预测子宫内膜容受性的方法

摘要

本发明涉及预测受试者的胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，所述方法包括：确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。本发明还涉及监测上皮细胞容受性和提高上皮细胞容受性的方法。

说明书

相关申请资料

本申请要求于2019年6月25日提交的标题为“预测子宫内膜容受性的方法(Methods of predicting endometrial receptivity)”的澳大利亚专利申请号2019902204的优先权，其全部内容在此通过引用并入。

序列表

本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容在此通过引用并入。

技术领域

本公开涉及预测受试者的胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，所述方法包括：确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白(podocalyxin)的水平。本公开还提供了监测上皮细胞容受性和提高上皮细胞容受性的方法。

背景技术

胚胎植入是建立妊娠的关键步骤，植入失败会导致不孕症。辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)是克服不孕症的主要干预措施，然而，低植入率(每个平均ART周期约30％)显著限制了ART的成功。

植入涉及胚胎和子宫之间高度协调的相互作用。为了成功植入，胚胎必须发育良好并且能够植入，并且子宫必须处于容受状态。

近年来，胚胎培养与选择方面的创新显著改善了ART。然而，即使采用了最新的胚胎技术，包括植入前基因筛查，植入失败仍然为限制性障碍，其突出了子宫内膜在确定植入结果中的重要性。

子宫的内衬层子宫内膜参与植入，并且植入的过程因物种而差别很大。人类植入需要胚胎附着到子宫内膜腔上皮，穿过上皮层，穿透下面的基底膜，并最终移动到基质区室。然后腔上皮重新密封植入部位，将胚胎完全包封在组织内。这种人类植入连续阶段是独特的，没有动物模型能够概括人类植入过程的所有方面。

在每个月经周期中，人类子宫内膜在卵巢激素雌激素和黄体酮的影响下大幅度重构，仅在黄体酮占主导地位的分泌中期(28天周期中的第20-24天)变得容易接受。这使子宫内膜容受性与胚胎发育同步用于植入。

然而，控制子宫内膜容受性的详细分子和细胞机制仍有待充分阐明。特别是，腔上皮如何重构用于胚胎附着和侵入尚不清楚。子宫内膜组织的转录组学分析揭示了大量基因在容受性方面上调或下调，尽管研究之间的数据集差异很大。已经开发了一种基于微芯片的称为子宫内膜容受性芯片(ERA，endometrial receptivity array)的mRNA特征技术以鉴定容受窗口，尽管ERA的实用性仍在得到证实。此外，ERA使用全组织活检，并且因此无法精准确定特定细胞类型或特异性分子的特异性参与。

因此，本领域技术人员将清楚，本领域一直需要开发用于预测胚胎植入的最佳时期并减少植入失败的方法。

发明内容

在创作本公开时，发明人将足糖萼蛋白鉴定为人类子宫内膜上皮细胞容受性(endometrial epithelial receptivity)的关键负调节物。发明人研究了这种调节物在人类组织样本中的作用及其与体外受精(IVF)患者的植入失败的关系。还评估了调控与调节足糖萼蛋白的表达的方法。令人惊讶的是，本发明的发明人已发现腔上皮细胞而非腺上皮细胞中的足糖萼蛋白的下调表示上皮细胞容受性。

发明人的发现为鉴定或预测受试者的胚胎植入的子宫内膜容受性的方法提供了基础。例如，本公开提供了一种预测受试者的胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，所述方法包括：确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

在一个实施例中，本公开提供了一种预测受试者的胚胎植入的子宫内膜上皮细胞容受性的方法，所述方法包括：确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

在一个实施例中，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定所述子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白蛋白质的量和/或分布模式，和/或确定所述子宫内膜上皮细胞中编码足糖萼蛋白的核酸分子的量。

在一个实施例中，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定所述子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白蛋白质的量和/或分布模式。例如，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定所述子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白蛋白质的量。在另一个实施例中，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定所述子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白蛋白质的分布模式。

在一个实施例中，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定所述子宫内膜上皮细胞中编码足糖萼蛋白的核酸分子的量。

在一个实施例中，所述核酸分子为mRNA。测量所述子宫内膜上皮细胞中核酸分子的量的方法是本领域已知的和/或在本文中进行了描述。例如，使用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测所述核酸分子。

在一个实施例中，所述方法还包括：将所述受试者中的足糖萼蛋白的水平与至少一个参考品(reference)中的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平进行比较。确定参考品的方法对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中进行了描述。

在一个实施例中，所述方法包括：确定(a)所述受试者中的足糖萼蛋白的水平是否高于所述参考品中的足糖萼蛋白的水平，或(b)所述受试者中的足糖萼蛋白的水平是否低于所述参考品中的足糖萼蛋白的水平。

在一个实施例中，所述子宫内膜上皮细胞为腔(luminal)上皮细胞和/或腺(glandular)上皮细胞。例如，所述子宫内膜上皮细胞为腔上皮细胞。在另一个实施例中，所述子宫内膜上皮细胞为腺上皮细胞。

在一个实施例中，本公开的方法提供：

(i)所述受试者的腔上皮细胞中足糖萼蛋白的较低水平与腺上皮细胞中足糖萼蛋白的较高水平表示子宫内膜上皮细胞容受性；或

(ii)所述受试者的腔上皮细胞中足糖萼蛋白的较高水平与腺上皮细胞中足糖萼蛋白的较高水平表示子宫内膜上皮细胞前容受性(pre-endometrial epithelialreceptivity)；或

(iii)所述受试者的腔上皮细胞中足糖萼蛋白的较低水平与腺上皮细胞中足糖萼蛋白的较低水平表示子宫内膜上皮细胞后容受性(post-endometrial epithelialreceptivity)。

在一个实施例中，所述受试者的腔上皮细胞中足糖萼蛋白的较低水平与腺上皮细胞中足糖萼蛋白的较高水平表示子宫内膜上皮细胞容受性。

在一个实施例中，所述受试者的腔上皮细胞中足糖萼蛋白的较高水平与腺上皮细胞中足糖萼蛋白的较高水平表示子宫内膜上皮细胞前容受性。

在一个实施例中，所述受试者的腔上皮细胞中足糖萼蛋白的较低水平与腺上皮细胞中足糖萼蛋白的较低水平表示子宫内膜上皮细胞后容受性。

在一个实施例中，所述方法包括：使用特异性结合足糖萼蛋白的抗体或适体以确定足糖萼蛋白的水平。例如，所述方法包括：使用特异性结合足糖萼蛋白的抗体以确定足糖萼蛋白的水平。适用于本公开的抗体对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中进行描述。在另一个实施例中，所述方法包括：使用特异性结合足糖萼蛋白的适体以确定足糖萼蛋白的水平。适用于本公开的适体对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中进行描述。

在一个实施例中，所述抗体或适体偶联至可检测标记。例如，所述抗体偶联至可检测标记。在另一个实施例中，所述适体偶联至可检测标记。适用于本公开的可检测标记对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中进行描述。例如，所述可检测标记选自由放射性标记、酶、荧光标记、发光标记(luminescent label)、生物发光标记、磁性标记、辅基、造影剂(contrast agent)和超声剂组成的组。

在一个实施例中，所述可检测标记为放射性标记。例如，所述放射性标记可以是但不限于放射性碘(125I、131I)；锝；钇；35S或3H。

在一个实施例中，所述可检测标记为酶。例如，所述酶可以是但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。

在一个实施例中，所述可检测标记为荧光标记。例如，所述荧光标记可以是但不限于伞形酮、荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白。

在一个实施例中，所述可检测标记为发光标记。例如，所述发光标记可以是但不限于鲁米诺(luminol)。

在一个实施例中，所述可检测标记为生物发光标记。例如，生物发光标记可以是但不限于萤光素酶(luciferase)、萤光素(luciferin)或水母发光蛋白。

在一个实施例中，所述可检测标记为磁性标记。例如，所述磁性标记可以是但不限于钆或氧化铁螯合物。

在一个实施例中，所述可检测标记为辅基。例如，所述辅基可以是但不限于链霉亲和素(streptavidin)/生物素或抗生物素蛋白(avidin)/生物素。

在一个实施例中，所述可检测标记为造影剂。

在一个实施例中，所述可检测标记为超声剂。例如，所述超声剂可以是但不限于微泡释放剂。在一个实施例中，所述超声剂为微泡释放剂。

在一个实施例中，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定黄体酮的下游调节物和/或足糖萼蛋白的上游调节物的水平。例如，所述黄体酮的下游调节物和/或所述足糖萼蛋白的上游调节物为microRNA。在另一个实施例中，所述方法包括：确定microRNA的水平以确定足糖萼蛋白的水平。例如，所述microRNA为miR-199或miR-145。在另一个实施例中，所述microRNA的水平与足糖萼蛋白的水平之间存在反比关系。例如，升高的microRNA的水平表明较低的足糖萼蛋白的水平。

