一种适用于东亚地区广泛人群的抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞普适性检测技术方案

摘要

本发明公开了一种抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞的检测技术方案，能普适性检测东北亚和东南亚地区广泛人群的特定抗原的特异性胸腺依赖性淋巴细胞功能；该技术方案所用的特定抗原的广谱T细胞表位肽库包含被东北亚人群中等位基因频率大于1％的13种HLA‑A分子、25种HLA‑B分子和14种HLA‑C分子所提呈的特定抗原T细胞表位肽；这些种优势HLA‑A、B、C分子的总基因频率分别占中国人群的95.5％、94％和78％左右，在东北亚和东南亚人群中的总基因频率与中国人群相似；因此该技术方案能适用于该地区绝大多数个体的检测，能满足临床实验室的需要，将为病毒感染患者或癌症患者的临床疗效评价、预后与复发判断、指导后续治疗方案以及机体免疫发病机制研究等提供精准的免疫学指标。

说明书

技术领域

本发明属于医学免疫学和免疫学检验技术领域，具体涉及一种包括中国在内的东北亚和东南亚地区广泛人群的检测抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞的普适性技术方案及其应用。

背景技术

1、抗原特异性T细胞免疫的抗病毒感染和抗肿瘤作用及其检测的临床价值：

1.1抗原特异性T细胞反应影响病毒感染和肿瘤的疾病进程：

现代免疫学认为抗原特异性T细胞是介导适应性免疫应答的核心细胞，在抗病毒感染和抗肿瘤中起着主要作用，与抗体介导的体液免疫发挥协同效应，共同构成机体抗病毒和抗肿瘤的主要免疫机制。T细胞膜上的T细胞受体(T cell receptor,TCR)能够特异性识别并结合抗原递呈细胞或靶细胞表面HLA分子与抗原肽的复合物，即抗原肽/HLA复合体分子。病毒感染细胞或肿瘤细胞将胞内病毒抗原或肿瘤抗原加工处理成T细胞表位肽，与HLA分子结合后提呈到膜表面。CD8

1.2抗原特异性T细胞影响临床治疗的效果和预后与复发：

对病毒感染和肿瘤的诸多临床治疗会影响和改变个体内抗原特异性T细胞反应的应答强度，影响着最终的疗效，尤其是免疫治疗。抗原特异性T细胞反应或免疫功能的动态变化与预后复发有显著相关性。例如：在乙肝患者中，核苷类药物只能暂时性地增强慢性患者体内HBV抗原特异性的CD4

1.3抗原特异性T细胞检测有非常重要的临床意义：

综上所述，抗原特异性T细胞的检测在即时直接地评价病毒感染和肿瘤的免疫治疗效果，预测其他传统疗法的预后和复发以及病毒-机体和肿瘤-机体免疫互作机制的研究中据哦有重要的临床价值。

2、抗原特异性T细胞检测技术的难点、现状和不足：

尽管部分实验室可以检测患者整体T细胞库中活化/增殖T细胞、调节性T细胞和功能耗竭性T细胞等功能亚型的频率变化，但不能对群监测广泛患者群个体化的抗原特异性T细胞免疫功能的变化，因为国内外至今没有适用于广泛患者群的普适性检测技术与试剂，更没有符合中国人群HLA多态性的试剂与参考值，因此严重阻碍了临床医师对免疫治疗效果的即时和直接评价，也阻碍了对传统治疗预后与复发的早期预判以及对病毒-人体和肿瘤-人体的免疫互作机制研究。

表1抗原特异性T细胞检测技术的难点、现状和不足

如上表所示，与抗原和抗体的定量检测相比，抗原特异性T细胞的检测则困难很多，主要受两方面因素限制。目前应用较多的抗原特异性T细胞检测技术有两类：一是pMHC多聚体荧光染色法，最具特异性；二是利用CD8

2.1人群中HLA的高度多态性严重制约了检测方法的普适性：

MHC基因系统编码人类主要组织相容性抗原(HLA)，负责将抗原肽(T细胞表位肽)提呈给T细胞，启动机体的适应性免疫应答。其中HLA-A、B、C等I类分子提呈抗原肽激活CD8

尽管人们对病毒抗原和肿瘤抗原的研究很多，但是对这些抗原中被各种HLA分子提呈的T细胞表位(抗原肽)的研究却很少，被报道的表位肽不能覆盖特定地区人群的HLA多态性，因此无法制备ELISpot、FluoroSpot或ICS等方法的普适性检测试剂。比如在过去33年中乙肝病毒抗原被研究证实的T细胞表位仅205种CD8

2.2抗原中T细胞表位肽的丰富性严重制约了检测方法的标准化：

病毒抗原和肿瘤抗原中刺激T细胞反应的表位肽种类众多，数量无法确定，因此无法建立一个完全标准的抗原肽库来检测患者个体化的特异性T细胞克隆库。目前多数研究者只能采用少数几种已知的表位肽，对携带特定HLA分子的少数患者进行检测，不能充分体现患者肿瘤抗原特异性T细胞克隆库的功能状态。有些研究者则采用覆盖肿瘤抗原全长的重叠肽库或计算机模拟的预测肽库对广泛肝癌患者进行检测。重叠肽一般设计为间隔5-8个氨基酸的重叠长肽(15-19aa/肽)，预测肽大多是CD8

