一种评价化妆品产品及原料抗氧化功效的方法

摘要

本发明属于化妆品技术领域，公开了一种评价化妆品产品及原料抗氧化功效的方法。该方法，包括如下步骤：(1)分别取产品、溶剂与皮肤模型混合，孵育，得到产品组和空白组；(2)产品组和空白组分别进行光照射，得到产品光照射组和空白光照射组；(3)分别孵育产品光照射组和空白光照射组中皮肤模型，然后检测产品光照射组和空白光照射组中皮肤模型的指标，所述指标为氧化蛋白质含量、角质层厚度和组织形态中的至少一种。该方法以氧化蛋白质含量、角质层厚度和组织形态中的至少一种为指标，评价产品的抗氧化和皮肤屏障保护的功效，结果更客观；相对于抗氧化自由基的检测方法，更能直接体现产品在皮肤上的抗氧化功效。

说明书

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种评价化妆品产品及原料抗氧化功效的方法。

背景技术

皮肤光老化是一个日积月累的缓慢发展的过程，不同的光线波长，照射剂量、生理因素、病理因素等均可影响皮肤光老化情况的产生。

为了抵抗环境如光照对皮肤的氧化损伤，化妆品企业在化妆品中添加抗氧化物质，同时希望可通过某种方法，了解抗氧化试剂或化妆品在直接涂抹于皮肤状态时所具备的抗氧化能力。检测抗氧化能力的方法一般有纯化学检测方法和生物组织类检测方法。如DPPH清除能力评价法、SOD样活性评价法、过氧化氢清除能力评价法、过氧化脂质生成抑制作用评价法，但根据生物化学实验，无法对抗氧化剂/含抗氧化剂的化妆品基质在人体上使用后的抗氧化效果进行接近、直观、快速的评价。现有的化妆品及原料抗氧化功效的检测技术存在着检测指标不稳定，检测化妆品原料和化妆品产品的载体存在个体差异大、取样工作量大，与人体皮肤生理功能差异大的问题。

发明内容

本发明的第一方面的目的，在于提供一种评价产品抗氧化功效的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种评价产品抗氧化功效的方法，包括如下步骤：

(1)分别取产品、溶剂与皮肤模型混合，孵育，得到产品组和空白组；

(2)产品组和空白组分别进行光照射，得到产品光照射组和空白光照射组；

(3)分别孵育产品光照射组和空白光照射组中皮肤模型，然后检测产品光照射组和空白光照射组中皮肤模型的指标；

步骤(3)中所述指标为氧化蛋白质含量、角质层厚度和组织形态中的至少一种；通过产品处理后氧化蛋白质含量的降低程度、角质层厚度增加程度和/或细胞损伤的降低程度来衡量产品的抗氧化功效。

上述评价产品抗氧化功效的方法，皮肤模型中的氧化蛋白质含量反映总体氧化损伤，检测指标更稳定，可以对皮肤模型中的氧化蛋白质含量进行定量和半定量，检测结果更客观，而且能够更真实的反应化妆品在皮肤应用中的抗氧化功效；以角质层厚度作为产品抗氧化功效的指标，可以有效地帮助评价皮肤屏障功能，在化妆品研发中用于测试化妆品的对于皮肤氧化损伤的功效有更客观的结果和更高的应用价值；以组织形态作为产品抗氧化功效的指标，可以直观展示产品对组织的抗光损伤作用。

优选地，步骤(3)中所述指标为角质层厚度和组织形态中的至少一种及氧化蛋白质含量；进一步为氧化蛋白质含量、角质层厚度和组织形态。

优选地，步骤(1)中所述孵育的条件为36.8～37.2℃、4.5％～5.5％CO

优选地，步骤(1)中所述溶剂为PBS。

优选地，步骤(1)中所述产品包括化妆品产品、化妆品原料和化妆品中间组合物。

优选地，所述化妆品中间组合物为化妆品配方。

优选地，步骤(1)中所述皮肤模型为3D皮肤模型；3D皮肤模型与人体皮肤结构与生理功能近似，可以更大程度地排除个体差异，重复性好，差异小，工作量小，而且不需要依赖于人体试验，更安全。

