一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其制备方法

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其发酵工艺。本发明从濒危植物大别山五针松植物中分离到一株内生放线菌WP‑1，其16S rDNA含有如序SEQ ID NO 1所示的序列，本发明还包括使用该链霉素生产制霉色基素的发酵工艺及其应用。本发明的链霉素的发酵液对植物病原菌尖孢镰刀菌具有较好的活性作用，发酵工艺成本低、产量高，可以实现大规模工业化生产。本发明公开的WP‑1链霉菌及其发酵代谢产物，可用于抑制西瓜枯萎病菌等多种农作物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发，避免化学农药的使用，为具有前途的生物农药。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其制备方法。

背景技术

农作物在种植过程中经常会受到来自于细菌、真菌和病毒感染的威胁，尤其以真菌性病害最为常见，造成作物生长过程中坏死、腐烂、枯萎、变色、畸形等，严重影响农作物的产量和质量。目前用于防治作物真菌性病害的主要方法是化学药剂防治法，如代森锰锌、霜脲氰锰锌、波尔多、百菌清、甲基硫菌灵、多菌灵、福美双、甲霜灵、戊唑醇、乙磷铝等，但类似上述化学药剂防治法往往造成农作物的化学残留、环境和食品安全的隐患等。长期使用化学药剂防治也会加快农作物致病菌的抗药性，如此造成恶性循环，不符合绿色农业和可持续发展的现代理念。

近年来，国内外逐步使用生物防治法控制农作物各种病害，其中主要包括利用有益微生物或微生物的发酵代谢产物来防治农作物各种病害，这些有益微生物通常包括细菌、放线菌、酵母菌甚至霉菌。实际应用中，往往利用有益微生物的活菌体或菌体的代谢产物制成粉剂、颗粒剂、液剂、悬浮剂或含菌肥料等，防治农作物真菌性病害，并取得了明显的防治效果和环境改善效应。其主要原理在于：有益微生物制剂通过喷洒或浇灌在自然条件下可以大量的繁殖，从而与植物病原菌形成占位及营养竞争，甚至分泌代谢产物，直接杀死植物病原菌或诱导植物对病原菌产生抗性；有些有益微生物还可产生植物生长刺激素、维生素等活性物质促进植株生长，增加作物产量。这些微生物源产品的优点是对人、动物和有益昆虫毒性低、室外环境降解快、残留小、有利于绿色农业和可持续发展。当前该领域用于防治农作物真菌性病害的产品主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、木霉菌等微生物活菌体制剂；微生物的代谢产物制剂也普遍推广使用，如用井冈霉素水剂(或可湿性粉剂)防治水稻纹枯病、春雷霉素水剂(或可湿性粉剂)防治水稻稻瘟病、多抗霉素水剂(或可湿性粉剂)防治小麦根腐病、武夷霉素水剂(或可湿性粉剂)防治黄瓜白粉病、中生菌素水剂(或可湿性粉剂)防治苹果腐烂病等。由于农作物品种繁多，病害复杂，可用于生物防治的品种数量还十分有限，另外也存在有些品种药效缓慢或药效不明显等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的高效防治农作物真菌性病害的链霉菌。

本发明的另一目的在于提供一种优化的发酵工艺，提高上述链霉菌代谢产物的产量，以实现工业化生产。

本发明提供了一株链霉菌，结晶紫染色后在光学显微镜下观察插片上菌株的基内菌丝、气生菌丝、孢子及孢子丝的形态。如图2所示，放线菌的菌落早期绒状，后期菌落呈粉状、干燥，有淡黄色色素沉积呈同心圆放射状；菌落表面为浅灰白色，并伴有较浓土腥味道；基内菌丝无横隔，分枝多；气生菌丝呈现直或者弯曲，有横隔，呈现明显的结节状。

所述链霉菌的16S rDNA含有如SEQ ID NO 1所示的序列。

本发明提供了一种新的高效防治农作物真菌性病害的链霉菌，该链霉菌是从中国特有的濒危植物大别山五针松树皮中分离得到，已于2020年1月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号：CGMCC NO.19354。结合菌株生长的形态特征和16S rDNA序列分析，该菌属于链霉菌(Streptomyces sp)，该菌株命名为Streptomyces sp WP-1。