2.3pMHC多聚体染色法和基因组学新技术难以临床推广：

pMHC多聚体染色法最具特异性，因为T细胞的特异性体现在TCR与pMHC复合体的特异性结合，但制备技术困难，成本高昂，稳定期短，很难制备出囊括众多不同HLA分子和众多T细胞表位肽的数百种pMHC多聚体库来检测广泛的临床患者。单细胞表达谱测序和TCR基因测序等已用于分析体内抗原特异性T细胞库的克隆特征，但在成本和技术两方面都难以普及，对结果的分析和临床意义解读难以具体化和简单化。

由于上述制约，目前的检测系统既不能适用于广泛患者，又不能检测很多的特异性T细胞克隆，长期以来成为一个技术瓶颈和难题。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了适用于东亚地区广泛人群的病毒抗原或肿瘤抗原特异性T细胞的普适性检测技术。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明的一个目的是提供一种适用于东亚地区广泛人群的抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞普适性检测技术方案，具体包括以下步骤：

(1)筛选和验证东亚人群中等位基因频率大于1％的所有HLA-A、B、C分子提呈的针对特定病毒抗原或肿瘤抗原的一系列抗原肽：利用多种在线表位预测数据库虚拟预测等位基因频率大于1％的13种HLA-A分子、25种HLA-B分子以及14种HLA-C分子所提呈的针对乙肝病毒抗原(HBsAg、HBeAg、HBpol、HBx)、新型冠状病毒抗原(S、E、N、M和RdRp)或者肝癌相关肿瘤抗原(AFP、GPC3、SART2/3、SSX2、GP73和hTERT等)的候选表位肽。然后利用患者的外周血单个核细胞进行淋巴细胞功能性实验、多肽与细胞株上HLA分子竞争结合实验、分子对接和分子动力学模拟等技术，逐一验证候选表位肽的免疫原性，建立每种优势HLA分子所提呈的阳性表位肽库；

13种HLA-A分子(其在中国人群中的基因总频率大于95％)如下：HLA-A1101、A2402、A0201、A3101、A0206、A0207、A3303、A3001、A0203、A1102、A0301、A0101、A2601等。

25种HLA-B分子(其在中国人群中的基因总频率大于94％)如下：HLA-B4001、B4601、B5801、B5101、B1302、B1501、B1301、B4006、B1502、B3802、B3501、B5401、B5502、B3901、B5201、B4002、B4403、B4801、B0702、B1511、B5102、B2704、B5701、B1527、B3701等。

14种HLA-C分子(其在中国人群中的基因总频率大于78％)如下：HLA-Cw0702、Cw0102、Cw0304、Cw0901、Cw0602、Cw0303、Cw0302、Cw0401、Cw1402、Cw1502、Cw0701、Cw1202、Cw1403、Cw1203等。C后加w是为了与补体相区别。

(2)组建广谱的T细胞表位肽库，以实现普适性检测。优势T细胞表位肽有多层含义：免疫原性强，能被多种优势HLA分子交叉结合，且在多数患者中能检出其特异性T细胞克隆。每种病毒抗原或肿瘤抗原根据序列长短，筛选100-200种表位肽组成广谱的T细胞表位肽库，这些广谱T细胞表位肽分别被上述52种HLA分子提呈的表位肽，并使每种HLA-A/B/C分子交叉结合其中的10-20种表位肽，则每位患者的6种HLA-A/B/C分子能交叉结合其中的60-120种表位肽(平均约90种)。针对4种乙肝病毒、5种新冠病毒抗原或6种肿瘤抗原，则每位患者平均可检测240-480种、300-600种或360-720种的特异性CD8

(3)采购商业化试剂，利用上述特定抗原的广谱T细胞表位肽库的肽池阵列，在微孔反应板中与患者PBMCs共培养，建立酶联免疫斑点法(ELISpot)或者荧光免疫斑点法(FluroSpot)，定量检测分泌IFN-γ的细胞数量。

进一步地，本发明的步骤(3)中，酶联免疫或荧光免疫斑点法也可以替换成磁性微球化学发光法：采购链霉亲和素标记的磁性微球、生物素化的IFN-γ捕获、酶标IFN-γ检测抗体、化学发光底物和IFN-γ标准品等试剂材料，利用上述步骤(2)特定抗原的广谱T细胞表位肽库的肽池阵列，在96孔细胞培养板中与患者PBMCs共培养，收集各孔培养上清作为待测样本。在另一微孔反应板中建立磁性微球化学发光法，检测培养上清中IFN-γ的水平。

进一步地，本发明的步骤(3)中，酶联免疫或荧光免疫斑点法也可以替换成酶联免疫吸附法(ELISA)：采购IFN-γ捕获抗体、生物素化IFN-γ检测抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶、酶底物和IFN-γ标准品等试剂材料，利用上述步骤(2)特定抗原的广谱T细胞表位肽库的肽池阵列，在96孔细胞培养板中与患者PBMCs共培养，收集各孔培养上清作为待测样本。在另一微孔反应板中建立ELISA方法，检测培养上清中IFN-γ的水平。