优选地，所述3D模型为SkinEthic

优选地，步骤(2)中所述光为紫外光、蓝光和红外光中的至少一种；选择紫外光/蓝光/红外光作为诱导氧化方式，用于评价抗紫外光/蓝光/红外光诱导氧化损伤的产品，从而促进企业开发抵抗光照(紫外光/蓝光/红外光)的皮肤氧化损伤的产品。

进一步优选地，步骤(2)中所述光为280～400nm的紫外光、400～500nm的蓝光和500～1400nm的红外光中的至少一种。

优选地，所述紫外光为UVA和UVB中的至少一种。

优选地，所述UVA的剂量为5～10J/cm

优选地，所述UVA的光照强度为0.5～1.2mW/cm

优选地，所述蓝光的剂量为5～150J/cm

优选地，所述红外光的剂量为10～50J/cm

优选地，所述蓝光的光照强度为50～100mW/cm

优选地，所述红外光的光照强度为100～400mW/cm

优选地，步骤(2)中所述光照射的时间为0.25～166.8min。

优选地，步骤(2)中所述光为UVA时，所述光照射的时间为36～166.8min；所述光为UVB时，所述光照射的时间为0.25～25min；所述光为蓝光时，所述光照射的时间为0.8～50min；所述光为红外光时，所述光照射的时间为0.4～8min。

优选地，步骤(2)中还包括如下步骤：空白组进行避光处理，得到空白避光组。

优选地，步骤(3)中还包括如下步骤：孵育空白避光组中皮肤模型，然后检测空白避光组中皮肤模型的指标。

优选地，步骤(3)中所述孵育的条件为36.8～37.2℃、4.5～5.5％CO

优选地，步骤(3)中所述氧化蛋白质含量的检测方法为通过Fluorescein-5-Thiosemicarbazide染色检测，具体如下：将皮肤模型固定、包埋、切片、Fluorescein-5-Thiosemicarbazide染色，对染色后的皮肤模型切片拍摄至少3张图像，从图像上分离样本和背景，通过图像处理软件Image J对荧光图像进行灰度分析，然后计算图像的平均荧光强度，根据平均荧光强度与氧化蛋白质含量的关系确定皮肤模型中的氧化蛋白质含量；以皮肤模型中的氧化蛋白质的含量作为产品抗氧化功效的评价指标，对皮肤模型的纵切片中的氧化蛋白质的含量进行拍照及荧光半定量分析可以有效地帮助评估皮肤受外界环境损伤的严重程度，有效反应产品抗氧化损伤机制，可三维多指标地观察氧化损伤状况；通过荧光半定量分析方法确定氧化蛋白质含量，既实现了检测结果更客观而且氧化蛋白质含量的定量方法更简单，方便，易于操作，可以缩短化妆品的开发周期。

优选地，所述产品抗氧化功效＝((FI

优选地，步骤(3)中所述角质层厚度的检测方法为通过Van Gieson(VG)染色检测，具体如下：将皮肤模型固定、包埋、切片、VG染色，用细胞荧光成像系统分析角质层厚度。

优选地，步骤(3)中所述组织状态的检测方法为通过HE染色检测。

本发明的有益效果是：

本发明提供的评价产品抗氧化功效的方法以氧化蛋白质含量、角质层厚度和组织形态中的至少一种为指标，评价产品的抗氧化和皮肤屏障保护的功效，测试结果更客观；相对于主观评价法，个体差异小；相对于抗氧化自由基的检测方法，更能直接体现产品在皮肤上的抗氧化功效；同时，皮肤模型中的氧化蛋白质的含量可以有效地帮助评估皮肤受外界环境损伤的严重程度，有效反应产品抗氧化损伤机制，可三维多指标地观察氧化损伤状况。

该方法采用3D皮肤模型，可以更大程度地排除个体差异，重复性好，差异小，工作量小；以3D皮肤模型中的氧化蛋白质的含量作为化妆品及原料抗氧化功效的评价指标，通过紫外/蓝光/红外作为诱导氧化方式，用于评价抗紫外/蓝光/红外诱导氧化损伤的产品(化妆品原料、化妆品中间组合物或化妆品)，可以更全面、更客观地评估产品的抗氧化功效。