检测足糖萼蛋白的水平的方法对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中进行描述。例如，所述方法包括：实施免疫组织化学分析法、原位杂交、流式细胞术、酶联免疫吸附法、蛋白质印迹、实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或超声分子成像。

在一个实施例中，所述方法包括：实施免疫组织化学分析法。

在一个实施例中，所述方法包括：实施流式细胞术。

在一个实施例中，所述方法包括：实施酶联免疫吸附法。

在一个实施例中，所述方法包括：实施蛋白质印迹。

在一个实施例中，所述方法包括：实施实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。

在一个实施例中，所述方法包括：实施超声分子成像。

在一个实施例中，在体外(in vitro)或离体(ex vivo)对子宫内膜上皮细胞实施所述方法。例如，所述方法在体外对子宫内膜上皮细胞实施。在另一个实施例中，所述方法离体对子宫内膜上皮细胞实施。

在一个实施例中，对生物样本中从所述受试者获得的子宫内膜上皮细胞实施所述方法。适用于本公开的生物样本对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中进行描述。例如，所述生物样本选自由子宫内膜活检样本(biopsy)、子宫腔液样本和阴道液样本组成的组。

在一个实施例中，所述生物样本为子宫内膜活检样本。

在一个实施例中，所述生物样本为子宫内膜上皮细胞。

在一个实施例中，所述生物样本为子宫腔液样本。

在一个实施例中，所述生物样本为阴道液样本。

在一个实施例中，所述受试者以前已经用包含黄体酮、孕激素或类似物或它们的组合的组合物治疗。例如，所述受试者一直在接受不孕症治疗。在另一个实施例中，所述受试者由于胚胎植入失败一直在接受治疗。

在一个实施例中，在至少一个生物样本中与在一个周期中至少一个时间点确定足糖萼蛋白的水平。例如，在一个周期中的1或2或3或4或5或6或7或8或9或10个时间点确定足糖萼蛋白的水平。

在一个实施例中，所述方法还包括：将胚胎植入所述受试者中。例如，胚胎的植入是基于受试者的足糖萼蛋白的水平。

在一个实施例中，在所述受试者的第一个周期中确定足糖萼蛋白的水平，并且在所述受试者的随后周期中植入胚胎。

本公开还提供了一种检测受试者的不孕症的方法，所述方法包括：确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

本公开还提供了一种受试者不孕症诊断和预后的方法，所述方法包括：确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

在一个实施例中，在至少一个生物样本中与在一个周期中至少一个时间点确定足糖萼蛋白的水平。

本公开还提供了一种监测受试者的子宫内膜上皮细胞容受性和预测受试者的胚胎植入的最佳子宫内膜上皮细胞容受性的方法，所述方法包括：在一个或多个时间点确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

本公开还提供了一种提高受试者的胚胎植入的子宫内膜上皮细胞容受性的方法，所述方法包括：确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平，并且基于所述细胞中足糖萼蛋白的水平，以足以降低所述子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白的水平的量向所述受试者施用化合物。

本公开还提供了一种评估化合物对提高受试者的胚胎植入的子宫内膜上皮细胞容受性的有效性的方法，所述方法包括：确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平，其中，所述受试者以前已经接受了用所述化合物的治疗。

本公开还提供了一种优化化合物治疗以提高受试者的胚胎植入的子宫内膜上皮细胞容受性的方法，所述方法包括：向所述受试者施用化合物，确定所述受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平，并且任选地，基于足糖萼蛋白的水平，改变对所述受试者的治疗。

在一个实施例中，所述改变为剂量、化合物类型和/或施用途径中的一种或多种或全部。

在一个实施例中，所述化合物选自由黄体酮、孕激素、或其类似物、反义多核苷酸、催化性核酸、干扰RNA、siRNA、microRNA及其组合组成的组。例如，所述化合物为microRNA，如miR-199或miR-145。

附图说明

图1为示出HUVEC和HEEC中足糖萼蛋白(PCX)mRNA表达的实时qRT-PCR分析的图示。数据表示为平均值±SD。

图2为示出月经周期的增殖期(Prolif)、早(E)-、中(M)-和晚(L)-分泌(Sec)期中(A)腔上皮(LE)、(B)腺上皮(GE)与(C)血管(BV)中的PCX免疫组织化学染色强度的量化的图示。数据表示为平均值±SD.Prolif；E-Sec；M-Sec；L-Sec。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。

图3为示出用雌激素(E)(不用或用孕酮(P))治疗48、72和98小时的原代HEEC中PCX的(a)mRNA水平和(B)蛋白质水平的图示。数据表示为平均值±SD，*P<0.05，**P<0.005。

图4为示出Ishikawa细胞中PCX的瞬时敲低(KD)或稳定过表达(PCX-OE)的效果的图示。PCX的瞬时敲低减少了PCX mRNA表达(A)并增加了对纤连蛋白的粘附(B)。PCX的过表达增加了PCX mRNA表达(C)并降低了对纤连蛋白的粘附性。平均值±SD，***P<0.0005，****P<0.0001。

图5为示出原代滋养层球状体附着在PCX过表达Ishikawa单层上的量化的图示。平均值±SD，n＝3-5，*P<0.05，**P<0.005，****P<0.0001。

图6为示出通过PCX过表达Ishikawa单层的原代滋养层球状体侵入的量化的图示。平均值±SD，n＝3，*p<0.05，**p<0.005。

图7为示出(A)人类胚胎附着在PCX过表达Ishikawa单层上与(B)人类胚胎侵入PCX过表达Ishikawa单层上的量化的图示。平均值±SD，n＝3，**P<0.005；*p<0.05。

图8为示出对照和PCX-OE Ishikawa细胞之间(A-F)上调与(G-L)下调基因的实时qRT-PCR分析的图示。平均值±SD，n＝3。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005，****P<0.0001。

图9为示出对照和PCX-OE细胞的FITC-葡聚糖的(A)跨上皮电阻(TER)与(B)通量的图示。平均值±SD，n＝3，**P<0.005。

图10为示出PCX-和PCX+组中植入成功和植入失败的比例的图示，*P＝0.036，Fisher精确检验。

图11为示出E+P与E处理后原代子宫内膜上皮细胞中mir145和mir199的实时RT-PCR分析的图示。E+P细胞相对于E细胞的倍数变化±SD，n＝4，*P<0.05。

图12为示出用mir145、mir199或它们的组合转染后Ishikawa细胞中PCX mRNA的实时RT-PCR分析的图示。在24小时相对于对照细胞的倍数变化±SD，n＝4。

SEQ ID NO:1 PODXL(PCX)正向引物

SEQ ID NO:2 PODXL(PCX)反向引物

SEQ ID NO:3 CDH1正向引物

SEQ ID NO:4 CDH1反向引物

SEQ ID NO:5 TJP1正向引物

SEQ ID NO:6 TJP1反向引物

SEQ ID NO:7 CLDN4正向引物

SEQ ID NO:8 CLDN4反向引物

SEQ ID NO:9 OCLN正向引物

SEQ ID NO:10 OCLN反向引物

SEQ ID NO:11 WNT7A正向引物

SEQ ID NO:12 WNT7A反向引物

SEQ ID NO:13 LEFTY2正向引物

SEQ ID NO:14 LEFTY2反向引物

SEQ ID NO:15 LIF正向引物

SEQ ID NO:16 LIF反向引物

SEQ ID NO:17 CSF1正向引物

SEQ ID NO:18 CSF1反向引物

SEQ ID NO:19 ERBB4正向引物

SEQ ID NO:20 ERBB4反向引物

SEQ ID NO:21 FGF2正向引物

SEQ ID NO:22 FGF2反向引物

SEQ ID NO:23 TGFB1正向引物

SEQ ID NO:24 TGFB1反向引物

SEQ ID NO:25 MMP14正向引物

SEQ ID NO:26 MMP14反向引物

SEQ ID NO:27 YWHAZ正向引物

SEQ ID NO:28 YWHAZ反向引物

SEQ ID NO:29 18S正向引物

SEQ ID NO:30 18S反向引物

SEQ ID NO:31 hsa-miR-199a-5p

SEQ ID NO:32 hsa-miR-152-3p

SEQ ID NO:33 hsa-miR-145-5p

SEQ ID NO:34 hsa-miR-219a-5p

SEQ ID NO:35 hsa-miR-34a-5p

SEQ ID NO:36 hsa-mir-181a-5p

SEQ ID NO:37 hsa-miR-144-3p

SEQ ID NO:38 hsa-miR-802

SEQ ID NO:39 hsa-miR-125b-5p

SEQ ID NO:40 hsa-miR-143-3p

SEQ ID NO:41 hsa-miR-202-5p

SEQ ID NO:42 hsa-miR-506-3p(124-3p.2)