进一步地，本发明的步骤(3)中，酶联免疫斑点法可以替换成cytometric beadsarray(CBA)与T细胞多色荧光染色联合技术，分析抗原特异性T细胞的功能亚型：利用商业化的CBA单项试剂组装成检测多种分子的套装试剂。将上述步骤(2)特定抗原的肽池阵列与患者PBMCs在96孔细胞培养板中共培养20小时，然后取上清，用CBA试剂和流式细胞分析技术检测患者PBMCs分泌的多种可溶分子的分泌水平；同时取细胞进行多组合的多色荧光单抗染色和流式分析，定量分析抗原特异性T细胞的多种功能亚群频率。

进一步地，患者PBMCs分泌的可溶性分子为人干扰素-γ、人肿瘤坏死因子、人白细胞介素-17、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子β的任一种或多种。

所述发明技术方案可以用来对乙肝病毒感染患者、新冠病毒感染患者或肝细胞癌患者进行普适性检测抗原特异性T细胞的免疫功能状态。检测结果将为患者的临床疗效评价、预后与复发判断、指导后续治疗方案以及机体免疫发病机制研究等提供精准的免疫学指标，为精准免疫治疗提供有力的技术支撑手段。

本发明还有一个目的是提供一种上述的适用于东亚地区广泛人群的抗原特异性胸腺依赖性淋巴细胞检测技术方案在制备检测乙肝病毒抗原、新冠病毒抗原或肝癌相关肿瘤抗原的特异性T细胞检测试剂或试剂盒中的应用。

所述发明技术方案可用于制备检测乙肝病毒抗原、新冠病毒抗原或肝癌相关肿瘤抗原的特异性T细胞检测试剂或试剂盒。

优选地，所述试剂或试剂盒为酶联免疫斑点法试剂或试剂盒，也荧光免疫斑点法试剂或试剂盒、酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂或试剂盒、化学发光法试剂或试剂盒、Cytometric beads array试剂或试剂盒或者T细胞膜荧光染色流式分析法的试剂或试剂盒。

本发明的有益效果为：

1、适用于该地区绝大多数的患者，可进行普适性检测：

本技术方案所采用的广谱T细胞表位肽库适合于检测携带上述52种HLA等位基因的患者。这些基因频率大于1％的13种HLA-A分子、25种HLA-B分子以及14种HLA-C分子在中国人群中的基因总频率分别大于95％，94％和78％，在东北亚人群的基因总频率也与中国人群相似，在东南亚人群大约75-90％左右。即这52种优势HLA分子能覆盖绝大多数包括中国在内的东北亚和东南亚人群，每位患者遗传父母的2种A、2种B和2种C分子都极大可能属于上述52种HLA分子之列。因此，这52种优势HLA分子提呈的T细胞表位肽库具有普适性，可用于该地区广泛群体中不同个体间的检测，不需通过HLA等位基因分型来筛选带特定HLA分子的待检患者。

2、采用广谱T细胞表位肽库可检测众多的特异性T细胞克隆，能充分反映患者个体内针对某特定抗原的特异性T细胞克隆库的免疫功能状态：

每种抗原根据序列长短，筛选100-200种表位肽组成光谱的T细胞表位肽库，这些广谱T细胞表位肽分别被上述52种HLA分子提呈的表位肽，并使每种HLA-A/B/C分子交叉结合其中的10-20种表位肽，则每位患者的6种HLA-A/B/C分子能交叉结合其中的60-120种表位肽(平均约90种)。针对4种乙肝病毒、5种新冠病毒抗原或6种肿瘤抗原，则每位患者平均可检测240-480种、300-600种或360-720种的特异性CD8

3、采用经实验验证的T细胞表位肽组成广谱表位肽库进行个性化检测，而不是重叠肽库或者预测肽库，目前市场上没有普适性检测技术和同类试剂盒。

目前国内外市场上没有针对病毒或肿瘤抗原的普适性抗原特异性T细胞检测试剂盒，更没有符合中国人群HLA多态性的抗原特异性T细胞检测试剂盒和参考值。本技术方案使每位患者根据自己特定的HLA-A、B、C分子和这些分子提呈的T细胞表位肽，个性化检测自己体内的抗原特异性T细胞克隆库的免疫功能状态。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的乙肝病毒抗原特异性T细胞普适性检测方法对慢性乙型肝炎患者进行检测的代表性标本ELSPOT斑点图；

图2为本发明实施例2制备的新冠病毒抗原特异性T细胞普适性检测方法对健康献血者进行检测的代表性标本ELSPOT斑点图；

图3为本发明实施例3制备的肝癌相关肿瘤抗原特异性T细胞普适性检测方法对肝癌患者和健康者进行检测的代表性标本ELISPOT斑点图(A)以及斑点统计图表(B)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

利用该技术方案制备HLA-A分子提呈的乙肝病毒抗原广谱T细胞表位肽库，用于对中国地区广泛乙肝患者进行乙肝病毒特异性T细胞的普适性检测

1)虚拟预测被13种优势HLA-A分子提呈的乙肝病毒抗原的候选T细胞表位库：

①通过UniProt/NCBI和COSMIC等数据库获取乙肝病毒HBsAg、HBeAg(覆盖HBcAg)、HBpol和HBx蛋白的全长氨基酸序列(如下)，通过使用Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis(MEGA7，1.0.0.0version)软件中的ClustalW方法进行多重序列比对，再使用多序列比对与分析软件GeneDoc(2.7.0version)来分析比对结果以获得序列的保守区。以100％，95％，80％为临界点对每个氨基酸的保守性质进行判断。