附图说明

图1是不同产品对3D皮肤模型中角质层厚度的影响效果图：P***表示两者有极其显著的统计学差异(P<0.001)。

图2是不同产品处理3D皮肤模型后的组织染色图。

图3是不同产品对角质层中氧化蛋白质含量的影响图：P***表示两者有极其显著的统计学差异(P<0.001)。

图4是不同产品处理角质层细胞后氧化蛋白质荧光强度图：其中，A是阴性对照(UVB-)组的氧化蛋白质荧光强度图；B是空白对照(UVB+)组的氧化蛋白质荧光强度图；C是UVB+APM组的氧化蛋白质荧光强度图；D是UVB+晚霜组的氧化蛋白质荧光强度图；E是UVB+对照基质组的氧化蛋白质荧光强度图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本实施例中评价产品抗氧化功效的方法为：利用光照诱导载体(以3D皮肤模型为载体)氧化，以载体中氧化蛋白质含量及角质层厚度为指标，评价产品的抗氧化功效。

实验试剂：2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)(北京索莱宝科技有限公司)；荧光素-5-氨基硫脲(Fluorescein-5-Thiosemicarbazide，FTSC)(Thermo fisher)；维生素C磷酸酯镁(APM)(上海麦克林生化科技有限公司)；二甲苯(百灵威科技有限公司)；多聚甲醛，VanGieson(VG)染色液，苏木精染色液，伊红染色液，D-PBS(北京索莱宝科技有限公司)；SkinEthic

实验仪器：ME204E电子分析天平(METTLER TOLEDO)；EVOS M5000荧光倒置显微镜(Thermofisher)；细胞光毒性实验检测仪(天津开发区合普工贸有限公司)；二氧化碳培养箱(Thermofisher)；超净工作台(Thermofisher)；冷冻切片机(莱卡)。

一种评价产品抗氧化功效的方法，包括如下步骤：

(1)将SkinEthic

(2)用新鲜培养基(SkinEthic

表1产品施用信息表

注：表1中的心维雅滋润晚霜为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜，批号为18H21DAP01；对照基质为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜去除功效组分(五味子提取物、氢化葡萄籽油、氢化葵花籽油、生育酚乙酸酯、霍霍巴籽油和水解大麦蛋白)，剩余非功效组分(矿油、甘油、肉豆蔻酸异丙酯、C12-18烷基葡糖苷、丙烯酸(酯)类共聚物、苯氧乙醇、尿囊素、三乙醇胺、香精)且重量比不变的配方；抗氧化组方由以下重量百分比的组分组成，8％的五味子(schisandra chinensis)果提取物、2％的大豆提取物(GLACINE MAXEXTRACT)和余量的溶剂，溶剂由重量比为0.1:2的辛酸和葵酸甘油三酯组成。

(3)细胞模型固定化：用手术刀分别将不同处理的皮肤模型取下，转移至离心管中，加入4％多聚甲醛溶液(用PBS配制4％多聚甲醛溶液)，将皮肤模型固定化；

(4)对皮肤模型进行石蜡包埋，然后在冷冻切片机中切片(每个样本切3片组织分析)，烤干切片，分别对切片进行HE染色、FTSC染色、VG染色；

(5)用荧光显微镜进行观察FTSC染色情况，每个皮肤模型切片至少各拍摄3张图像，从图像上分离样本和背景，通过图片处理软件(Image J)对绿色荧光图片进行灰度分析，然后计算该图片的平均荧光强度，从而反应细胞内氧化蛋白质(即羰基蛋白)含量；

平均荧光强度：对于一张单通道(单色)的荧光图片，每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小，特定区域的荧光强度公式：平均荧光强度(Mean)＝该区域荧光强度总和(IntDe n)/该区域面积(Area)；

产品抗氧化功效＝((FI

各种处理的产品抗氧化功效值如表2所示、FTSC染色图如图2所示：通过FTSC染色后的绿色荧光可明显看出：与空白避光组(阴性对照、UVB-)相比，空白光照射组(空白对照、UVB+)有引起的损伤，绿色荧光位置越深，表示UVB对皮肤模型的损伤越深入；绿色荧光强度越强，表示UVB照射引起皮肤模型组织氧化更严重；维生素C磷酸酯镁、五味子精炼油、抗氧化组方和心维雅滋润晚霜对皮肤模型有不同程度的抗氧化作用，其绿色荧光在皮肤模型中位置较空白光照射组(空白对照、UVB+)更浅，荧光强度亦更弱；其抗氧化功效值由大到小依次为：维生素C磷酸酯镁、五味子精炼油、心维雅滋润晚霜、抗氧化组方。