本发明提供了所述的链霉菌的制备方法，包括：

清洁并且消毒大别山五针松的树皮，切成小块接种到PDA培养基上；

培养一周后，将培养基上长出的单菌落挑出，分别接种到PDA培养基上，培养一周后，取直径不小于6mm的菌饼备用；

以植物病原菌尖孢镰刀菌为靶标菌，使用平板对峙培养法进行生防菌株的筛选。

所述的PDA培养基可以通过市售渠道获得。

另一方面，本发明提供了一种优化的发酵工艺，提高上述链霉菌代谢产物的产量，以实现工业化生产。经前期研究该菌株的基本发酵工艺为：葡萄糖2％，麦芽糖2％，棉籽粉5％，并含有少量无机盐硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁等，初始pH6.5，装液量为50ml/250ml 三角瓶，接种量8％，培养温度28℃，转速180r/min，培养6天，摇瓶发酵水平可达1.3675g/L。本发明优化了前期的基本发酵工艺，通过碳源调控、添加捕氨剂及无机磷酸盐和氧载体等，摇瓶发酵水平达5.5g/L以上，生产成本可大幅降低，具备工业化大规模生产的能力。本发明提供的链霉菌发酵代谢产物为一种多烯大环内酯类物质，经鉴定该物质为制霉色基素(Fungichromin,FC)，对大多数致病真菌有杀灭作用，可广泛的用于防治农作物真菌性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestan)引起的马铃薯晚疫、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的西瓜枯萎病等，并且该物质对光敏感，光照条件下容易分解，不易造成环境污染和在农作物中的残留等。中国台湾专利TWI338048B描述了制霉色基素的制备方法，是由链霉菌(Streptomyces padanus PMS-702)在脱脂黄豆粉、葡萄糖、碳酸钙和微量二价盐离子为基质的培养基中23.8℃发酵培养6天，发酵过程中补加一定量的玉米油，制霉色基素最高产量可达约2.05 g/L，其发酵水平远不及本发明。

本发明提供了所述的链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(1)链霉菌WP-1的活化；

(2)链霉菌WP-1的液体发酵，包括种子液的制备和链霉菌的发酵。

较好的，所述的发酵方法中使用优化后的无菌固体培养基培养链霉素WP-1；

其中，优化后的无菌固体培养基组成为每100ml中含有：葡萄糖0.3-2.0g，酵母膏0.3-1.0g，蛋白胨0.3-1.0g，牛肉膏0.08-0.30g，硫酸镁0.02-0.30g，磷酸氢二钾 0-0.40g。

本发明中，链霉菌WP-1产制霉色基素的发酵条件优化包括：

链霉菌WP-1液态发酵产生制霉色基素的基本工艺条件：

培养基：葡萄糖2％，麦芽糖2％，棉籽粉5％，硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁等；初始pH6.5，装液量50ml培养基/250ml三角瓶；发酵工艺：接种量8％，培养温度28℃，转速180r/min，连续培养6天，摇瓶发酵水平可达1.3675g/L。

在本发明的一个优选实施例中，制霉色基素(FC)的HPLC检测条件：

使用C18反相柱(Waters X-Bridge 5μm 4.6×250mm)进行HPLC对发酵液中制霉色基素的含量测定。流动相为HPLC级甲醇：水＝60：40(V/V)，流速为0.8mL/min，检测波长为357nm，进样量为10μL。

较好的，所述的发酵方法中，还原糖浓度不少于2g/ml。

较好的，在发酵液中增加Ca

较好的，在发酵液中增加氧载体，所述的氧载体选自正十二烷、Tween 80、油酸或者大豆油。

较好的，所述的发酵方法还包括发酵获得的活性代谢产物的提取纯化及鉴定；

所述的链霉菌发酵液活性产物的提取包括：

将链霉菌的发酵液离心分离，得上清液和菌丝体，上清液浓缩后加入等体积的乙酸乙酯，室温下萃取1-5次并合并萃取液得乙酸乙酯相I；用乙醇水溶液浸泡菌丝体并离心，重复1-5次，合并浸泡液并浓缩至无乙醇，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并得乙酸乙酯相 II。将乙酸乙酯相I、II合并，浓缩至干，得到总乙酸乙酯浸膏；

将乙酸乙酯浸膏用大孔树脂吸附，用乙醇水溶液洗脱，洗脱液减压浓缩，得到黄色膏状物，即为链霉菌发酵液的粗提物；

将黄色膏状粗提物用甲醇溶解，用硅胶柱层析进行分离，使用二氯甲烷的甲醇溶液梯度洗脱，收集于吸收峰最大的部分，减压浓缩，得初步纯品；

将初步纯品甲醇溶解，HPLC法制备纯化；通过电喷雾质谱核磁共振的测定及化合物理化性质分析，确定为制霉色基素。

本发明还提供了所述的发酵方法的应用，即将发酵产物用于农作物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发。

