-6重组蛋白的编码基因和骨架质粒，所述骨架质粒由pET-32a(+)改造得到。

本发明更进一步地提供了用于表达上述的IL-6重组蛋白的重组工程菌，包含上述的表达载体；优选地，所述重组工程菌的宿主菌选自Rosetta-gami B(DE3)。Rosetta-gamiB(DE3)gor基因和TrxB基因双突变使得其胞质呈氧化型，有利于重组IL-6二硫键形成。Rosetta-gami B(DE3)大肠杆菌还含有氯霉素抗性的pRARE质粒，提供了大肠杆菌稀缺的6种密码子，可以提高外源基因的表达水平(也可以优化IL-6密码子后，人工合成IL-6基因提高表达水平)。

本发明提供了一种优化的可溶蛋白诱导方法，通过向培养基添加0.2％葡萄糖拮抗大肠杆菌的乳糖代谢通路，在37℃扩培阶段抑制其本底表达，防止表达产生不溶的包涵体；将菌液0℃冷激，促使其胞内产生甘露糖等成分，有利于蛋白质折叠，随后16℃诱导表达，较低温度可以延缓蛋白折叠速率，有利于正确折叠产生可溶蛋白。

本发明提供的许氏平鲉IL-6cDNA的开放阅读框序列为SEQ ID NO：4：atgccttctcatctcaactcgtcctggctctctgcggtgatgctggcagctctgttgctgtgtgctcccggtgctccggttgaagacttgcccaccgacagcccggtgtcaggtgagccctcaggtgaggaggaggtgtggccctctgacctgctgagctcctctcagtactgggacatagtcatcgaagcaaccaaacgccaccagcaggagtttgaaaatgaattccaaaatgaggtggaatatatttttctggagcactacaggatctcctcacttccagcaggctgccctccctccaacttcagcaaggaggcttgtctccacaggttggcacaaggcctgctggtttacacggttcttctcaagcatgtggagaaggagtaccccagcagctccatccactcacaggccaggtactacagcaacatcctgatcaacctcatcaaagaaaagatgaggaaccctgaacaggtcacggcaccgaccagcagccaggagacgcagctgctgagggacctcgacaactccgacactttccagagaaggatgaccgcacacagcatcatgcgcaagctccacttcttcctcatcgacggcaaaagagcgatctctaaaagggagaagaccagaggaagtatggccaacaggagcacgccaaccatcagtttctatatccaaaagttaaaagatgggagcatcaaccagttatga；许氏平鲉IL-6信号肽+成熟肽序列为SEQ ID NO：5：mpshlnsswlsavmlaalllcapgapvedlptdspvsgepsgeeevwpsdllsssqywdivieatkrhqqefenefqneveyiflehyrisslpagcppsnfskeaclhrlaqgllvytvllkhvekeypsssihsqaryysnilinlikekmrnpeqvtaptssqetqllrdldnsdtfqrrmtahsimrklhfflidgkraiskrektrgsmanrstptisfyiqklkdgsinql。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1：许氏平鲉IL-6表达载体pET-IL6-His的构建

以许氏平鲉头肾cDNA为模板，使用引物O-il6-F/R(生工，上海)和试剂2×PhantaMax Master Mix(诺唯赞，南京)进行PCR扩增出许氏平鲉IL-6基因(il6)的开放阅读框(ORF)的DNA序列(见图1)。通过TOPO连接将其连入pCE2 TA/Blunt Zero载体(诺唯赞，南京)转染DH5α大肠杆菌(诺唯赞，南京)，氨苄固体培养基筛选单菌落，桑格测序、NCBI BLAST鉴定序列是否无误。以上述许氏平鲉il6单克隆菌液为模板，使用引物PE-il6-F/R和2×Phanta Max Master Mix进行PCR扩增，得到带有同源臂的IL-6成熟肽对应的双链DNA片段(除了采用克隆的技术手段，也可以根据氨基酸序列优化密码子后人工合成相应序列)。同时使用限制性核酸内切酶Nde I和Kpn I将骨架质粒pET-HTH(见图2)双酶切线性化。使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(诺唯赞，南京)将PCR产物以及双酶切产物胶回收，用同源重组试剂盒(诺唯赞，南京)连接插入片段和线性载体，转染DH5α感受态大肠杆菌，氨苄固体培养基筛选单菌落，桑格测序确认无误后，使用质粒小提中量试剂盒(天根，北京)抽提质粒(图5中D)，即为许氏平鲉IL-6原核表达载体pET-IL6-His(见图3)。