表2原料与化妆品产品对抗UVB导致3D皮肤模型氧化压力效果

注：P<0.05(P*)表示与空白光照射组(空白对照)相比有统计学差异，P<0.01(P**)表示与空白光照射组(空白对照)相比有显著统计学差异，P<0.001(P***)表示与空白光照射组(空白对照)相比有极其显著的统计学差异；

表2中的心维雅滋润晚霜为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜，批号为：18H21DAP01；对照基质为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜去除功效组分(五味子提取物、氢化葡萄籽油、氢化葵花籽油、生育酚乙酸酯、霍霍巴籽油和水解大麦蛋白)，剩余非功效组分(矿油、甘油、肉豆蔻酸异丙酯、C12-18烷基葡糖苷、丙烯酸(酯)类共聚物、苯氧乙醇、尿囊素、三乙醇胺、香精)且重量比不变的配方；抗氧化组方由以下重量百分比的组分组成，8％的五味子(schisandra chinensis)果提取物、2％的大豆提取物(GLACINE MAXEXTRACT)和余量的溶剂，溶剂由重量比为0.1:2的辛酸和葵酸甘油三酯组成。

用EVOS

HE组织染色结果如图2所示：与空白避光组(阴性对照、UVB-)相比，空白光照射组(空白对照、UVB+)照射引起角质脱离，细胞损伤；心维雅滋润晚霜与对照基质相比较，对照基质的细胞损伤较心维雅滋润晚霜组更为严重；与空白光照射组(空白对照、UVB+)相比，维生素C磷酸酯镁、五味子精炼油和心维雅滋润晚霜对3D皮肤模型有较好的保护作用。

上述实验结果可知：紫外照射后，皮肤模型受到氧化损伤，维生素C磷酸酯镁、心维雅滋润晚霜、五味子精炼油、抗氧化组方处理后，在显著降低组织中氧化蛋白质含量的同时，也显著增加了角质层的更新速度和角质层厚度，增强皮肤屏障功能；而溶剂和晚霜对照基质则无相应改善；表明本实施例提供的方法可用于评价产品抗氧化功效。

实施例2

本实施例中评价产品抗氧化功效的方法为：通过产品对人体角质层的作用，检测其抗氧化功效。

实验试剂：D-PBS，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)(北京索莱宝科技有限公司)；维生素C磷酸酯镁(APM)(上海麦克林生化科技有限公司)；Fluorescein-5-Thiosemicarbazide，FTSC(Thermo fisher)；二甲苯(阿拉丁试剂有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司。

实验仪器：ME204E电子分析天平、pH计(METTLER TOLEDO)；荧光倒置显微镜(Zeiss)、紫外照度计(台湾路昌)。

试剂配制：分别配制0.1M MES-Na缓冲液(pH 5.5)，FTSC溶液(将FTSC溶于DMSO中，配制成20mM，-20℃保存备用。用0.1M的MES-Na缓冲液稀释1000倍使用，终浓度为20μM)。

一种评价产品抗氧化功效的方法，包括如下步骤：

(1)征得三名志愿者同意实验，分别在每名上臂内侧使用胶带剥落法采集皮肤角质层，将含皮肤角质层胶带分剪裁成1.5cm×1.5cm大小，共8组，分别贴附于8块载玻片上；3名志愿者总计24块载玻片；

(2)将粘有皮肤角质层的载玻片放入二甲苯浸渍一晚，再用新鲜二甲苯分别浸泡1h；

(3)取出粘有皮肤角质层的载玻片，挥干二甲苯后，分别对角质层进行处理(包括阴性对照(UVB-)、空白对照(UVB+)、阳性对照(UVB+APM)、化妆品产品及其对照(UVB+晚霜、UVB+对照基质)和化妆品原料及其对照(UVB+五味子精炼油、UVB+抗氧化组方、UVB+溶剂))，各处理的产品施用信息如表3所示)，即在角质层处分别滴加100μL产品，37℃湿润环境下孵育3h后，照射组采用UVB(311nm)照射角质层，强度为1.8mW/cm