②利用表2所列表位预测算法和工具，虚拟预测被中国人群中基因频率大于1％的所有13种HLA-A所提呈的表位肽。表位肽长度设为9-mer和10-mer，至少满足3种以上预测算法的评判标准，选取评分排名前5-10的多肽作为候选表位肽，组成候选表位肽库。

四种HBV抗原的氨基酸序列如下：

科学命名的生物属种：病毒目肝炎病毒科肝炎病毒属乙型肝炎病毒种C型

HBsAg(Protein_ID:P31868-1)

HBeAg(Protein_ID:P0C6H5-1)

HBpol(Protein_ID:P0C688-1)

HBxAg(Protein_ID:P0C686-1)

MAARVCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGARLSLRGLPV 60

CAFSSAGPCALRFTSARRMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDW 120

EELGEEIRLMVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFTSA 154

2)利用乙肝患者PBMCs，通过多肽-PBMCs共刺激实验验证候选表位肽的免疫原性：

①从南京市第二医院传染病科收集乙肝患者外周血，常规分离PBMCs冻存备用，另取部分细胞进行HLA-A等位基因分型。

取室温保存的新鲜抗凝全血，用无菌PBS适当稀释；将1倍原血体积的人淋巴细胞分离液(达科为生物，深圳)加入15mL离心管；将稀释后的血液缓缓平铺于分离液上，室温离心20min，2500rpm；吸取单个核细胞(PBMCs)层，离心洗涤2次；用无血清培养基(达科为生物，深圳)重悬，细胞计数，调整细胞浓度为4×10

②HLA-A等位基因分型

取200μL抗凝血，利用人全血基因组DNA提取试剂盒(天根生物，北京)提取基因组DNA；采用HLA-A位点特异性引物A1和A3进行PCR(表3)，扩增A位点的外显子2、内含子2、外显子3以及部分内含子l和3的DNA序列，产物大小为985bp。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s；62℃退火15s；72℃延伸90s；35个循环；72℃延伸5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，并送上海桑尼生物科技公司进行纯化和双向测序。PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技公司。

表2表位肽预测数据库网站

表3 HLA-A位点特异性的PCR扩增引物

通过Lasergene程序的Seqman软件把外显子2和外显子3的测序结果拼成一条完整的HLA-A重叠序列(Contig)，仔细检查双向测序的碱基是否完整一致，找出杂合子的碱基并用兼并碱基代替，例如M表示A和C，R表示A和G，W表示A和T，S表示C和G，Y表示C和T，K表示G和T，最终确定扩增出来的HLA-A等位基因的序列片段。利用Nucleotide BLAST工具，将拼接好的HLA-A碱基序列与数据库中所有HLA-A等位基因的外显子2和外显子3序列进行比对，直到获得完全匹配的基因组合，从而确定HLA-A的等位基因。

③用IFN-γELISPOT法鉴定HBV抗原T细胞表位肽的免疫原性

首先筛选出对混合肽组有阳性反应的HBV慢性感染者：将每种HLA-A分子限制的针对4种HBV蛋白的待鉴定表位肽混合为一组，每组8-9种表位肽；取预包被抗人IFN-γ抗体的ELISPOT板(达科为生物，深圳)，用无血清培养基(200μL/well)活化8min，每孔加入HBV慢性感染者PBMC悬液(100μL/well)；然后在检测孔中补加每种HLA-A分子限制的混合肽，混合肽中单种多肽为1.5μg/孔，在阳性对照孔补加PHA(0.25μg/孔)，在阴性对照孔补加与检测孔相同浓度的DMSO多肽溶解液；置37℃，5％CO

鉴定单种表位肽的免疫原性：重新收集对混合肽有CTL阳性反应的HBV慢性感染者外周血PBMC，加入上述ELISPOT板中，每个检测孔中补加阳性混合肽中的单种HBV多肽(3μg/孔)，同上设置阳性对照孔和阴性对照孔，置37℃，5％CO

3)利用分子对接与分子动力学模拟实验验证阳性表位肽与多种相关HLA-A分子的交叉结合力：

将多肽-PBMCs共刺激实验验证的阳性表位肽进行分类，根据预测的HLA分子限制性和验证试验中患者的真实HLA分子，将每种阳性表位肽可能结合的HLA分子进行列表归类，然后通过Schrodinger Suite中的Glide 5.7模块，将该阳性表位肽分别与相关HLA分子的蛋白晶体结构进行分子对接，利用Desmond模块完成每对分子的动力学模拟，最后根据RMSD结果计算结合自由能(kal/mol)，判断每种阳性表位肽与相关HLA分子的亲和力高低，明确每种表位肽与多种HLA分子的交叉限制性(即一种表位肽能被多种HLA分子结合和提呈)。

4)利用稳定表达特定HLA-A分子的HMy2.CIR细胞株进行HLA分子的多肽竞争结合实验，验证阳性表位肽与多种相关HLA-A分子的交叉结合力：

①HMy2.CIR是HLA I类抗原缺失的人B淋巴母细胞株，本身不表达HLA-A和B分子，仅表达微量的HLA-Cw4分子。本实验室构建了12种分别稳定表达12种优势HLA-A分子的HMy2.CIR细胞株。其主要步骤是：从健康者PBMCs中抽提mRNA，扩增每种HLA-A、cDNA，常规构建pcDNATM3.1/myc-His(-)A重组质粒，电转HMy2.CIR细胞株，G418筛选稳转细胞株，再用HLA-ABC荧光单抗W6/32染色，通过流式技术分选高表达该HLA分子的CIR细胞株进行纯培养，然后测序鉴定。