表1载体构建所使用的引物序列图表

其中，引物O-il6的核苷酸序列为SEQ ID NO：6：ttcttccagcagcagcagctc

ttcttccagcagcagcagctc，引物PE-il6的核苷酸序列为SEQ ID NO：7：agaaggagatatacatatgggtgatgaagataactctggtgttgaagacttgcccacc

gttaccagaggtacctaactggttgatgctcccatc。

注：引物小写正体示同源臂，用于同源重组连接构建原核表达载体；小写斜体示促溶短肽对应密码子，补充在IL-6成熟肽基因序列的5’端。

实施例2：许氏平鲉IL-6大肠杆菌表达菌株的制备和小量诱导表达

将表达载体pET-IL6-His转染Rosetta B(DE3)感受态大肠杆菌(昂羽，上海)，用氨苄-氯霉素双抗LB固体培养基37℃培养过夜筛选单菌落，即为许氏平鲉IL-6原核表达工程菌pET-IL6-His-Rosetta-gami B(DE3)。挑取单菌落于10mL氨苄-氯霉素双抗LB液体培养基中37℃，220转/分培养过夜，然后按照1：100的比例接种于100mL含双抗和0.2％葡萄糖的LB液体培养基中，37℃，220转/分培养3～4h至OD600到0.4～0.6，然后将菌液置于冰水混合物中骤冷，加入IPTG使其终浓度为0.3mM(取出50mL菌液作为诱导前的对照)，16℃，90转/分培养14h后3500g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用5mL的裂菌缓冲液(500mM NaCl，20mMPB，10mM咪唑，pH 7.4)重悬，60W超声破碎30min，超5s停5s，12000g离心10min分别收集上清和沉淀，沉淀用5mL裂菌缓冲液重悬，分别取80μL样品和20μL 5×蛋白上样缓冲液混匀，金属浴95℃10min，进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色观察蛋白条带(图4中样品1～4)。结果表明：IL-6重组蛋白能够正确表达，并主要存在与上清中，为可溶蛋白。

实施例3：许氏平鲉IL-6重组蛋白可溶表达及蛋白纯化

按照1：100的比例接种于500mL含双抗和0.2％葡萄糖LB液体培养基中，37℃，220转/分培养3～4h至OD600到0.4～0.6，然后加入IPTG使其终浓度为0.3mM，16℃，90转/分培养12h后3500g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用50mL非变性裂菌缓冲液重悬，60W超声破碎30min，超声5s停5s，12000g离心10min弃沉淀，保留上清，用0.45μm或0.22μm滤膜过滤除去不溶的微颗粒，使用NTA-Ni填料(碧云天，上海)进行His标签亲和纯化，得到纯度＞90％的IL-6重组蛋白(见图4中样品4～7)。

将纯化得到的IL-6重组蛋白溶液灌入蛋白透析袋(孔径MWCO 500)中，透析至1×PBS溶液中，取少量蛋白用BCA法测定蛋白浓度，剩余蛋白溶液加入终浓度0.1％的牛血清白蛋白(BSA)以稳定重组蛋白防止聚沉，分装后-80℃保存。若保存条件有限，也可以使用脱盐柱将蛋白脱盐后冷冻干燥，-20℃保存。

实施例4：许氏平鲉IL-6重组蛋白激活炎症相关细胞通路NF-κB

分离许氏平鲉脾脏原代细胞后，用加入的含有10％胎牛血清(FBS)的L-15培养基把细胞浓度调成5×10

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种许氏平鲉IL-6重组蛋白、可溶表达方法及应用

<141> 2021-12-21

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Asp Glu Asp Asn Ser Gly Val Glu Asp Leu Pro Thr Asp Ser

1 5 10 15

Pro Val Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Glu Glu Val Trp Pro Ser Asp