SEQ ID NO:43 hsa-miR-16-5p(15-5p)

SEQ ID NO:44 hsa-miR-361-5p(对照)

具体实施方式

一般定义

在整个说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组应理解为包括这些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组中的一个和多个(即一个或多个)。

本公开的范围不受本文描述的具体实施例的限制，这些具体实施例仅用于示例的目的。功能等效的产品、组合物和方法显然落入本公开的范围内。

本领域技术人员会理解，在不背离广义描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方式中所示的本发明进行多种改变和/或修改。因此，本实施方式在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。

本文所讨论和/或引用的所有出版物均以其整体并入本文。

已包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了为本发明提供背景。不应视为承认：任何或所有这些情况构成现有技术基础的一部分，或者因其在本申请的每个权利要求的优先权日期之前存在，而成为与本发明相关的领域中的公知常识。

除非另有明确说明，否则本文中的本公开的任何实施例均应被视为对本公开的任何其它实施例实施的细节上修改(mutatis mutandis)。换言之，本公开的任何具体实施例都可以与本公开的任何其它具体实施例结合(除非相互排斥)。

公开特定特征或一组特征或方法或方法步骤的本公开的任何实施例将被视为明确支持对特定特征或一组特征或方法或方法步骤的放弃(disclaiming)。

除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、生殖生物学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。

除非另有说明，否则本公开中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术为本领域技术人员熟知的标准流程。这些技术在资料来源的文献中都有描述和解释，如Perbal1984；Sambrook1989；Brown 1991；Glover 1995；Ausubel 1988；Harlow 1988；Coligan1991。

术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应理解其意思是“X和Y”或“X或Y”，并应被视为为两种含义或任一种含义提供明确支持。

在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包括(comprising)”的变型将被理解为意味着包括陈述的元素、整数或步骤，或一组元素、整数或步骤，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或一组元素、整数或步骤。

如本文所使用的，术语“受试者”应理解为包括人类在内的任何动物，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人类和非人类灵长类动物。例如，受试者为人类。在一个实施例中，受试者为女性人类。

子宫内膜上皮细胞容受性

子宫内膜重构为人类月经周期的关键特征，从非粘连状态到粘连状态的转换对于胚胎植入至关重要。特别是，直接与植入的胚胎相互作用以启动附着的腔上皮的顶面必须重构用于容受性。因此，希望能够确定在该周期期间在子宫内膜能够接受胚胎植入时的最佳点。

对本领域技术人员来说显而易见的是，本公开提供了用于确定自然怀孕的最佳时机的方法，例如自然受孕后的植入，或通过辅助生殖技术实现的怀孕。

本发明人发现，子宫内膜上皮细胞内在表达作为关键的抗植入调节物的足糖萼蛋白，其必需在上皮细胞中被下调用于容受性。具体地，发明人惊奇地发现，子宫内膜腔上皮而非腺上皮中调节物的下调表示子宫内膜上皮细胞容受性。

如本文所使用的，术语“子宫内膜上皮细胞容受性”是指月经周期中子宫内膜能够接受植入的一段时间。在此期间，子宫内膜获得允许胚泡粘附的功能状态。该段时间优选对应于月经周期的中-分泌期或人类28天月经周期的第20-24天。

发明人还证明了子宫内膜上皮的腔和腺细胞两者中足糖萼蛋白的上调或升高的水平表示前容受性(pre-receptivity)。

如本文所使用的，术语“前容受性”或“子宫内膜上皮细胞前容受性”是指月经周期的一段时间，在此期间子宫内膜尚不能够接受植入，但在该周期内处于正在成为能够接受植入的过程中。

发明人还证明了子宫内膜上皮的腔和腺细胞中足糖萼蛋白的下调或降低的水平表示后容受性(post-receptivity)。

如本文所使用的，术语“后容受性”或“子宫内膜上皮细胞后容受性”是指月经周期的一段时间，在此期间子宫内膜已经能够接受植入，但在该周期内用于植入的时间段已经发生。

如本文所使用的，术语“周期”或“月经周期”是指女性和其它雌性灵长类动物的排卵和月经过程。本领域技术人员会理解，该术语包括与卵巢(也称为卵巢周期)和子宫的内衬层或子宫内膜(也称为子宫周期)相关的变化。卵巢周期由卵泡期、排卵期和黄体期组成，而子宫周期由月经期、增殖期和分泌期组成。人类的平均月经周期为28天。

在一个实施例中，本公开提供了一种预测有需要的受试者的子宫内膜上皮细胞容受性的方法。

确定足糖萼蛋白的水平

足糖萼蛋白(PODXL或PCX)，也称为足糖萼蛋白样蛋白质1(PCLP-1)，是跨膜唾液黏蛋白CD34族的成员，其与细胞粘附、迁移和极性的调节有关。PODXL由肾脏足细胞、造血祖细胞、血管内皮细胞和神经元的子集表达；而异常表达与一系列癌症有关。作为一种I型跨膜蛋白，PODXL具有广泛O-糖基化的和唾液酸化的胞外结构域和跨膜区以及较短的胞内区。编码的蛋白质具有22个氨基酸信号肽、439个残基的胞外结构域、21个残基的跨膜结构域和76个氨基酸的C端胞内结构域。仅出于命名而非限制的目的，人类PODXL的示例性序列在NCBI参考序列NG_042104.1.中列出。应当理解的是，术语“足糖萼蛋白(PODXL或PCX)”包括可以由足糖萼蛋白mRNA或突变体的替代性切片产生的任何同种型或足糖萼蛋白的多晶型。例如，仅出于命名而非限制的目的，人类PODXL同种型1和2的示例性序列分别在GenBank登录号NP_001018121和GenBank登录号NP_005388中列出。来自其它物种的PODXL的序列可以使用本文中和/或在公开可用的数据库中提供的序列确定和/或使用标准技术确定(例如，如在Ausubel 1988或Sambrook 1989中所描述)。

本发明人已经发现，在容受性建立时足糖萼蛋白在腔上皮细胞中显著下调。

因此，本文所述的任何公开的方法包括确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

如本文所使用的，提及足糖萼蛋白的术语“水平”应理解为是指基因和/或蛋白质的功能性水平(即功能水平)。例如，水平(或“表达水平”)是指由基因表达的mRNA转录物的量度或编码的蛋白质的量度。

在一个实施例中，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白蛋白质的量，和/或确定子宫内膜上皮细胞中编码足糖萼蛋白的核酸分子的量。

如本文所使用的，提及足糖萼蛋白的水平的术语“量(amount)”应理解为是指mRNA分子和/或蛋白质的数量。评估分布模式的各种方法对本领域技术人员可用，并且本领域技术人员将认识到具体值或量将根据所使用的评估方法而改变。很明显，该术语包括绝对值和相对值。例如，该量可以相对于参考品或对照样本、评估的细胞数量(例如，每100个细胞的量)和/或细胞类型(例如，腔上皮细胞与腺上皮细胞)。在另一个实施例中，该量可以是样本中存在的mRNA分子和/或蛋白质的量的绝对值。

在一个实施例中，确定足糖萼蛋白的水平包括：确定足糖萼蛋白蛋白质的分布模式(distribution pattern)。

如本文所使用的，术语“分布模式”是指受试者中的足糖萼蛋白蛋白质的特定模式和/或细胞定位。评估分布模式的各种方法对本领域技术人员可用，并且将取决于所使用的分析方法。本领域技术人员将认识到该术语包括描述性分析(例如，存在或不存在)、多参数和半定量评分(例如，强、弱或不存在)。

在一个实施例中，足糖萼蛋白的水平为细胞群体中的水平。

在本公开中提及的“细胞群体”或“细胞群”是指所有子宫内膜上皮细胞。对本领域技术人员显而易见的是，子宫内膜由腔上皮细胞和腺上皮细胞组成，并且该术语涵盖这两种细胞群体。

如本文所使用的，术语“腔上皮细胞(luminal epithelium)”(LE)是指铺排在子宫腔的细胞。

如本文所使用的术语“腺上皮细胞(glandular epithelium)”(GE)是指子宫内膜腺体或子宫腺体的细胞。

因此，对本领域技术人员显而易见的是，受试者中足糖萼蛋白的水平可以是细胞群体(即，在腺上皮细胞与腔上皮细胞中)中的水平，或者足糖萼蛋白的水平可以是细胞群体(即，在腺上皮细胞或腔上皮细胞中)的子集中的水平。

