一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒

摘要

本发明涉及一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒。速测方法：提供植物油料油脂样品的甾醇提取溶液，用甾醇提取液稀释用缓冲液稀释得到样液，取样液加入到甾醇测试板中，加入甾醇氧化酶进行振荡反应，基于甾醇测试板的溶液颜色深浅与甾醇含量成正相关，获得植物油料油脂甾醇含量。本发明的方法操作简便、测试速度快，费用低，适用于植物油料油脂中甾醇含量的快速检测，为高甾醇材料筛选、品种选育和加工企业原料产品质量控制提供技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于农产品质量安全检测领域，具体涉及一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒。

背景技术

中国是油料油脂的生产大国和消费大国，植物油料油脂是人类膳食甾醇的主要来源，其提供的植物甾醇占膳食甾醇总摄入量40％，因此测定植物油料油脂中的甾醇含量具有重要意义。

植物甾醇是以环戊烷多氢菲为骨架的三萜类化合物，是油料作物的一组特异性次生代谢物，广泛存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中。目前已报道的植物甾醇超过200多种，其中以β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇最为常见。植物甾醇是植物在生长过程中产生的一种次级代谢产物，具有降低胆固醇、抗氧化、抗炎症、增强免疫力等作用，对心血管疾病、癌症等慢性疾病具有很好的预防及治疗效果，受到国内外学者的广泛关注。植物甾醇在植物油中的含量和组成能够反映油料的种类。植物甾醇在不同油料作物和植物油中的组成和含量不同，因此可将其作为衡量植物油品质的特异性标志物。

目前，油料油脂中甾醇含量测定大多采用GC、GC-MS、HPLC或HPLC-MS等检测技术，实现甾醇分量以及甾醇总量的准确测定，上述方法检测准确、灵敏度高，广泛应用于油料油脂中甾醇的定性定量分析以及基于甾醇组成的食用油掺伪鉴别等。但这些方法需要借助大型仪器，耗时较长、成本高，无法实现快速检测。因此，急需一种现场快速检测植物油料油脂甾醇检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法及速测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种植物油料油脂甾醇含量速测试剂盒，包括甾醇提取液稀释用缓冲液、甾醇氧化酶和甾醇测试板，所述甾醇氧化酶用于催化提取液中甾醇产生过氧化氢，所述甾醇测试板中固定有冻干显色剂，所述的冻干显色剂包括辣根过氧化物酶、柠檬酸、冻干保护剂和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，质量比为：8～250；3.5～10.5；0.6～3.0；15～50；所述的冻干保护剂由蔗糖和牛血清白蛋白以及，吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)组成。

按上述方案，所述冻干保护剂中：蔗糖；牛血清白蛋白；吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)为0.3～1.5；0.15～0.75；0.15～0.75。

按上述方案，甾醇提取液稀释用缓冲液为：0.05～0.10mol/L pH 7.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液。

按上述方案，所述的冻干显色剂为由辣根过氧化物酶水溶液、柠檬酸水溶液、3,3',5,5'- 四甲基联苯胺(TMB)无水乙醇溶液和含蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)的溶液混合冻干得到。

具体制备方法如下：配置辣根过氧化物酶水溶液，柠檬酸水溶液，冻干保护液， 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液，混合，冻干，混合体系中：各物质的浓度范围：8 ～250mg/mL，3.5～10.5mg/ml，0.6～3.0mg/mL，15～50mg/mL；所述的冻干保护液中各组分的浓度为：0.3～1.5mg/mL蔗糖、0.15～0.75mg/mL牛血清白蛋白、0.15～0.75mg/mL 吐温20或0.15～0.75mg/mL十二烷基苯磺酸钠。