20 25 30

Leu Leu Ser Ser Ser Gln Tyr Trp Asp Ile Val Ile Glu Ala Thr Lys

35 40 45

Arg His Gln Gln Glu Phe Glu Asn Glu Phe Gln Asn Glu Val Glu Tyr

50 55 60

Ile Phe Leu Glu His Tyr Arg Ile Ser Ser Leu Pro Ala Gly Cys Pro

65 70 75 80

Pro Ser Asn Phe Ser Lys Glu Ala Cys Leu His Arg Leu Ala Gln Gly

85 90 95

Leu Leu Val Tyr Thr Val Leu Leu Lys His Val Glu Lys Glu Tyr Pro

100 105 110

Ser Ser Ser Ile His Ser Gln Ala Arg Tyr Tyr Ser Asn Ile Leu Ile

115 120 125

Asn Leu Ile Lys Glu Lys Met Arg Asn Pro Glu Gln Val Thr Ala Pro

130 135 140

Thr Ser Ser Gln Glu Thr Gln Leu Leu Arg Asp Leu Asp Asn Ser Asp

145 150 155 160

Thr Phe Gln Arg Arg Met Thr Ala His Ser Ile Met Arg Lys Leu His

165 170 175

Phe Phe Leu Ile Asp Gly Lys Arg Ala Ile Ser Lys Arg Glu Lys Thr

180 185 190

Arg Gly Ser Met Ala Asn Arg Ser Thr Pro Thr Ile Ser Phe Tyr Ile

195 200 205

Gln Lys Leu Lys Asp Gly Ser Ile Asn Gln Leu Gly Thr Ser Gly Asn

210 215 220

Gly Ser Gly His His His His His His

225 230

<210> 2

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Glu Asp Leu Pro Thr Asp Ser Pro Val Ser Gly Glu Pro Ser Gly

1 5 10 15

Glu Glu Glu Val Trp Pro Ser Asp Leu Leu Ser Ser Ser Gln Tyr Trp

20 25 30

Asp Ile Val Ile Glu Ala Thr Lys Arg His Gln Gln Glu Phe Glu Asn

35 40 45

Glu Phe Gln Asn Glu Val Glu Tyr Ile Phe Leu Glu His Tyr Arg Ile

50 55 60

Ser Ser Leu Pro Ala Gly Cys Pro Pro Ser Asn Phe Ser Lys Glu Ala

65 70 75 80

Cys Leu His Arg Leu Ala Gln Gly Leu Leu Val Tyr Thr Val Leu Leu

85 90 95

Lys His Val Glu Lys Glu Tyr Pro Ser Ser Ser Ile His Ser Gln Ala

100 105 110

Arg Tyr Tyr Ser Asn Ile Leu Ile Asn Leu Ile Lys Glu Lys Met Arg

115 120 125

Asn Pro Glu Gln Val Thr Ala Pro Thr Ser Ser Gln Glu Thr Gln Leu

130 135 140

Leu Arg Asp Leu Asp Asn Ser Asp Thr Phe Gln Arg Arg Met Thr Ala

145 150 155 160

His Ser Ile Met Arg Lys Leu His Phe Phe Leu Ile Asp Gly Lys Arg

165 170 175

Ala Ile Ser Lys Arg Glu Lys Thr Arg Gly Ser Met Ala Asn Arg Ser

180 185 190

Thr Pro Thr Ile Ser Phe Tyr Ile Gln Lys Leu Lys Asp Gly Ser Ile

195 200 205

Asn Gln Leu

210

<210> 3

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggtgttg aagatctgcc aactgattct ccggtgagcg gcgaaccgag cggtgaagag 60