在一个实施例中，足糖萼蛋白的水平为腔上皮细胞与腺上皮细胞中足糖萼蛋白的水平。例如，足糖萼蛋白的水平与参考品或对照品进行比较。

在一个实施例中，足糖萼蛋白的水平为腔上皮细胞或腺上皮细胞中足糖萼蛋白的水平。例如，足糖萼蛋白的水平为腔上皮细胞中足糖萼蛋白的水平。在另一个实施例中，足糖萼蛋白的水平为腺上皮细胞中足糖萼蛋白的水平。在一个实施例中，腔上皮细胞或腺上皮细胞中足糖萼蛋白的水平与参考品或对照品进行比较。在另一个实施例中，将腔上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平与腺上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平进行比较。在另一个实施例中，将腺上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平与腔上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平进行比较。

在本文所述的任何方法的一个实施例中，方法包括：确定(a)受试者中的足糖萼蛋白的水平是否高于参考品中的足糖萼蛋白的水平，或(b)受试者中的足糖萼蛋白的水平是否低于参考品中的足糖萼蛋白的水平。

提及足糖萼蛋白的水平的术语“高于”是指与对照品或参考品水平相比，或在一个细胞群中与另一个细胞群相比，受试者中编码足糖萼蛋白的核酸分子或足糖萼蛋白蛋白质的水平更高或增加。从前面的内容可以明显看出，足糖萼蛋白的水平只需要增加统计学上显著的量，例如，增加至少约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％。

提及足糖萼蛋白表达的水平的术语“低于”的意思是，与对照品或参考品水平相比，或在一个细胞群中与另一个细胞群相比，受试者中编码足糖萼蛋白的核酸分子或足糖萼蛋白的水平减少或降低。从前面的内容可以明显看出，足糖萼蛋白的水平只需要降低统计学上显著的量，例如，降低至少约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％。

确定足糖萼蛋白的水平的方法

确定编码足糖萼蛋白的足糖萼蛋白核酸分子或足糖萼蛋白蛋白质的水平的方法对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中进行描述。

用于检测核酸的方法是本领域已知的并且包括，例如，基于杂交的测定、基于扩增的测定和基于限制性内切酶的测定。例如，转录基因的水平可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增、连接酶链反应或环状探针技术等来确定。

引物设计与制备

如对本领域技术人员显而易见的，在本公开的测定中使用的特定引物将取决于所使用的测定形式。显然，优选能够与感兴趣的标记物特异性杂交或检测感兴趣的标记物的引物。用于设计用于例如PCR或杂交的引物的方法是本领域已知的并且例如在Dieffenbach(1995)中进行描述。此外，若干个软件包是公开可用的，它们为各种测定设计最佳引物，例如，引物3可从美国马萨诸塞州剑桥的基因组研究中心(Center for Genome Research,Cambridge,MA,USA)获得。适用于本公开的引物优选为不形成发夹、不自启动(self-prime)或不形成引物二聚体(例如，与检测试验中使用的另一种引物)的那些。

此外，评估引物(或其序列)以确定其从靶核酸变性的温度(即探针或引物的解链温度，或Tm)。确定Tm的方法是本领域已知的并被描述，例如在Santa Lucia,1995或者Bresslauer等,1986中描述。

本公开中用于检测足糖萼蛋白的示例性引物包括：

hPODXL-正向：5'-GAGCAGTCAAAGCCACCTTC-3'，

hPODXL-反向：5'-TGGTCCCCTAGCTTCATGTC-3'；

合适的对照引物对本领域技术人员来说也是显而易见的，包括例如18s和β-肌动蛋白。用于本公开的示例性对照序列包括：

18s-正向：5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'

18s-反向：5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'

用于制备/合成本公开的引物的方法是本领域已知的。例如，在Gait(1984)中描述了寡核苷酸的合成。例如，探针或引物可以通过生物合成(例如通过用限制性内切酶消化核酸)或化学合成获得。对于短序列(高达约100个核苷酸)，化学合成为优选的。

在一个实施例中，引物包含一种或多种可检测标记物。例如，该引物包含荧光标记，例如，荧光素(FITC)、5,6-羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯-2-氧代-1,3-二唑-4-基(nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(4'-6-diamidino-2-phenylinodole，DAPI)以及花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)、荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(5-carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimide ester))、罗丹明(5,6-四甲基罗丹明)。这些荧光物质(fluor)的吸收和发射最大值分别为：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm:672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)。

可替代地，例如，用荧光半导体纳米晶体(例如，如US 6,306,610中所描述)、放射性标记或酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶)标记引物。

此类可检测标记有助于引物的检测，例如，引物的杂交或使用引物产生的扩增产物。产生此类标记的引物的方法是本领域已知的。此外，用于生产标记的引物的商业来源是本领域技术人员已知的，例如，Sigma-Genosys(悉尼，澳大利亚)。

聚合酶链反应(PCR)

PCR方法是本领域已知的并且例如在Dieffenbach(1995)中描述。一般而言，对于PCR，包含至少约20个核苷酸或至少约30个核苷酸的两个非互补核酸引物分子与核酸模板分子的不同链杂交，并且模板的特定核酸分子拷贝被酶促扩增。PCR产物可以使用电泳与用结合核酸的可检测标记物进行检测来检测。可替代地，一种或多种寡核苷酸用可检测的标记物(例如荧光团)进行标记，并且使用例如双杂交探针(lightcycler)(Perkin Elmer,Wellesley,MA,USA)检测扩增产物。可替代地，例如，使用质谱法检测PCR产物。显然，本公开还包括定量形式的PCR(如实时PCR；RT-PCR)，例如TaqMan测定。TaqMan测定(如US 5,962,233中描述的)使用等位基因特异性(ASO)探针，其一端带有供体染料且另一端带有受体染料，使得染料对通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)相互作用。

连接酶链反应(LCR)

连接酶链反应(例如EU 320,308和US 4,883,750中描述的)使用两个或更多个与相邻靶核酸杂交的寡核苷酸。然后使用连接酶连接寡核苷酸。在一个或多个与邻近另一个引物的引物之一末端处的核苷酸不互补的核苷酸存在的情况下，连接酶不能连接引物，从而不能产生可检测的扩增产物。使用热循环，连接的寡核苷酸然后成为更多寡核苷酸的靶标。然后，检测连接的片段，例如，使用电泳或MALDI-TOF。可替代地，或另外，一种或多种探针用可检测标记物进行标记，从而促进快速检测。

环状探针技术

环状探针技术(Cycling Probe Technology)使用嵌合的合成探针，其包含能够与靶序列杂交的DNA-RNA-DNA。在与靶序列杂交后，形成的RNA-DNA双链体为切割探针的RNaseH的靶标。然后，使用例如电泳或MALDI-TOF检测切割的探针。

Qβ复制酶

Qβ复制酶也可以用作本公开的另一种扩增方法。在该方法中，在RNA聚合酶存在的情况下，将具有与靶区域互补的区域的RNA复制序列添加到样本中。聚合酶将复制随后可被检测到的复制序列。

链置换扩增(SDA)

链置换扩增(Strand displacement amplification，SDA)利用寡核苷酸、DNA聚合酶与限制性内切酶来扩增靶序列。寡核苷酸杂交至靶核酸且聚合酶用于产生该区域的复制物。然后，将复制的核酸和靶核酸的双链体用特异性识别复制的核酸起始处的核苷酸序列的核酸内切酶产生切口。DNA聚合酶识别有切口的DNA并产生该靶区域的另一个复制物，同时置换之前生成的核酸。SDA的优势在于它以等温形式出现，从而有助于高通量自动分析。

其它核酸扩增方法

其它核酸扩增流程包括基于转录的扩增系统(TAS)，其包括基于核酸序列的扩增(NASBA)与3SR(WO 88/10315)。

核苷酸序列的直接测序方法是本领域技术人员熟知的并且可以在例如Ausubel(1995)和Sambrook(1989)中找到。测序可以通过任何合适的方法进行，例如双脱氧测序、化学测序、下一代测序技术或其变型。直接测序具有确定特定序列的任何碱基对的变异的优点。

检测足糖萼蛋白蛋白质或多肽(包括不同的同种型)的水平或量的方法是本领域已知的并且包括，例如，免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法、蛋白质印迹法、斑点印迹法、酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法、荧光共振能量转移(FRET)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)、电喷雾电离(ESI)、质谱法(包括串联质谱法，例如LC MS/MS)、生物感测技术、倏逝光纤技术(evanescent fibre-opticstechnology)或蛋白质芯片技术。例如，合适的测定方法为半定量测定方法和/或定量测定方法。

术语“蛋白质”应理解为包括单个多肽链，即通过肽键连接的一系列连续氨基酸或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即多肽复合物)。例如，该系列多肽链可以使用合适的化学键或二硫键共价连接。非共价键的示例包括氢键、离子键、范德华力与疏水相互作用。