②将多肽-PBMCs共刺激实验验证的阳性表位肽进行分类，同上将每种HLA分子可能结合的阳性表位肽进行列表归类。将稳定表达特定HLA-A分子的HMy2.CIR细胞株与该HLA分子相关的每种阳性表位肽以及荧光素标记的参考肽共孵育，做竞争结合实验：首先用酸溶液(0.131mol/L枸橼酸和0.061mol/L磷酸氢二钠，PH3.0)洗脱CIR细胞膜上HLA分子结合的多肽，然后用细胞培养液中和，离心洗涤后接种于96孔细胞培养板(1×10

5)组建4种乙肝病毒抗原的广谱T细胞表位肽库，进行抗原肽分组：

①通过IFN-γELISPOT方法从540例HBV慢性感染患者中筛选出215例对HBV混合肽有CTL阳性反应的患者。再重新收集这些患者的PBMC，用ELISPOT法进行单种表位肽免疫原性的验证，然后结合分子对接与分子动力学模拟以及HLA与多肽竞争结合实验的结果，综合分析每种优势HLA-A分子交叉结合的表位肽。最终筛选出103种被13种优势HLA-A分子提呈的优势表位肽组成乙肝病毒抗原的广谱T细胞表为肽库，其中每种优势HLA-A分子能交叉结合的表位肽的数量如表4所示。

②抗原肽分组：将上述103种合成的乙肝病毒抗原用DMSO溶解，按照带电性和来源的抗原种类不同分装8个组(即8个抗原肽库)，每个肽库中包括10种左右的抗原肽，置-80℃保存备用，避免反复冻融。每份血样检测时，每个肽库分别加入一个反应孔中，20μL，每种肽2μg。

表4乙肝病毒抗原的广谱T细胞表位肽库的HLA限制性分布

6)准备ELISPOT微孔反应板：在聚偏二氟乙烯PVDF膜微孔反应板中包被抗人干扰素-γ抗体。具体步骤均在超净工作台中无菌操作：

①活化条板：按需要量取PDVF膜可拆卸条板(BD Bioscience)，每孔加入15μL的35％乙醇，润湿板孔不超过1分钟，然后每孔加入无菌洗涤液200μL，静止1分钟，甩去液体，如此重复洗板5遍，随后放置通风处让乙醇完全蒸发。

②包板：每孔加入100μL包被抗体(人IFN-γ包被抗体工作液；BD Bioscience)，加盖，置湿盒中4℃孵育过夜(至少12小时)。

③洗板：第二天从湿盒中拿出条板，甩去孔中的包被液，每孔再加无菌洗涤液200μL，静止1分钟，甩去液体，如此重复洗板5遍，晾干，放入纯铝箔真空袋(含干燥剂)中，抽真空，封袋，置4℃保存备用。

7)对广泛的乙肝患者进行乙型肝炎病毒特异性T细胞普适性检测：

①分离PBMC：取待检患者的外周抗凝血标本，同上常规分离单个核细胞PBMC，计数并用无血清细胞培养液(达科为生物，深圳)调整细胞浓度为2×10

②加细胞悬液：每份病人血样的PBMC加入10个孔中，100μL/孔(即：4×10

③加抗原肽：每份血样检测10个孔，第1孔不加抗原肽，只补加20μL阴性孔补充液(内含与其他孔相同浓度的DMSO)，为阴性对照孔；第2至第9孔中分别加入抗原肽库1，肽库2，肽库3，肽库4，肽库5，肽库6，肽库7，肽库8，20μL/孔，为检测孔；第10孔加入PHA，为阳性对照孔。

④培养孵育：将条板加盖，放入37℃，5％CO

⑤洗板：从细胞培养箱中取出ELISPOT条板，甩去细胞悬液，每孔加入200μL去离子水，4℃放置10分钟，裂解细胞，弃去离子水。每孔加入200μL洗涤液(1×PBS)，静止1分钟，甩去液体，如此重复洗板5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。

⑥加检测抗体：每孔加入100μL生物素-IFN-γ检测抗体工作液(BD Bioscience)，室温孵育2小时。同上洗板：每孔加入200μL洗涤液(1×PBS)，静止1分钟，甩去液体，如此重复5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。

⑦加HRP-链霉亲和素：每孔加入100μLHRP-链霉亲和素工作液(BD Bioscience)，室温避光孵育1小时。同上洗板5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。

⑧显色：每孔加入100μLAEC显色液(即用即配)，室温避光静置20分钟。然后甩去液体，卸下板底座，用去离子水洗涤PVDF膜的正反面及底座3-5遍，以终止显色。将条板置室温避光处，待自然晾干后装上板底座。

⑨斑点计数：将晾干后的条板用酶联免疫斑点分析仪进行自动拍照和斑点计数。如果斑点数较少，实验者也可在正置光学显微镜下自行计数斑点。

⑩结果判断：

每份标本的斑点数＝(8个实验孔的斑点数总和)-(8个实验孔的本底斑点数)