表3产品施用信息表

注：表3中的心维雅滋润晚霜为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜，批号为18H21DAP01；对照基质为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜去除功效组分(五味子提取物、氢化葡萄籽油、氢化葵花籽油、生育酚乙酸酯、霍霍巴籽油和水解大麦蛋白)，剩余非功效组分(矿油、甘油、肉豆蔻酸异丙酯、C12-18烷基葡糖苷、丙烯酸(酯)类共聚物、苯氧乙醇、尿囊素、三乙醇胺、香精)且重量比不变的配方；抗氧化组方由以下重量百分比的组分组成，8％的五味子(schisandra chinensis)果提取物、2％的大豆提取物(GLACINE MAXEXTRACT)和余量的溶剂，溶剂由重量比为0.1:2的辛酸和葵酸甘油三酯组成。

(4)照射/避光处理后，将粘有皮肤角质层的载玻片移至37℃湿润环境中孵育24h；孵育结束后，用蒸馏水或二甲苯洗去产品，放入0.1M MES-Na缓冲液(pH5.5)中润洗；将载玻片放入20μM FTSC中，室温下避光放置反应1h；取出载玻片，用D-PBS冲洗干净，避光风干10min；用荧光显微镜进行观察，每个样本各拍摄3张图像，通过图片处理软件(Image J)对绿色荧光图片进行灰度分析，然后计算该图片的平均荧光强度，从而反应细胞内氧化蛋白质(即羰基蛋白)含量。

平均荧光强度：对于一张单通道(单色)的荧光图片，每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小，特定区域的荧光强度公式：平均荧光强度(Mean)＝该区域荧光强度总和(IntDe n)/该区域面积(Area)；

产品抗氧化功效＝((FI

各处理的产品抗氧化功效值如表4所示、各处理的平均荧光强度(氧化蛋白质含量)如图3所示、FTSC染色图如图4所示：与空白避光组(阴性对照、UVB-)相比，UVB照射后空白光照射组(空白对照、UVB+)，角质层细胞中羰基蛋白含量显著增加，UVB照射诱导氧化模型建立成功；维生素C磷酸酯镁、五味子精炼油、抗氧化组方和心维雅滋润晚霜处理后，羰基蛋白含量降低，对角质层有不同程度的抗氧化作用，其抗氧化功效值由大到小依次为：维生素C磷酸酯镁、心维雅滋润晚霜、五味子精炼油、抗氧化组方；并且原料组(五味子精炼油、抗氧化组方)分别与溶剂相比，原料组的抗氧化功效值显著大于溶剂，即原料组可显著降低羰基蛋白含量；晚霜与对照基质相比，晚霜组的抗氧化功效值显著大于对照基质，即晚霜可显著降低羰基蛋白质含量；本实施例采用人体角质层进行产品抗氧化功效评价，结果与实施例1的评价结果相似，进一步表明本申请提供的方法可用于评价化妆品原料及成品抗氧化功效。

表4原料与化妆品产品对抗UVB导致氧化压力效果

注：P<0.05(P*)表示与空白光照射组(空白对照)相比有统计学差异，P<0.01(P**)表示与空白光照射组(空白对照)相比有显著统计学差异，P<0.001(P***)表示与空白光照射组(空白对照)相比有极其显著的统计学差异；

表4中的心维雅滋润晚霜为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜，批号为：18H21DAP01；对照基质为无限极(中国)有限公司的心维雅滋润晚霜去除功效组分(五味子提取物、氢化葡萄籽油、氢化葵花籽油、生育酚乙酸酯、霍霍巴籽油和水解大麦蛋白)，剩余非功效组分(矿油、甘油、肉豆蔻酸异丙酯、C12-18烷基葡糖苷、丙烯酸(酯)类共聚物、苯氧乙醇、尿囊素、三乙醇胺、香精)且重量比不变的配方；抗氧化组方由以下重量百分比的组分组成，8％的五味子(schisandra chinensis)果提取物、2％的大豆提取物(GLACINE MAXEXTRACT)和余量的溶剂，溶剂由重量比为0.1:2的辛酸和葵酸甘油三酯组成。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。