术语“多肽”或“多肽链”根据前一段将理解为意思是通过肽键连接的一系列连续氨基酸。

在一个实施例中，用于确定样本中足糖萼蛋白的水平的方法包括：使来自受试者的生物样本与特异性结合足糖萼蛋白或多肽的抗体或配体在足以使抗体或配体与多肽或蛋白质之间形成复合物的条件下接触一段时间，然后检测该复合物。

配体

如本文所使用的术语“配体”应当视为包括能够特异性结合足糖萼蛋白多肽的任何化合物、分子、肽、多肽、蛋白质、核酸、化学品、小分子、天然化合物等。此类配体可以通过任何过程结合至足糖萼蛋白多肽，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、静电相互作用、二硫键形成或共价键形成。

抗体

如本文所使用的术语“抗体”是指完整的单克隆或多克隆抗体、免疫球蛋白(IgA、IgD、IgG、IgM、IgE)部分、人源化抗体或重组单链抗体，以及它们的片段，例如Fab、F(ab)2和Fv片段。

适用于检测足糖萼蛋白的抗体对本领域技术人员来说是显而易见的和/或在本文中描述并包括，例如，市售的抗体AF1658(R&D系统)、3D3(Santa Cruz)和/或EPR9518(Abcam)。

在一个实施例中，抗体特异性结合足糖萼蛋白以确定足糖萼蛋白的水平。

如本文所使用的，术语“特异性结合”或“特异性地结合”应被理解为是指与替代抗原或细胞相比，抗体与特定抗原或表达该抗原的细胞的反应或联系更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更大。一般而言，但不一定，提及结合意味着特异性结合，并且每个术语应被理解为为另一个术语提供明确支持。

抗体可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任何一种来制备，并且例如在Harlow(1988)中描述。在一种这样技术中，将包含足糖萼蛋白多肽或其片段的免疫原注射入多种哺乳动物中的任何一种(例如，小鼠、大鼠、兔子、绵羊、猪、鸡或山羊)中。免疫原来源于自然来源，通过重组表达方式产生，或人工生成，例如通过化学合成(例如，BOC化学或FMOC化学)。在该方法中，足糖萼蛋白多肽或其片段可以用作免疫原而无需修饰。可替代地，足糖萼蛋白多肽或其片段与例如牛血清白蛋白的载体蛋白结合。将免疫原和任选的蛋白质载体注射到动物宿主中，优选地根据合并一次或多次加强免疫的预定时间表，并且定期从所述动物收集血液。任选地，在佐剂(例如弗氏完全或不完全佐剂)存在下注射免疫原，以增强对免疫原的免疫应答。

例如，可以使用Kohler等人(1976)的技术制备对感兴趣的抗原性多肽特异的单克隆抗体，并对其进行改进。简而言之，这些方法涉及制备能够产生具有所需特异性(即，对感兴趣的多肽的反应性)的抗体的永生细胞系。例如，此类细胞系可以由从如上文所述免疫的动物获得的脾细胞产生。脾细胞通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣融合而永生化，优选与免疫的动物同源的融合伴侣。可以采用多种融合技术，例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可以与非离子去污剂结合或电融合，然后在支持杂交细胞的生长但不支持骨髓瘤细胞的生长的选择性培养基中生长。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)选择。在足够的时间后，通常约1至2周，观察到杂种集落。选择单个集落并测试细胞已在其中生长的生长培养基中是否存在针对多肽(免疫原)的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。

例如，使用如上文所述的亲和纯化的方法从生长杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以采用各种技术以提高产率，如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹膜腔中。然后，从这种动物受试者的腹水或血液中收集单克隆抗体。通过常规技术，如色谱、凝胶过滤、沉淀和/或萃取，从抗体中去除污染物。

可替代地，能够结合至感兴趣的足糖萼蛋白多肽或其片段的形式的单克隆抗体是使用诸如以下的方法产生的，例如人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等，1983)、用于产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole，1985)或组合抗体文库的筛选(Huse等，1989)。

在一个实施例中，抗体偶联至可检测标记。

如本文所使用的，“可检测标记”为分子或原子标签或标记物，其生成或可以被诱导生成光学的或其它信号或产物，这些信号或产物可以通过视觉或通过使用合适的检测器而被检测到。可检测标记在本领域中是熟知的并且包括，例如，放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、辅基、造影剂和超声剂。

常用的荧光标记包括Alexa、花青素(如Cy5和Cy5.5以及吲哚菁)，以及异硫氰酸荧光素(FITC)，但它们不限于此。在本公开的实施中有用的荧光标记可以包括但不限于，1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘荧光素(pH 10)；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-HAT(羟色胺(Hydroxy Tryptamine))；5-羟色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6C；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红(Acid Fuchsin)；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙(Acridine Orange)+DNA；吖啶橙+RNA；吖啶橙，DNA和RNA；吖啶红(Acridine Red)；吖啶黄(Acridine Yellow)；吖啶黄(Acriflavin)；吖啶黄Feulgen SITSA；水母发光蛋白(发光蛋白)；Alexa Fluor 350；Alexa Fluor 430；AlexaFluor 488；Alexa Fluor 532；Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 568；Alexa Fluor594；Alexa Fluor 633；Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 660；Alexa Fluor 680；茜素络合指示剂(Alizarin Complexon)；茜素红；别藻蓝素(APC)；AMC，AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(AMCA)；苯胺蓝；硬脂酸蒽酚酯(Anthrocyl stearate)；APC(别藻蓝素)；APC-Cy7；APTRA-BTC＝比率染料，Zn

在一个实施例中，可检测标记为酶。酶可以作用于合适的底物以产生可检测的染料。可用于本公开的酶的示例包括但不限于，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。可替代地或另外地，该酶可以是例如荧光素酶。该酶可以通过常规化学方法连接至抗体，或者可以与抗体一起表达作为融合蛋白。

在本公开中用作可检测标记的放射性同位素在本领域中是熟知的并且可以包括

酶联免疫吸附法(ELISA)与荧光联免疫吸附法(FLISA)

标准固相ELISA或FLISA形式在确定各种样本中的蛋白质浓度时特别有用。在一种形式中，这种测定方法涉及将生物样本固定在固体基质上，例如，聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或量油尺、膜或玻璃支持物(例如载玻片)。

使与足糖萼蛋白多肽内的标记物特异性结合的抗体与固定的生物样本直接接触，并与所述样本中存在的任何其靶蛋白形成直接键。该抗体通常用可检测的报道分子标记，例如，在FLISA情况下，该报告分子为荧光标记(例如FITC或德克萨斯红)或荧光半导体纳米晶体(如US 6,306,610中所描述)，或在ELISA的情况下，该报告分子为酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶)，或可替代地，可以使用与第一抗体结合的第二标记抗体。洗涤去除任何未结合的抗体后，在荧光标记的情况下直接检测标记，或在酶标记的情况下，通过添加底物，例如过氧化氢、TMB或甲苯胺，或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(x-gal)检测标记。

通过针对抗体结合的蛋白质标准品的已知量的校准检测系统，此类基于ELISA或FLISA的系统适用于定量样本中蛋白质的量，例如，分离的和/或重组的足糖萼蛋白多肽或其免疫原性片段或其表位。

在另一个实施例中，ELISA包括将特异性结合疾病或病症标记物的抗体或配体固定在固体基质上的足糖萼蛋白多肽内，该固体基质例如膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔、聚苯乙烯或聚碳酸酯量油尺或玻璃支持物。然后使样本与所述抗体发生物理关系，并且样本内的所述标记物被结合或“捕获”。然后使用标记的抗体检测结合的蛋白质。可替代地，可以使用结合第二(检测)抗体的第三标记抗体。

对本领域技术人员来说显而易见的是，本文所述的测定形式适用于高通量形式，例如，Mendoza等，1999中描述的筛选过程的自动化或微芯片格式。此外，上述测定方法的变型对于本领域技术人员将是显而易见的，例如竞争性ELISA。

蛋白质印迹法

在另一个实施例中，蛋白质印迹法用于确定样本中足糖萼蛋白多肽内标记物的水平。在这种测定方法中，使用本领域已知的并且例如在Scopes(1994)中所描述的技术，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)从样本中分离蛋白质。然后使用本领域已知的方法，例如电转移，将分离的蛋白质转移到固相载体上，例如膜(例如，PVDF膜)。然后，封闭膜并且用与足糖萼蛋白多肽内标记物特异性结合的标记的抗体或配体探测该膜。可替代地，标记的二抗甚至三抗或配体用于检测特异性一抗的结合。然后，使用适合所用标记的测定方法以确定标记的水平。