较好的，所述的应用是生产制霉色基素。所述的发酵产物，或者代谢活性物质主要是制霉色基素。

本发明从濒危植物大别山五针松植物中分离到一株内生放线菌WP-1，对其进行发酵并对发酵液活性进行筛选，发现对植物病原菌尖孢镰刀菌具有较好的活性，并鉴定了主要的活性产物为制霉色基素。通过对培养基成分和发酵条件进行优化，优化后的发酵液抑菌活性显著增强，优化后的活性代谢产物产量大幅提高，约是优化前的4.2倍，其产量可提升至5741.7mg/L，可以实现大规模工业化生产。本发明公开的WP-1链霉菌及其发酵代谢产物，可以用于抑制西瓜枯萎病菌等多种农作物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发，避免化学农药的使用，是较有前途的生物农药。

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

附图说明

图1链霉菌WP-1对西瓜专化型尖孢镰刀菌的拮抗作用。

图2链霉菌WP-1的斜面生长和扫描电镜形态。

图3活性代谢产物对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响：a对照组；b FC(12.5μg/ml)

实验组。

图4活性化合物的结构解析：a氢谱；b碳谱；c DEPT谱。

图5不同时间补充不同碳源对链霉菌WP-1发酵生产FC的影响。5B中，1、4、7为葡萄糖组，2、5、8为蔗糖组，3、6、9为麦芽糖组。

图6多种磷酸盐对链霉菌WP-1发酵生产FC的影响。

图7不同种类捕铵剂对链霉菌WP-1发酵生产FC和发酵体系中铵离子浓度的影响。

图8多种氧载体在不同添加浓度对链霉菌WP-1发酵生产FC的影响。

图9多种氧载体在不同添加时间对链霉菌WP-1发酵生产FC的影响。

图10链霉菌WP-1发酵产物中FC的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1制霉色基素产生菌的分离、筛选、鉴定及保存

1.1采集大别山五针松树皮，用流水将其表面清洗干净，室内晾干后进行表面消毒，用75％乙醇中迅速润洗1min左右，无菌水漂洗3次后用1％次氯酸钠溶液消毒4min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸片吸干水分，切成0.5×0.5的小块接种到PDA培养基上，28℃培养5～7天，将培养基上长出的26株单菌落挑出，分别接种到PDA培养基上，28℃培养 5～7天，平板基本长满后各取直径7mm的菌饼备用。

1.2以植物病原菌尖孢镰刀菌(F.oxysporum)为靶标菌，利用平板对峙培养法进行生防菌株的筛选。配制PDA平板培养基，在直径90mm平板背面画十字，十字交叉点为平板圆心，在十字线上距圆心25mm处的3个点位分别接种3株直径7mm的上述菌饼，剩余1 个点位接种空白的直径7mm PDA培养基作为对照，将直径7mm的尖孢镰刀菌的菌饼接种在该PDA平板的中央，置28℃培养箱培养5～7天。取出，比较各菌株对尖孢镰刀菌的拮抗情况。

1.3从大别山五针松树皮分离的多株内生菌中，采用平板对峙培养法筛选得到对植物病原菌尖孢镰刀菌有明显的抑制作用链霉菌WP-1，如图1所示，然后对该菌株进行分类鉴定，具体如下：

(1)菌株的形态特征

菌株WP-1接种到PDA培养基，在28℃恒温培养箱中，插片培养3d。结晶紫染色后在光学显微镜下观察插片上菌株的基内菌丝、气生菌丝、孢子及孢子丝的形态。如图2所示，放线菌的菌落早期绒状，后期菌落呈粉状、干燥，有淡黄色色素沉积呈同心圆放射状；菌落表面为浅灰白色，并伴有较浓土腥味道；基内菌丝无横隔，分枝多；气生菌丝呈现直或者弯曲，有横隔，呈现明显的结节状。

(2)16S rDNA序列测定及分析

菌株WP-1的16S rDNA核苷酸全序列总长为1457bp，序列如下所示：

TCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGC GAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAT GACCGTCTTGGGCATCCTTGACGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGA GGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGAT GACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTA ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGC GGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTA GGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCT GGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC GGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTA CGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAA CGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGG TGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGT TGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTC AAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGT GGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTA ATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTA ACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACCAGCGATTGGGACGAAGTCGT( SEQ ID NO 1)。