按上述方案，所述的甾醇测试板上设有微孔；所述的真空冷冻干燥为：直接置于甾醇测试板上的微孔中冻干，得到装载有冻干显色剂的甾醇测试板。

一种植物油料油脂甾醇含量的速测方法，步骤如下：提供植物油料油脂样品的甾醇提取溶液，用甾醇提取液稀释用缓冲液稀释得到样液，取样液加入到植物油料油脂甾醇含量的甾醇测试板中，加入甾醇氧化酶进行振荡反应，基于甾醇测试板的溶液颜色深浅与甾醇含量成正相关，获得植物油料油脂甾醇含量；

其中：所述甾醇测试板中固定有冻干显色剂，所述的冻干显色剂包括辣根过氧化物酶、柠檬酸、冻干保护剂和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，质量比为8～250：3.5～10.5：0.6～3.0：5～ 50；所述的冻干保护剂由蔗糖和牛血清白蛋白以及，吐温20或十二烷基苯磺酸钠组成。

按上述方案，所述振荡反应时间30～60min，振荡反应温度为37～42℃。

按上述方案，所述样液的用量为100～150μL。

按上述方案，所述甾醇氧化酶的用量为10～50μL，浓度为15～25U/mL。

按上述方案，所述植物油料油脂样品为：油菜、花生、大豆等植物油料样品以及食用植物油样品。

按上述方案，样品提取方法可根据检测需要进行选择。

具体地，所述的植物油料油脂甾醇含量检测中：

提取植物油料油脂样品中的总甾醇，进行样品中甾醇总量的检测；

或提取植物油料油脂样品中的游离甾醇，进行样品中游离甾醇含量的检测。

按上述方案，所述的甾醇氧化酶为胆固醇氧化酶，酶活力≥25U/mg，具体可采用重组大肠杆菌表达的胆固醇氧化酶。

按上述方案，所述的定量检测为用标准品β-谷甾醇浓度建立标准工作曲线，将待测样品检测信号代入标准曲线可直接得到样品中甾醇含量。

按上述方案，定量检测具体为：使用酶标仪检测，基于酶标仪检测OD值和标准品甾醇浓度绘制标准曲线，基于标准曲线定量检测获得甾醇含量。

按上述方案，所述的酶标仪检测特征波长为450nm。

油料油脂中甾醇含量测定大多采用GC、GC-MS、HPLC或HPLC-MS等检测技术，进行甾醇分量以及甾醇总量的测定，但这些方法需要借助大型仪器，耗时较长、成本高，无法实现快速检测。甾醇结构与胆固醇类似，现有技术偶有利用胆固醇氧化酶检测甾醇的方法的报道，但反应步骤多，时间长，且检测试剂均需现配现用、无法满足现场快速检测的需求。

本发明通过将辣根过氧化物酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺配合柠檬酸水溶液、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)获得缓冲反应体系，混合冻干获得冻干显色剂，多组分、多体系试剂高效共存，利用甾醇氧化酶，具体可使用胆固醇氧化酶(植物甾醇结构与胆固醇相似)，催化β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等植物甾醇产生过氧化氢，过氧化氢催化甾醇测试板中显色剂辣根过氧化物酶和3,3',5,5'-四甲基联苯胺产生可溶性蓝色产物，基于甾醇测试板的溶液颜色深浅与甾醇含量成正相关，达到快速检测的目的。本发明同时也可提高辣根过氧化物酶和TMB显色组分的保存稳定性等，最终实现了检测物油料油脂甾醇含量的快速检测，解决了现有技术存在的显色剂配制组分多、相互干扰、不稳定和现配现用、检测效率低等问题。

本发明的有益效果：

1.本发明将辣根过氧化物酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺配合柠檬酸水溶液、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基苯磺酸钠(SDS)等组分混合冻干获得冻干显色剂，多组分、多体系试剂高效共存，进而提供的速测试剂盒用于甾醇含量检测，提高了检测效率，也提高了检测试剂的保存稳定性。

2.本发明建立的油料油脂中甾醇的酶法检测方法操作简便、测试速度快，费用低，适用于植物油料油脂中甾醇含量的快速检测，为高甾醇材料筛选、品种选育和加工企业原料产品质量控制提供技术支撑。