合适的测定方法对于本领域技术人员将是显而易见的并且包括例如密度测定法。在一个实施例中，使用本领域已知的方法将蛋白质条带或斑点的强度相对于加载在SDS-PAGE凝胶上的蛋白质总量进行归一化。可替代地，检测到的标记物水平相对于对照/参考蛋白质的水平进行归一化。此类对照蛋白质在本领域中是已知的，并且包括，例如，肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β2微球蛋白、羟甲基胆烷合酶(hydroxy-methylbilanesynthase)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT)、核糖体蛋白L13c、琥珀酸脱氢酶复合亚基A和TATA盒结合蛋白(TBP)。

免疫组织化学

对本领域技术人员来说是显而易见的，组织化学方法，例如本文所述的免疫组织化学和/或免疫荧光法，可用于确定/检测足糖萼蛋白的亚细胞定位。此类方法在本领域中是已知的并且描述于例如免疫组织化学(Cuello 1984)中。

在组织化学方法中分析足糖萼蛋白的定位的方法对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。示例性方法包括，例如：

·评估阳性染色的细胞和结构。例如，对被认为是阳性的细胞和/或结构计数以确定每个样本的阳性染色的细胞的绝对数量。

·评估阳性染色的细胞和/或面积比。例如，确定阳性染色的细胞的百分比，并与计数的细胞总数和/或评估的总面积相关。当百分比被赋予某个分数值时，可以使用定量和定性评分的组合。例如，≥66％的阳性染色的细胞给予“存在”评分；当观察到少于10％的细胞或没有观察到可见染色时，给出“缺失”评分。在另一个实施例中，样本的得分为0(无染色)、1(<10％的细胞染色)、2(10％-50％的细胞染色)或3(>50％的细胞染色)。

·定性评分。例如，IHC表达的力可以归类为正或负的类别；或负(-)、弱(+)、中等(++)和强(+++)。如果类别是用数值而不是符号来标记的，那么这种方法从定性转换为半定量。

·数字化分析。例如，图像分析软件(例如，Fiji 1.51o)用于确定平均染色(或峰值像素)强度。

放射免疫分析法

可替代地，使用放射免疫分析法(RIA)检测该水平。该测定方法的基本原理为使用放射性标记的抗体或抗原来检测抗体-抗原相互作用。与足糖萼蛋白多肽内的标记物特异性结合的抗体或配体与固相载体结合，而样本与所述抗体直接接触。为了检测结合的抗原的水平，分离和/或重组形式的抗原被放射性标记并与相同的抗体接触。洗涤后，检测结合的放射性水平。由于生物样本中的任何抗原抑制放射性标记的抗原的结合，所以检测到的放射性水平与样本中的抗原的水平成反比。这种测定方法可以通过使用增加已知浓度的分离的抗原的标准曲线来定量。

如对本领域技术人员显而易见的，可以修改这样的测定方法以使用任何报道分子(例如酶或荧光分子)来代替放射性标记。

生物传感器或光学免疫传感器系统

可替代地，使用生物传感器或光学免疫传感器系统确定样本中的足糖萼蛋白的水平。一般来说，光学生物传感器是一种利用光学原理将配体或抗体与靶多肽的结合定量地转化为电信号的装置。这些系统可以分为四大类：反射技术；表面等离子共振；光纤技术和集成光学器件。反射技术包括椭圆偏振技术、多重积分反射光谱仪和荧光毛细管填充装置。光纤技术包括倏逝场荧光、光纤毛细管和光纤荧光传感器。集成光学器件包括平面倏逝场荧光、输入分级耦合器免疫传感器、Mach-Zehnder干涉仪、Hartman干涉仪和差分干涉仪传感器。这些光学免疫传感器的示例由Robins(1991)进行总体描述。这些装置的更具体的描述可以在例如美国专利No.4,810,658、No.4,978,503、No.5,186,897以及Brady等(1987)中找到。

如对本领域技术人员显而易见的，生物样本的类型和大小将取决于所使用的检测手段。例如，虽然优选细胞群体，但可以对包含单个细胞的样本进行测定(如PCR)。此外，基于蛋白质的测定方法需要足够的细胞来为基于抗原的测定方法提供足够的蛋白质。

如本文所使用的，术语“样本”或“生物样本”是指从受试者获得的任何类型的合适材料。该术语包括临床样本、生物流体(例如宫颈液、阴道液)、组织样本、活细胞，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、由此衍生的细胞裂解物。样本可以直接从来源获得或经过至少一步(部分)纯化后使用。对本领域技术人员来说显而易见的是，样本可以在不干扰本公开的方法的任何介质中制备。通常，样本包含细胞或组织和/或为包含细胞或组织的水溶液或生物流体。本领域技术人员会了解选择和预处理方法。预处理可以包括例如稀释粘性流体。样本的处理可以涉及过滤、蒸馏、分离、浓缩。

在一个实施例中，生物样本之前已经来自受试者。因此，在一个实施例中，根据任何实施方式的如本文所描述的方法还包括提供生物样本。

在一个实施例中，使用来自样本的提取物(例如，基因组DNA、mRNA、cDNA或蛋白质)实施根据任何实施方式的如本文所描述的方法。

在一个实施例中，生物样本包括腔上皮细胞和/或腺上皮细胞。例如，生物样本包括腔上皮细胞。在另一个实施例中，生物样本包括腺上皮细胞。

如从前面的描述中显而易见的，本公开的一些测定方法可以利用合适的参考样本或对照进行量化。

用于本公开的方法中的合适的参考样本对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，参考品可以是来自正常个体或已建立的数据集(例如，按年龄、样本类型和/或周期的阶段匹配)的内部参考品(即来自相同受试者)。

在一个实施例中，参考品为内部参考品或样本。例如，该参考品为自体参考品。在一个实施例中，内部参考品是在与分析样本相同的时间从受试者获得。在另一个实施例中，内部参考品是比分析样本较早的时间点从受试者获得的。例如，样本是从前一个周期中获得的。

如本文所使用的，术语“正常个体”应理解为意思是基于他们不是不孕的和/或当前没有怀孕选择受试者。

在一个实施例中，参考品为已建立的数据集。适用于本公开的已建立的数据集对本领域技术人员来说会是显而易见的，并且包括例如：

·一种数据集，其包括来自按年龄、样本类型和/或周期的阶段匹配的另一个受试者或受试者群体的子宫内膜上皮细胞；

·一种数据集，其包括体外子宫内膜上皮细胞，其中该细胞已被处理以诱导足糖萼蛋白表达；以及

·一种数据集，其包括体外子宫内膜上皮细胞，其中该细胞已被处理以抑制足糖萼蛋白表达。

对本领域技术人员来说显而易见的是，在参考样本的上下文中的术语“子宫内膜上皮细胞”包括腺细胞和/或腔细胞。例如，参考样本包括腺细胞和腔细胞。在另一个实施例中，参考样本包括腺细胞。在又一个实施例中，参考样本包括腔细胞。

在一个实施例中，参考品不包括在测定方法中。相反，合适的参考品来源于之前生成的已建立的数据集。然后，将来源于处理、分析和/或测定测试样本的数据与获得的样本数据进行比较。

监测子宫内膜上皮细胞容受性

对本领域技术人员来说显而易见的是，本公开还提供了一种监测受试者的子宫内膜上皮细胞容受性和预测受试者的胚胎植入的最佳子宫内膜上皮细胞容受性的方法，该方法包括：在一个或多个时间点确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

如本文所使用的，关于子宫内膜上皮细胞容受性的术语“监测”可以包括，确定预后、选择药物治疗、评估正在进行的药物治疗、预测结果、确定对治疗的反应(包括并发症的诊断)、跟随周期的进展、提供与患者月经周期相关的信息、或选择最有可能从治疗中受益的患者。

如本文所用的术语“最佳”是指月经周期中对胚胎植入最有利的时间段。

在一个实施例中，监测受试者的子宫内膜上皮细胞容受性的方法包括：确定周期内多个时间点的足糖萼蛋白的水平。例如，在卵巢周期期间的时间点和/或子宫周期期间的时间点确定足糖萼蛋白的水平。在一个实施例中，在卵泡期、排卵期和/或黄体期确定足糖萼蛋白的水平。在又一个实施例中，在月经期、增殖期和/或分泌期确定足糖萼蛋白的水平。此外，可以在周期的单个阶段中的多个时间点确定足糖萼蛋白的水平。例如，在子宫周期的分泌期的多个点上确定足糖萼蛋白的水平。

如上所述，本领域技术人员会理解人类的平均月经周期为28天，然而这是可变的。

例如，卵巢周期每个阶段的平均持续时间为：

·卵泡期：第1至14天；

·黄体期：第15至28天。

例如，子宫周期的每个阶段的平均持续时间为：

·月经期：第1至4天；

·增殖期：第5至14天；

·分泌期：第15至28天。

在一个实施例中，将足糖萼蛋白的水平与受试者在较早时间点的足糖萼蛋白的水平进行比较。在本公开的上下文中提及“较早时间点”是指在任何先前时间点在受试者的另一个样本中确定的水平。例如，较早时间点可以是指与被分析的样本在同一周期中的时间点或在前一个周期中的同一时间点。