注：当该实验孔的实际斑点数少于阴性对照孔时，以实际斑点数作为该孔的本底斑点数；当该孔的实际斑点数等于或多于阴性对照孔时，以阴性对照孔的斑点数作为该孔的本底斑点数。

8)个性化检测结果的分析：

①每份标本所得的斑点数代表该患者外周血中4×10

②单次检测结果：斑点数较多时，提示患者HBV特异性T细胞免疫功能较强，说明此时患者体内HBV特异性T细胞被HBV刺激后活化、增殖和杀伤病毒及其感染的肝细胞的能力较强。当斑点数较少时，提示患者特异性T细胞杀伤病毒及其感染的肝细胞的能力较弱。

③动态检测结果：动态分析结果更有意义。每间隔2-3个月对患者进行重复检测，观察患者斑点数在治疗或疾病不同阶段的动态变化。如果斑点数有明显的升高或降低，即使在参考值的中档范围内，仍然能说明患者HBV特异性T细胞免疫功能明显上升或下降，临床应分析其可能的原因及处理措施。

利用本发明技术方案制备的乙肝病毒抗原特异性T细胞普适性检测方法对慢性乙型肝炎患者进行检测的代表性标本ELSPOT斑点图如图1所示。该图是步骤(7)的结果图。用103种乙肝病毒抗原的广谱T细胞表位肽库定量检测慢性乙肝患者PBMCs中HBV特异性T细胞(IFN-γELISpot法)。阴性孔和实验孔：4×10

实施例2：

利用该技术方案制备HLA-A分子提呈的新冠病毒(SARS-CoV-2)抗原的广谱T细胞表位肽库，用于对中国地区广泛患者进行新冠病毒特异性T细胞的普适性检测

1)虚拟预测被13种优势HLA-A分子提呈的新冠病毒候选T细胞表位谱：

①通过UniProt/NCBI等数据库获取SARS-CoV-2多种代表性病毒株以及变种的E、N、M、S和RdRp等5种蛋白的氨基酸序列(如下)，明确其与SARS-CoV及HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63和HCoV-229E等冠状病毒的序列差异位点。

②针对上述5种蛋白序列及其变异和差异区域，利用表1的T细胞表位预测算法，虚拟预测被中国人群中基因频率大于1％的所有13种HLA-A分子所提呈的表位肽。

③HLA-A分子限制性表位肽长度设为9-mer和10-mer，至少满足3种以上预测方法的评分标准，然后选取评分前5-10的多肽作为候选表位肽。

五种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的氨基酸序列如下：

科学命名的生物属种：病毒目冠状病毒科冠状病毒属新型冠状病毒种

E蛋白(envelope protein)(Protein_ID＝YP_009724392.1)：

MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYS 60

RVKNLNSSRVPDLLV 75

M蛋白(membrane protein)(Protein_ID＝YP_009724393.1)：

N蛋白(nucleocapsid protein)(Protein_ID＝YP_009724397.2)：

S蛋白(spike protein)(Protein_ID＝YP_009724390.1)：

RdRp蛋白(RNA-dependent RNA polymerase)(Protein-ID＝YP_009725307.1)：

2)通过改良的DC-多肽-PBL共刺激实验，验证候选表位肽的免疫原性：

①分离献血者PBMC：

在江苏省血液中心收集献血者外周血的白细胞滤盘(400mL外周抗凝血分选红细胞中使用后丢弃的白细胞过滤盘)，酒精消毒后剪开进出口管，用注射器从滤盘的出口向内推送300mL PBS，从进口收集细胞悬液，室温离心，用PBS适当稀释细胞沉淀，用人淋巴细胞分离液常规分离PBMC，用无血清1640细胞培养液重悬细胞备用。

②诱导DC并冻存PBL：

将献血者PBMC接种细胞培养瓶，37℃孵育约4h，收集不贴壁细胞，补加10％胎牛血清培养过夜，第二天冻存PBL备用；同时将贴壁细胞用含10％澳胎血清的1640培养液继续培养7天，期间第1、3、5天加入GM-CSF(1000IU/mL)和rIL-4(500IU/mL)，第5天加LPS(1μg/mL)刺激DC成熟，第7天收获DC，用5种荧光单抗染色(CD83\CD80\CD86\DR\ABC)，流式分析成熟DC的百分率。

③改良的DC-多肽-PBL共刺激培养：

即对常规的DC负载多肽后与T细胞共培养实验进行改良：利用PBMC诱导培养DC 7天，然后与提前一天复苏的同一献血者PBL(去除贴壁单核细胞后的外周血淋巴细胞群，包含B细胞)以及该献血者HLA分子所对应的单种候选表位肽在48孔板中共培养14天。期间，第1天表位肽先与DC孵育2h，然后并不除去表位肽，而且在第7天再补加表位肽进行共刺激培养；第4天加入IL-2(20IU/mL)，第10天补加半量IL-2。每孔PBL为1×10

④胞内IFN-γ荧光染色：

第14天晚上收集细胞，转种48孔板，每孔加入相应的单种候选表位肽(20μg/mL)，用无血清1640培养液继续培养16h，然后加入BFA/Monensin继续培养6h，再用anti-IFN-γ进行胞内染色和anti-CD3/anti-CD8膜染色，流式分析CD3