将序列在BLAST上进行同源性序列搜索，从中选取同源性最高的菌株构建系统发育树，推测菌株WP-1应是放线菌链霉菌属的一个分支，但是与所选择已知菌种同属不同种。结合系统发育树及形态特征比较分析，初步鉴定该菌株为链霉菌属(Streptomyces sp.)。

1.42020年1月15日，所述菌株WP-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号：CGMCC No.19354。

实施例2链霉菌WP-1的活性代谢产物的制备和分析

2.1链霉菌WP-1的培养

使用优化后固体培养基制备试管斜面培养基，从菌种的保存斜面培养基上挑取菌落，接种至试管斜面培养基上，于28℃培养4天，至菌丝成熟，孢子生长致密，变亮白色。

其中，优化后固体培养基组成为：葡萄糖1g，酵母膏1g，蛋白胨0.5g，牛肉膏 0.1g，MgSO

2.2链霉菌WP-1的液体发酵

(1)链霉菌WP-1种子液的制备：制得均匀的孢子混悬液，孢子液接种于优化后种子培养基，28℃，180rpm的转速下培养40小时，得种子液。

其中，优化后种子培养基组成为：葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，牛肉膏0.1g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾0.25g，水100mL，调节培养基pH值为7.4，121 ℃、0.1Mpa下灭菌20min。

(2)链霉菌WP-1的发酵：将链霉菌WP-1种子液以体积百分比8％的接种量接到液体发酵培养基中，28℃，180rpm，培养6天，得链霉菌WP-1发酵液。

其中，液体发酵培养基组成为：葡萄糖2％，麦芽糖2％，棉籽粉5％，,硫酸铜0.0001％，硫酸锌0.002％，硫酸锰0.0006％，硫酸镁0.00005％；初始pH6.5，装液量50ml培养基/250ml 三角瓶，121℃、0.1Mpa下灭菌30min。

2.3链霉菌WP-1活性代谢产物的提取纯化及结构分析

(1)链霉菌WP-1发酵液活性产物的提取：将链霉菌WP-1的发酵液离心分离，得上清液和菌丝体。上清液浓缩后加入等体积的乙酸乙酯，室温下萃取3次，合并得乙酸乙酯相1；用95％乙醇浸泡菌丝体，离心3000r/min，重复浸泡三次后，合并浸泡液并浓缩至无乙醇，加入一定体积的蒸馏水，乙酸乙酯等体积萃取3次，合并得乙酸乙酯相2。将乙酸乙酯相1、2合并，浓缩至干，得到总乙酸乙酯浸膏。

(2)将乙酸乙酯浸膏按照1：20(g/mL)比例用大孔树脂D101吸附，用水：乙醇(V:V50：50)洗脱，洗脱液减压浓缩，得到黄色膏状物，即为链霉菌WP-1发酵液的粗提物，紫外365nm有较大吸收，同时活性检测发现该组分对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用非常明显。

(3)将黄色膏状粗提物用甲醇溶解，按照1：5(g/mL)比例用200目硅胶柱层析进行分离，用比例为20：1-1：5的二氯甲烷：甲醇梯度洗脱，收集于紫外(365nm)处吸收峰最大的部分，减压浓缩，得初步纯品。

(4)将初步纯品甲醇溶解，HPLC法制备纯化。色谱条件为：色谱柱为反相C18半制备柱，流动相为甲醇：水＝60：40，流速3mL/min，波长365nm，等梯度洗脱，洗脱液浓缩后低温避光放置，得到黄色化合物，该化合物对尖孢镰刀菌菌丝生长具有显著抑制作用。

在无菌条件下，用生理盐水冲洗斜面获得尖孢镰刀菌孢子悬浮液，用PDB培养基稀释调节至孢子浓度为5×10

(5)通过电喷雾质谱(ESI-MS)核磁共振的测定及化合物理化性质分析等手段，确定为制霉色基素(Fungichromin,FC)。图4为本化合物谱图，其分子式为C

实施例3碳源调控对链霉菌WP-1发酵的影响

按照上述链霉菌WP-1的基本发酵工艺实施摇瓶试验，在不同发酵时间下，补充不同碳源，比较对链霉菌WP-1发酵的影响。由图5-A可知，发酵瓶中还原糖的含量在前两天出现明显的下降，并且当培养基中还原糖浓度低于2g/L时，链霉菌WP-1即不再生产制霉色基素；现以补料的方式补充碳源，选择第2天为补料参考点，向后选择第3天，向前选择1天作为补料时机，分别以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖作为碳源，即分别在培养第1、2 和3天后，各补入50％三种碳源溶液各1mL，使糖浓度提升至2g/L，再继续培养至第6 天，探讨经不同碳源在不同补糖时机一次性补料后，链霉菌WP-1生产制霉色基素的情形。