如对本领域技术人员显而易见的，在一个周期和/或多个周期的持续时间内监测受试者的足糖萼蛋白的水平的能力将有助于预测胚胎植入的最佳子宫内膜上皮细胞容受性。例如，在受试者的第一个周期中确定监测足糖萼蛋白的水平，并且在受试者的第二个周期中植入胚胎。

不孕症的诊断和预后

如本文所公开的，本公开的发明人已证明足糖萼蛋白在子宫内膜上皮细胞容受性中的作用。对本领域技术人员来说显而易见的是，本文公开的方法将有助于鉴定不孕症和植入失败的根本原因。例如，本公开的方法用作受试者的不孕症的诊断和预后的筛选测试。

因此，例如，本公开提供了一种检测受试者的不孕症的方法，方法包括：确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

如本文所使用的术语“不孕症”是指一种生殖系统疾病，其定义为在12个月或更长时间的定期无保护性交后不能实现临床妊娠。

本公开还提供了一种受试者的不孕症诊断和预后的方法，方法包括：确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平。

如本文所使用的，术语“诊断”是指对受试者的不孕症的鉴定。

如本文所使用的，关于不孕症的术语“预后”是指不孕症诊断的可能或预期的发展、进展和/或结果。

在一个实施例中，受试者有不孕症的风险。

如本文所使用的，“有不孕症的风险”的受试者可以有或者可以没有可检测到的不孕症或不孕症的症状。“有风险(at risk)”表示受试者具有一种或多种风险因素，其是与疾病或病症的发展相关的可测量参数，如本领域已知的和/或本文所描述的。

如果受试者患不孕症的风险高于对照人群，那么该受试者有风险。对照人群可以包括从普通人群中随机选择的一名或多名受试者(例如，按年龄、性别、种族和/或民族匹配)，其没有患不孕症或有不孕症家族史。如果发现与不孕症相关的“风险因素”与受试者相关，则可以认为该受试者有风险。风险因素可以包括与给定病症相关的任何活动、特征、事件或属性，例如，通过对受试者群体的统计或流行病学研究。因此，即使鉴定潜在风险因素的研究并未具体包括受试者，受试者也可以被归类为有风险。

在一个实施例中，本公开的方法在不孕症的症状发作之前或之后实施。

不孕症的症状对本领域技术人员来说是显而易见的并且包括，例如：

·年龄。接近40岁及以上的女性通常比20岁出头的女性生育能力差；

·子宫内膜异位的病史；

·子宫腺肌病的病史；

·慢性病，如糖尿病、狼疮、关节炎、高血压和哮喘；

·激素失衡；

·环境因素，包括吸烟、饮酒以及暴露于工作场所的危害或毒素；

·体脂过多或体脂过低；

·已经用冷冻手术或锥切活检处理的异常巴氏涂片(Pap smear)；

·性传播疾病；

·输卵管疾病；

·多次流产；

·肌瘤；

·盆腔手术；以及

·出生时存在的或之后的人生中发生的子宫异常。

如上所述，监测受试者子宫内膜上皮细胞容受性的方法将有助于受试者的不孕症的诊断和预后。在一个实施例中，诊断和预后受试者的不孕症的方法包括：确定周期内多个时间点的足糖萼蛋白的水平。例如，足糖萼蛋白的水平在卵巢周期期间的时间点和/或子宫周期期间的时间点确定。在一个实施例中，足糖萼蛋白的水平在卵泡期、排卵期和/或黄体期确定。在又一个实施例中，足糖萼蛋白的水平在月经期、增殖期和/或分泌期确定。此外，足糖萼蛋白的水平可以在周期的单个阶段中的多个时间点确定。例如，足糖萼蛋白的水平在子宫周期的分泌期的多个点上确定。

除了本文描述的监测足糖萼蛋白的水平的方法外，还可以使用体内监测足糖萼蛋白的方法。例如，结合足糖萼蛋白的化合物可以用于体内成像的方法。特别是，结合足糖萼蛋白以及偶联或结合至可检测标记和/或涂有可检测标记的化合物(包括造影剂)，可以用于已知的医学成像技术。

为了足糖萼蛋白体内成像，可检测标记可以是能够发出可通过成像检测到的信号的任何分子或试剂。例如，可检测标记可以是蛋白质、放射性同位素、荧光团、可见光发射荧光团、红外光发射荧光团、金属、铁磁物质、电磁发射物质、具有特定MR光谱特征的物质、吸收或反射X射线的物质，或改变声音的物质。

成像方法的实施例包括：MRI、MR光谱、射线照相术、CT、超声波、平面伽马相机成像、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、正电子发射断层扫描(PET)、其它基于核医学的成像、使用可见光的光学成像、使用荧光素酶的光学成像、使用荧光团的光学成像、其它光学成像、使用近红外光的成像或使用红外光的成像。

用于成像的多种技术是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。这些技术中的任何一种都可以在本公开的成像方法的上下文中应用以测量来自与结合足糖萼蛋白的化合物偶联的可检测标记或造影剂的信号。例如，光学成像是一种广泛使用的成像方式。示例包括细胞组分的光学标记和血管造影术，如荧光素血管造影术和吲哚菁绿血管造影术。光学成像剂的示例包括，例如，荧光素、荧光素衍生物、吲哚菁绿、俄勒冈绿、俄勒冈绿衍生物的衍生物、罗丹明绿、罗丹明绿的衍生物、曙红、赤藓红、德克萨斯红、德克萨斯红的衍生物、孔雀绿、纳米金磺基琥珀酰亚胺酯、级联蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶基恶唑衍生物、级联黄染料、dapoxyl染料。

在一个实施例中，使用超声波检测足糖萼蛋白的水平。例如，可检测标记为超声剂。合适的超声剂对于本领域技术人员将是显而易见的和/或在本文中描述。例如，超声剂为微泡释放剂(例如，如Willmann等,2017；Yeh等,2015；Abou-Elkacem等,2015；Tsuruta等,2014所述)。在一个实施例中，检测足糖萼蛋白的化合物与微泡偶联。各种偶联方法对本领域技术人员来说将是显而易见的并且包括，例如，共价和非共价偶联。对受试者施用微泡之后，通过外部施加超声场以增强微泡与其靶标(即子宫内膜上皮细胞)之间的接触。由接近其共振频率的超声场驱动的微泡经历净初级和次级超声辐射力，也称为Bjerknes力。超声可以在超声传播方向上使微泡在相当长的距离(高达毫米)上位移，并且可以引起微泡之间的吸引，从而导致聚集体的形成。因此，微泡可以集中在靶标上。

在一个周期和/或多个周期的持续时间内监测受试者体内足糖萼蛋白的水平的能力将有助于诊断受试者的不孕症，从而建立治疗预后。

提高子宫内膜上皮细胞容受性并治疗植入失败

本发明人还表明了在推定的容受期子宫内膜腔上皮中足糖萼蛋白的持续表达与植入失败有关。

目前在体外受精(IVF)实践中，在胚胎移植之前用黄体酮刺激子宫内膜。然而，施用之前没有优化药物类型、剂量和/或途径，因为没有标记物来评估激素制剂对子宫内膜上皮细胞容受性的有效性。

本发明人已经表明，黄体酮下调腔上皮中的足糖萼蛋白，特别是对于容受性发展。

此外，本发明人已经表明，microRNA miR-145与miR-199是在建立子宫内膜上皮细胞容受性过程中抑制足糖萼蛋白的黄体酮的下游调节物。

因此，发明人的发现为使用足糖萼蛋白作为功能性生物标记物以优化辅助生殖技术的子宫内膜方案提供了基础。例如，发明人的发现还为靶向足糖萼蛋白以治疗植入失败的方法提供了基础。

在本公开的一个实施例中，根据本公开的任何实施例的如本文所述的方法涉及降低足糖萼蛋白的表达和/或水平。

例如，本公开提供了提高受试者的胚胎植入的子宫内膜上皮细胞容受性的方法，包括：确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平，并且任选地基于细胞中足糖萼蛋白的水平，以足以降低子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白的水平的量向受试者施用化合物。

例如，基于细胞中足糖萼蛋白的水平，受试者可能处于前容受性状态，并且向受试者施用化合物足以降低子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白的水平，从而将该受试者转变为容受状态。