gaggtgtggc cctctgacct gctgagctcc tctcagtact gggacatagt catcgaagca 120

accaaacgcc accagcagga gtttgaaaat gaattccaaa atgaggtgga atatattttt 180

ctggagcact acaggatctc ctcacttcca gcaggctgcc ctccctccaa cttcagcaag 240

gaggcttgtc tccacaggtt ggcacaaggc ctgctggttt acacggttct tctcaagcat 300

gtggagaagg agtaccccag cagctccatc cactcacagg ccaggtacta cagcaacatc 360

ctgatcaacc tcatcaaaga aaagatgagg aaccctgaac aggtcacggc accgaccagc 420

agccaggaga cgcagctgct gagggacctc gacaactccg acactttcca gagaaggatg 480

accgcacaca gcatcatgcg caagctccac ttcttcctga tcgacggcaa aagagcgatt 540

agcaaacgcg aaaaaacccg cggcagcatg gcgaaccgta gcaccccgac cattagcttt 600

tatattcaga aactgaaaga tggcagcatc aaccagctgg gtacctctgg taacggttct 660

ggccatcacc atcaccacca ctaa 684

<210> 4

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgccttctc atctcaactc gtcctggctc tctgcggtga tgctggcagc tctgttgctg 60

tgtgctcccg gtgctccggt tgaagacttg cccaccgaca gcccggtgtc aggtgagccc 120

tcaggtgagg aggaggtgtg gccctctgac ctgctgagct cctctcagta ctgggacata 180

gtcatcgaag caaccaaacg ccaccagcag gagtttgaaa atgaattcca aaatgaggtg 240

gaatatattt ttctggagca ctacaggatc tcctcacttc cagcaggctg ccctccctcc 300

aacttcagca aggaggcttg tctccacagg ttggcacaag gcctgctggt ttacacggtt 360

cttctcaagc atgtggagaa ggagtacccc agcagctcca tccactcaca ggccaggtac 420

tacagcaaca tcctgatcaa cctcatcaaa gaaaagatga ggaaccctga acaggtcacg 480

gcaccgacca gcagccagga gacgcagctg ctgagggacc tcgacaactc cgacactttc 540

cagagaagga tgaccgcaca cagcatcatg cgcaagctcc acttcttcct catcgacggc 600

aaaagagcga tctctaaaag ggagaagacc agaggaagta tggccaacag gagcacgcca 660

accatcagtt tctatatcca aaagttaaaa gatgggagca tcaaccagtt atga 714

<210> 5

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Pro Ser His Leu Asn Ser Ser Trp Leu Ser Ala Val Met Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Cys Ala Pro Gly Ala Pro Val Glu Asp Leu Pro Thr

20 25 30

Asp Ser Pro Val Ser Gly Glu Pro Ser Gly Glu Glu Glu Val Trp Pro

35 40 45

Ser Asp Leu Leu Ser Ser Ser Gln Tyr Trp Asp Ile Val Ile Glu Ala

50 55 60

Thr Lys Arg His Gln Gln Glu Phe Glu Asn Glu Phe Gln Asn Glu Val

65 70 75 80

Glu Tyr Ile Phe Leu Glu His Tyr Arg Ile Ser Ser Leu Pro Ala Gly

85 90 95

Cys Pro Pro Ser Asn Phe Ser Lys Glu Ala Cys Leu His Arg Leu Ala

100 105 110

Gln Gly Leu Leu Val Tyr Thr Val Leu Leu Lys His Val Glu Lys Glu

115 120 125

Tyr Pro Ser Ser Ser Ile His Ser Gln Ala Arg Tyr Tyr Ser Asn Ile

130 135 140

Leu Ile Asn Leu Ile Lys Glu Lys Met Arg Asn Pro Glu Gln Val Thr

145 150 155 160

Ala Pro Thr Ser Ser Gln Glu Thr Gln Leu Leu Arg Asp Leu Asp Asn

165 170 175

Ser Asp Thr Phe Gln Arg Arg Met Thr Ala His Ser Ile Met Arg Lys

180 185 190

Leu His Phe Phe Leu Ile Asp Gly Lys Arg Ala Ile Ser Lys Arg Glu

195 200 205

Lys Thr Arg Gly Ser Met Ala Asn Arg Ser Thr Pro Thr Ile Ser Phe

210 215 220

Tyr Ile Gln Lys Leu Lys Asp Gly Ser Ile Asn Gln Leu

225 230 235

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcttccagc agcagcagct cttcttccag cagcagcagc tc 42

<210> 7

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaaggagat atacatatgg gtgatgaaga taactctggt gttgaagact tgcccaccgt 60

taccagaggt acctaactgg ttgatgctcc catc 94