试验结果如图5-B所示，加葡萄糖后发酵液的抑菌活性，和无葡萄糖补料的发酵情形相比，随着糖量升高，并未提高，反而逐渐降低。究其原因，由于抗生素属于微生物的次级代谢产物，在营养物质缺乏、生长速率下降的情况，微生物才会开始表达次级代谢途径的相关基因，以利于次级代谢产物的生成。故当一次补入多量葡萄糖时，菌体会将其利用于生长方面，制霉色基素的生产会受到抑制，使其产量无法提升。

不同碳源会在微生物发酵的不同阶段为微生物代谢提供所需要的碳源。补加速效碳源的葡萄糖后，在不同补料时机下，链霉菌WP-1均出现糖抑制现象；当添加麦芽糖或者蔗糖，既可以维持菌丝生长，延长产素期，又能提高制霉色基素的发酵效价。在发酵培养第2天，补加1％蔗糖溶液后，制霉色基素的发酵效价，和无补料的发酵情形相比，最高提高了26％。

实施例4无机磷酸盐及捕氨剂对链霉菌WP-1发酵的影响

按照上述链霉菌WP-1的基本发酵工艺实施摇瓶试验，主要应用四种磷酸盐KH

根据以上磷酸盐的发酵结果，设计正交实验设计表1，探究磷酸盐Na

实施例5氧载体添加对链霉菌WP-1发酵的影响

按照上述链霉菌WP-1的基本发酵工艺实施摇瓶试验，为了解除链霉菌WP-1在发酵过程的溶氧极限问题，考察摇瓶发酵中添加不同氧载体在发酵初始阶段0h添加对菌体生长和产制霉色基素的影响。四种氧载体分别是正十二烷、Tween 80、油酸和大豆油，每批次发酵中含有不同油相质量分数及平行若干组。

由实验结果图8中可以看出添加氧载体的发酵产制霉色基素的活力均比没有加氧载体的活力要高，而且2％油酸、4％吐温80、1％正十二烷和3％大豆油的添加量产素能力达到最高；由图中的生物量变化也可以看出，油酸和大豆油的添加有利于菌体的生长，其生物量均要比空白的对照组要高；最后对比空白发酵结果，我们也能发现发酵液的pH变化不是非常的明显，这些似乎可以说明不同氧载体的添加都可以有效地提高发酵液体系中的氧传递，从而有利于菌体的生长和产次级代谢产物。

溶解氧在发酵过程中有着明显的变化转折点，但由于以上的氧载体添加试验均是在发酵初始时加入的，为此有必要考察在发酵不同时间加入氧载体对制霉素基素合成的影响。选取每种氧载体最适浓度进行试验，添加时间分别是0d、1d、2d、3d、4d五个时间点。

由实验结果图9可以看出，四种氧载体在不同添加时间的效果是不一样的，正十二烷、 Tween 80、油酸和大豆油分别在发酵第0、2、2和3天添加的效果最为明显，其中，发酵起始添加3％大豆油，产制霉色基素的能力最强。

按照链霉菌WP-1液态发酵产生制霉色基素的基本工艺条件，在发酵培养第2天，补加1％蔗糖溶液约可使制霉色基素的发酵效价提高1.26倍；在摇瓶培养基中，添加50mmol/L的无机磷酸盐Na

综合上述实施例的结果，确定链霉菌WP-1液态发酵产生制霉色基素的优化工艺条件：葡萄糖2％，麦芽糖2％，棉籽粉5％，硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、硫酸镁等；初始pH6.5，装液量50ml培养基/250ml三角瓶，接种量8％，培养温度28℃，转速180r/min，整个发酵过程不控制pH值，在此基础上，发酵培养中添加3％大豆油、12.5mM的十二水合磷酸氢二钠，50mM的磷酸钙和20mM的磷酸镁，并在发酵培养第2天，补加1％蔗糖溶液，当培养至第6天时，可使制霉色基素产量达5741.7mg/L，约为优化前的4.2倍。

表1磷酸盐和捕氨剂添加试验的正交设计表

表2磷酸盐和捕氨剂添加的正交试验结果

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一株产制霉色基素的大别山五针松内生链霉菌及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc gaacgatgaa gcccttcggg 60

gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc tgccctgcac tctgggacaa 120

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agcgaaagtg acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

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tagagttcgg taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg 660

aggaacaccg gtggcgaagg cggatctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg 720

tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcactaggt 780

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