3)利用分子对接与分子动力学模拟实验验证阳性表位肽与多种相关HLA-A分子的交叉结合力：

将DC-多肽-PBL共刺激实验验证的阳性表位肽进行分类，根据预测的HLA-A分子限制性和验证试验中献血者的真实HLA分子，将每种阳性表位肽可能的限制性HLA-A分子进行列表归类，然后通过Schrodinger Suite中的Glide 5.7模块，将该阳性表位肽分别与相关HLA分子的蛋白晶体结构进行分子对接，利用Desmond模块完成每对分子的动力学模拟，最后根据RMSD结果计算结合自由能(kal/mol)，判断每种阳性表位肽与相关HLA分子的亲和力高低，明确每种表位肽与多种HLA分子的交叉限制性(即一种表位肽能被多种HLA分子提呈)

4)利用表达特定HLA-A分子的HMy2.CIR细胞株进行HLA分子与多肽的竞争结合实验，验证阳性表位肽与多种相关HLA-A分子的交叉结合力：

将DC-多肽-PBL共刺激实验验证的阳性表位肽进行分类，根据预测的HLA分子限制性和验证试验中献血者的真实HLA分子，将每种HLA分子可能提呈的阳性表位肽进行列表归类。然后同实例1的步骤进行HLA分子的多肽竞争结合实验。

5)利用HLA-A2转基因小鼠免疫接种实验，验证被HLA-A2分子提呈的31种阳性表位肽的体内免疫原性：

利用HLA-A0201/DR1转基因小鼠，将该HLA-A0201分子限制性的31种阳性表位肽制备成若干个混合肽池，与佐剂Poly I:C(InvivoGen)混合，皮下多点接种小鼠，每个肽池接种一个点，接种4个肽池/次/鼠。接种量为10μg/表位肽/次/鼠+25μgPoly I:C/点/次/鼠，免疫3次，间隔2周，末次接种后1周杀鼠取脾细胞，在96孔板中分别与单种表位肽共孵育20h，做IFN-γ的ELISPOT和胞内IFN-γ染色加流式分析，检测每种表位肽诱导的特异性T细胞反应强度，在动物体内验证部分阳性表位肽的免疫原性。

6)组建包含215种阳性表位肽的广谱T细胞表位肽库，建立ELISPOT方法：

将被13种优势HLA-A分子提呈的经实验验证的215种新冠病毒5种抗原的阳性表位肽组成广谱表位肽库，按照蛋白来源的不同和酸性/碱性/中性的不同配制成11个混合肽池，作为PBMC刺激剂，与PVDF膜96孔条板(Merck&Millipore，M8IPS4510)、IFN-γ捕获抗体/检测抗体(BD,551873)、HRP-链霉亲和素(BD,557630)和AEC显示剂(BD,551951)等组装成ELISPOT试剂。

7)检测50名健康献血者PBMCs中与新冠病毒有交叉反应的记忆性T细胞：

①从江苏省血液中心收集献血者的白细胞滤盘，同上分离PBMCs冻存备用。复苏培养过夜后用上述215种表位肽进行检测。每份标本分成13个孔进行检测，第1孔为无多肽刺激的阴性对照孔，第2-12孔为实验孔，分别加入肽库1至肽库11，第13孔为PHA刺激的阳性对照孔。其余步骤同实例1。阴性孔和实验孔：4×10

②根据50份健康献血者的标本实际斑点数，初步得出健康人群的正常值范围如下：95％的人群参考值范围：83-377SFUs/4×10

利用本发明技术方案制备的新冠病毒抗原特异性T细胞普适性检测方法对健康献血者进行检测的代表性标本ELSPOT斑点图结果如图2所示。该图是步骤(7)的代表性结果图。利用215种新冠病毒抗原的广谱T细胞表位肽库定量检测健康献血者PBMCs中与新冠病毒呈交叉反应的特异性T细胞反应活性(IFN-γELISpot法)，因为这215种表位肽中约10％的表位肽是与四种普通感染冠状病毒抗原高度同源的T表位肽。阴性孔和实验孔：4×10

实施例3：

利用该技术方案制备HLA-A分子提呈的肝癌相关肿瘤抗原的广谱T细胞表位肽库，用于对中国地区广泛肝癌患者进行肿瘤抗原特异性T细胞的普适性检测

1)虚拟预测HLA-A分子提呈的肝癌相关抗原的候选T细胞表位：

①通过UniProt/NCBI和COSMIC等数据库获取6种肿瘤抗原(AFP、GPC3、SART2/3、SSX2、GP73和hTERT)的全长氨基酸序列(如下)，通过使用Molecular EvolutionaryGenetics Analysis(MEGA7，1.0.0.0version)软件中的ClustalW方法进行多重序列比对，再使用多序列比对与分析软件GeneDoc(2.7.0version)来分析比对结果以获得序列的保守区。以100％，95％，80％为临界点对每个氨基酸的保守性质进行判断。AFP、GPC3、SART2/3、SSX2、GP73和hTERT等在HCC患者群中的阳性表达率分别约为50-80％、65-80％、100％、75％、63-72％和61-84％。

②利用表1所列表位预测算法和工具，虚拟预测被中国人群中基因频率大于1％的所有13种HLA-A所提呈的表位肽。表位肽长度设为9-mer和10-mer，至少满足3种以上预测算法的评判标准，选取评分排名前5-10的多肽作为候选表位肽。