附图说明

图1为植物油料油脂甾醇含量标准曲线，横坐标为标准品浓度，纵坐标为酶标仪检测OD值。

具体实施方式

实施例1植物油料油脂甾醇含量速测试剂盒：

植物油料油脂甾醇含量速测试剂盒，包括甾醇提取液稀释用缓冲液、甾醇氧化酶和甾醇测试板。

所述甾醇氧化酶用于催化提取液中甾醇产生过氧化氢，具体可为胆固醇氧化酶，酶活力≥25U/mg，可采用重组大肠杆菌表达的胆固醇氧化酶。

所述的甾醇提取液稀释用缓冲液为：0.10mol/L pH 7.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液。

所述甾醇测试板中装载有冻干显色剂；所述的冻干显色剂为由辣根过氧化物酶水溶液、柠檬酸水溶液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇溶液和含蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基苯磺酸钠的溶液混合冻干得到，其中：辣根过氧化物酶(CAS：9003-99-0，15KU)、柠檬酸、冻干保护剂和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(CAS：54827-17-7)质量比为90、 7.5、2.5、40；冻干保护剂中：蔗糖、牛血清白蛋白、十二烷基苯磺酸钠(SDS)质量比为0.7、0.55、0.5，制备方法如下：配置辣根过氧化物酶水溶液，柠檬酸水溶液，冻干保护液，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液，混合，冻干，混合体系中：各物质的浓度范围：50mg/mL，5.5mg/ml，1.5mg/mL，25mg/mL；其冻干保护液由0.5mg/mL蔗糖、0.75 mg/mL牛血清白蛋白、0.75mg/mL吐温20水溶液组成。冷冻干燥所得显色剂呈白色海绵状，疏松多孔，在加入样液后5秒溶解迅速，用梯度过氧化氢溶液测试冻干前后溶液，冻干前后显色剂溶液的OD值相关系数R

用乙醇配置梯度β-谷甾醇(0.136mg/mL～13.6mg/mL)标准溶液，取5μL梯度标准溶液加入到200μL 0.10mol/L pH 7.0 2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液中混匀制得梯度样液。取100 μL样本加入到甾醇测试板微孔中，加入甾醇氧化酶25μL，浓度25U/mL，42℃恒温振荡反应30min，形成蓝色有色产物，采用酶标仪450nm检测，以酶标仪检测OD值和标准品浓度绘制标准曲线，信号与浓度呈正相关，线性方程为：Y＝0.1557X+0.0231相关系数 R

实施例2植物油料油脂甾醇含量速测试剂盒：

与实施例1的不同是：

所述的甾醇提取液稀释用缓冲液为：0.05mol/L pH 7.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液。

所述的冻干显色剂为由辣根过氧化物酶水溶液、柠檬酸水溶液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺无水乙醇溶液和含蔗糖、牛血清白蛋白、吐温20或十二烷基苯磺酸钠的溶液混合冻干得到，其中：辣根过氧化物酶(CAS：9003-99-0，15KU)、柠檬酸、冻干保护剂和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)(CAS：54827-17-7)质量比为90、7.5、2.5、40；冻干保护剂中：蔗糖、牛血清白蛋白、十二烷基苯磺酸钠(SDS)质量比为0.7、0.55、0.5，制备方法如下：配置辣根过氧化物酶水溶液，柠檬酸水溶液，冻干保护液，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液，混合，冻干，混合体系中：各物质的浓度范围：90mg/mL，7.5mg/ml，2.5mg/mL， 40mg/mL；其冻干保护液由0.7mg/mL蔗糖、0.55mg/mL牛血清白蛋白、05mg/mL吐温20 水溶液组成。冷冻干燥所得显色剂呈白色海绵状，疏松多孔，在加入样液后3s溶解迅速，用梯度过氧化氢溶液测试冻干前后溶液，冻干前后显色剂溶液的OD值相关系数R

标曲建立：用乙醇配置梯度β-谷甾醇(0.136mg/m L～13.6mg/mL)标准溶液，取5μL梯度标准溶液加入到200μL0.05mol/L pH 7.0 2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液中混匀制得梯度样液。取150μL样本加入到甾醇测试板微孔中，加入甾醇氧化酶25μL，酶浓度25u/mL，42℃恒温振荡反应30min，形成蓝色有色产物，采用酶标仪450nm检测，以酶标仪检测OD值和标准品浓度绘制标准曲线，相关系数R

实施例3

1.油菜籽中甾醇含量检测

筛选10份油菜籽，分别采用速测方法和GC-MS方法对油菜籽甾醇总量进行测定。

油菜籽甾醇总量提取：取200mg磨碎的样品于试管中，加入配制的含2mol/L KOH的90％乙醇溶液2mL，涡旋振荡1min混匀后置于75℃超声波中处理30min，后冷却至室温，加入正己烷1mL，超纯水2mL，混合均匀，取上清于10mL试管中，重复提取三次，氮吹近干，加入150μL无水乙醇复溶，得甾醇提取液。

油菜籽甾醇总量检测：取20μL甾醇提取液，到480μL 0.05mol/L pH 7.0 2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液中混匀制得检测样液。取150μL样本加入到实施例1甾醇测试板微孔中，加入甾醇氧化酶30μL，酶浓度25U/mL，42℃恒温振荡反应45min，形成蓝色有色产物，加入50μL 2mol/L浓硫酸终止反应形成黄色有色产物，采用酶标仪450nm检测，得到样品溶液 OD值。代入标准工作曲线计算样品甾醇含量。。

两种方法比对结果见表1，两种方法检测结果相对误差在±10％以内，相对于GC-MS 方法而言，速测方法测定无需衍生，借助甾醇速测板可实现大量样本的同步检测，耗时短、效率高，且操作简便、成本较低，更适用于油料油脂中甾醇的现场快速检测。

表1油菜籽中甾醇总量速测方法与GC-MS方法比较

2.菜籽油中游离甾醇含量检测

筛选10份菜籽油，分别采用速测方法和GC-MS方法对菜籽油中游离甾醇含量进行测定。

游离甾醇提取：准确称取0.05g油样，用5mL正己烷溶液溶解，涡旋振荡均匀，备用。

SPE柱的活化：称取1.0g无水硫酸钠加到二氧化硅固相萃取柱(0.5g/6mL)的上方，然后用10mL正己烷溶液活化，流速1.5mL/min，弃去流出液；上样：将5mL样品液注入到SPE柱中，控制流速1.2mL/min，弃去流出液；淋洗：用10mL体积分数5％乙醚-正己烷溶液进行淋洗，除去甘油三酯和甾醇酯类化合物，流速控制在1.2mL/min，弃去流出液；洗脱：用10mL体积分数为20％乙醚-正己烷溶液洗脱游离甾醇并收集于洁净干燥的试管中，流速控制在1.5mL/min。

游离甾醇含量检测：取20μL甾醇提取液，到380μL 0.05mol/L pH 7.0 2-(N-吗啉代)乙磺酸水溶液中混匀制得检测样液。取100μL样本加入到甾醇测试板微孔中，加入甾醇氧化酶 30μL，酶浓度25u/mL，42℃恒温振荡反应45min，形成蓝色有色产物，加入50μL 2mol/L浓硫酸终止反应形成黄色有色产物，采用酶标仪450nm检测，得到样品溶液OD值。同时用β-谷甾醇建立标准工作曲线，将样品溶液OD。代入标准工作曲线计算样品甾醇含量。

两种方法比对结果见表2，两种方法检测结果相对误差在±10％以内，速测方法准确、简便、高效，能够实现大批量样本的同步快速检测，适用于高甾醇材料筛选、品种选育和加工企业产品质量控制。

表2菜籽油中游离甾醇含量速测方法与GC-MS方法比较