七种肝细胞癌相关肿瘤抗原的氨基酸序列如下：

科学命名的生物属种：脊椎动物门，真兽亚纲，人类

AFP(Alpha fetoprotein)(ID:P02771-1)

GPC3(Glypican 3)(ID:P51654-3)

SART2(Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 2)(ID:Q9UL01-1)

SART3(Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3)(ID:Q15020-1)

SSX2(Synovial sarcoma,X breakpoint 2)(ID:Q16385-2)

GP73(Golgi membrane protein 73)(ID:Q8NBJ4-1)

hTERT(Telomerase reverse transcriptase)(ID:O94807-1)

2)利用肝癌患者PBMCs，通过多肽-PBMCs共刺激实验验证候选表位肽的免疫原性：

①从南京市第二医院肝脏肿瘤治疗中心收集肝癌患者外周血，常规分离PBMCs冻存备用，另取部分细胞，同实例1步骤进行HLA-A等位基因分型。

②单个肽免疫原性验证：

复苏患者PBMCs，根据患者HLA-A\B\C等位基因鉴定结果，选用该患者特定HLA分子相对应的候选表位肽，与PBMCs共培养6小时，进行胞内IFN-γ荧光染色，检测分泌IFN-γ的CD8

3)利用表达特定HLA-A分子的HMy2.CIR细胞株进行HLA分子与多肽的竞争结合实验，验证阳性表位肽与多种相关HLA-A分子的交叉结合力：

将多肽-PBMCs共刺激实验验证的阳性表位肽进行分类，根据预测的HLA分子限制性和验证试验中献血者的真实HLA分子，将每种HLA分子可能提呈的阳性表位肽进行列表归类。然后同实例1的步骤进行HLA分子的多肽竞争结合实验。

4)组建6种肝癌相关抗原的广谱T细胞表位肽库，检测广泛的肝细胞患者PBMCs中肿瘤抗原特异性T细胞：

通过上述单个肽免疫原性验证和HLA分子与多肽竞争结合实验，筛选出106种被13种优势HLA-A分子交叉结合的优势表位肽，组成肿瘤抗原的广谱T细胞表位肽库，每种HLA-A分子交叉结合的表位肽数间表5。根据抗原来源和酸碱性不同，将106种表位肽分成8个混合肽库。

表5 106种肝癌相关抗原表位肽的13种HLA-A分子交叉限制性分布

5)肝癌相关抗原特异性T细胞的普适性检测：

①分离PBMC：取待检患者的外周抗凝血标本，同上常规分离单个核细胞PBMC，计数并用无血清细胞培养液(达科为生物，深圳)调整细胞浓度为2×10

②加细胞悬液：每份病人血样的PBMC加入9个孔中，100μL/孔(即：2×10

③加抗原肽：每份血样检测9个孔，第2至第9孔中分别加入抗原肽库A，肽库B，肽库C，肽库D，肽库E，肽库F，肽库G，肽库H，20μL/孔，为实验孔；第1孔中不加抗原肽，只补加20μL无菌洗涤液，为阴性孔。

④培养孵育：将条板加盖，放入37℃，5％CO

⑤洗板：从细胞培养箱中取出ELISPOT条板，甩去细胞悬液，每孔加入200μL去离子水，4℃放置10分钟，裂解细胞，弃去离子水。每孔加入200μL洗涤液(1×PBS)，静止1分钟，甩去液体，如此重复洗板5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。

⑥加检测抗体：每孔加入100μL生物素-IFN-γ检测抗体工作液(BD Bioscience)，室温孵育2小时。同上洗板：每孔加入200μL洗涤液(1×PBS)，静止1分钟，甩去液体，如此重复5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。

⑦加HRP-链霉亲和素：每孔加入100μLHRP-链霉亲和素工作液(BD Bioscience)，室温避光孵育1小时。同上洗板5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。

⑧显色：每孔加入100μLAEC显色液(即用即配)，室温避光静置20分钟。然后甩去液体，卸下板底座，用去离子水洗涤PVDF膜的正反面及底座3-5遍，以终止显色。将条板置室温避光处，待自然晾干后装上板底座。

⑨斑点计数：将晾干后的条板用酶联免疫斑点分析仪进行自动拍照和斑点计数。如果斑点数较少，实验者也可在正置光学显微镜下自行计数斑点。

⑩结果判断：

每份标本的斑点数＝(8个实验孔的斑点数总和)-(8个实验孔的本底斑点数)

注：当该实验孔的实际斑点数少于阴性对照孔时，以实际斑点数作为该孔的本底斑点数；当该孔的实际斑点数等于或多于阴性对照孔时，以阴性对照孔的斑点数作为该孔的本底斑点数。

6)个性化检测结果的分析：

通过对58例肝细胞癌患者和16例健康献血者进行检测，肝细胞癌患者的肿瘤抗原特异性T细胞数量显著高于健康献血者，结果见附图3。

图3为利用本发明方法制备的肝癌相关肿瘤抗原特异性T细胞普适性检测方案对肝癌患者和健康者进行检测的ELISPOT斑点图A以及斑点统计图表B。利用肝细胞癌相关肿瘤抗原的106种CD8

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的基于HLA-B和HLA-C限制性广谱T细胞表位肽库的普适性抗原特异性T细胞检测方法及同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。