这些发现还为评估化合物在提高胚胎植入的子宫内膜上皮细胞容受性的有效性的方法提供了基础。

如本文所使用的，术语“化合物”应理解为是指适用于本文所述任何方法的任何试剂。例如，适用于本公开的化合物是指改变子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白的水平(例如降低水平)的任何试剂。适用于本公开的化合物对本领域技术人员来说是显而易见的并且包括，例如，下调子宫内膜腔上皮细胞中核酸的足糖萼蛋白转录或翻译的任何试剂。例如，合适的化合物包括但不限于激素制剂与核酸。

在本文所述的任何方法的一个实施例中，化合物为激素制剂。适用于本公开的多种激素制剂对本领域技术人员来说是显而易见的，且包括例如黄体酮、孕激素及其类似物和组合。

在本文所述的任何方法的一个实施例中，化合物为核酸。例如，核酸为反义多核苷酸、催化性核酸、干扰RNA、siRNA或microRNA。

反义核酸

术语“反义核酸”应理解为是指DNA或RNA或其衍生物(例如，LNA或PNA)或其组合，其与编码本文所述的如在本公开的任何实施例中的多肽的特定mRNA分子的至少一部分互补并且能够干扰转录后事件(如mRNA翻译)。反义方法的使用是本领域已知的(例如参见Hartmann 1999)。

本公开的反义核酸将在生理条件下与靶核酸杂交。反义核酸包括对应于结构基因或编码区的序列或对应于影响控制基因表达或剪接的序列的序列。例如，反义核酸可以对应于编码足糖萼蛋白的核酸的靶编码区，或5'-非翻译区(UTR)或3'-UTR或这些的组合。它可以与内含子序列部分互补，内含子序列可以在转录期间或之后剪接，例如仅与靶基因的外显子序列互补。反义序列的长度应当至少为19个连续核苷酸，例如，至少50个核苷酸，如编码足糖萼蛋白的核酸的至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用与整个基因转录物互补的全长序列。长度可以是100-2000个核苷酸。反义序列与靶向转录物的同一性程度应当至少为90％，例如95-100％。

催化性核酸

术语“催化性核酸”是指特异性识别不同的底物并催化该底物的化学修饰的DNA分子或含DNA的分子(在本领域中也称为“脱氧核酶”或“脱氧核糖核酸酶”)或RNA分子或含RNA的分子(也称为“核酶”或“RNA酶”)。催化性核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T(和U，对于RNA)。

通常，催化性核酸含有用于特异性识别靶核酸的反义序列，以及核酸切割酶活性(在本文中也称为“催化结构域”)。可用于本公开的核酶类型为锤头状核酶与发夹核酶。

RNA干扰

RNA干扰(RNAi)可用于特异性抑制特定蛋白质的产生。不受理论限制，此技术依赖于dsRNA分子的存在，dsRNA分子含有与感兴趣的基因或其部分的mRNA(在这种情况下是编码足糖萼蛋白的mRNA)基本相同的序列。方便地，可以从重组载体宿主细胞中的单个启动子产生dsRNA，其中，正义和反义序列的侧翼是不相关的序列，这使得正义和反义序列杂交形成dsRNA分子，不相关的序列形成环结构。用于本公开的合适dsRNA分子的设计和制造完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是鉴于WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029和WO01/34815。

杂交的正义和反义序列的长度应当各自至少为19个连续核苷酸，如至少30或50个核苷酸，例如至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。长度可以是100-2000个核苷酸。正义和反义序列与目标转录物的同一性程度应当至少为85％，例如，至少90％，如95-100％。

示例性的小干扰RNA(“siRNA”)分子包含与靶mRNA的约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。例如，siRNA序列从二核苷酸AA开始，包含约30-70％的GC含量(例如，30-60％，如40-60％，例如约45％-55％)，并且与将要引入哺乳动物基因组中的靶标以外的任何核苷酸序列没有高百分比的同一性，例如，由标准BLAST搜索确定。减少足糖萼蛋白的表达的示例性siRNA可以从Santa Cruz Biotechnology商购。

减少足糖萼蛋白的表达的短发夹RNA(shRNA)也是本领域已知的并且可以从SantaCruz Biotechnology商购。

MicroRNA(miRNA或miR)分子包含18到25个核苷酸长度，并且为Dicer酶切割前miRNA的产物。“前miRNA(Pre-miRNA)”或“前miR(pre-miR)”意思为具有发夹结构的非编码RNA，它是pri-miR被称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割的产物。减少足糖萼蛋白表达的示例性microRNA对本领域技术人员来说是显而易见的和/或在本文描述。例如，核酸为microRNA，如miR-199或mir-145。

在一个实施例中，该方法包括确定受试者的子宫内膜上皮细胞中的足糖萼蛋白的水平，并且基于细胞中足糖萼蛋白的水平，以足以降低该细胞中足糖萼蛋白的水平的量施用化合物。例如，基于受试者中足糖萼蛋白的水平，一种或多种或所有剂量、化合物类型和/或途径被修改。

降低该细胞中足糖萼蛋白的水平所需的化合物的量或剂量对于本领域技术人员来说会是显而易见的。剂量不应太大，以免引起不良副作用。一般而言，剂量将随患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果出现任何并发症，个体医生可以调节剂量。

剂量可以从约0.1mg/kg到约300mg/kg变化，例如，从约0.2mg/kg到约200mg/kg，例如，从约0.5mg/kg到约20mg/kg，每天施用一剂或多剂，持续一天或几天。

在一些实施例中，化合物以高于后续(维持剂量)的初始(或加载)剂量施用。

在一些实施例中，使用剂量递增方案，其中化合物最初以低于后续使用剂量的剂量施用。

根据足糖萼蛋白的水平，通过给予多于一次的剂量暴露或设置，可以使受试者用该化合物再次治疗，如至少约两次暴露，例如，约2至60次暴露，更特别地约2至40次暴露，最特别地，约2至20次暴露。

根据本发明的方法的化合物的施用可以是连续的或间歇的，例如取决于接受者的生理状况(不论施用的目的是治疗性的还是预防性的)以及本领域技术人员已知的其它因素。施用可以在预先选择的时间段内基本上连续，或者可以以一系列间隔的剂量，例如，在病症发展期间或之后。

如上所述，监测受试者的子宫内膜上皮细胞容受性的方法将用于监测和确定化合物在提高子宫内膜上皮细胞容受性方面的有效性。在化合物施用期间监测受试者的子宫内膜上皮细胞容受性也将有助于优化受试者的治疗方案。例如，在施用化合物之前和/或之后确定足糖萼蛋白的水平，并相应地调节施用的化合物的剂量、途径和/或类型。

对本领域技术人员来说显而易见的是，化合物的剂量、途径和/或类型的优化将有助于提高受试者的子宫内膜上皮细胞容受性并最大化植入的可能性。

实施例1：材料与方法

用于分离原代子宫内膜上皮细胞的人子宫内膜组织

从Monash医学中心(澳大利亚墨尔本)的人类伦理委员会(Human EthicsCommittee)获得伦理批准，所有患者都提供了知情的书面同意。子宫内膜活检样本获取自经受宫腔镜扩张术、刮宫术或评估输卵管通畅性(tubal patency)的女性。月经周期阶段通过组织的常规组织学日期确定。

原代人子宫内膜上皮细胞(HEEC)的分离

将增殖期(第6-14天)的组织收集到Dulbecco改良的Eagle培养基/F12(DMEM/F12,Thermo Fisher Scientific,MA,USA)中，并且在收集24小时内分离细胞。如前所述(Marwood等,2009)，通过酶消化和过滤分离细胞。简而言之，用来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的胶原酶(7.5U/ml；Sigma)和DNase 1(2000U/ml；Roche,Castle Hill,NSW,澳大利亚)，在37℃水浴中持续振荡2×20分钟，消化子宫内膜组织样本。用含有补充有10％胎牛血清(FBS)(Bovogen Biologicals Pty Ltd,AUS)和1％抗生素-抗真菌剂(Sigma)的DMEM/F12的完全培养基淬灭消化反应，并通过45μm尼龙网过滤。将保留在网上的人子宫内膜上皮细胞(HEEC)用10ml PBS冲洗到新管中，并在室温(RT)以1000rpm离心5min；将细胞沉淀重悬于补充有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM/F12中，接种到24孔板中，并在37℃、5％CO

次日，去除任何未附着的细胞和红细胞，每3天用新鲜培养基补充附着的HEEC，直到达到90-95％汇合。然后使用HEEC研究PCX的激素调节。

从原代HEEC中分离质膜蛋白质

将如上所述分离的但没有进一步培养的原代HEEC用冰冷的裂解缓冲液[含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的25mM咪唑和100mM NaCl，pH 7.0]裂解，并通过27.5号针头和注射器7次，并在4℃以15,000g离心5分钟。将上清液与100mM Na

使用过滤辅助样本制备(FASP)(Expedeon Inc.,CA)柱处理质膜蛋白质(100μg)。通过离心收集来自FASP柱的胰蛋白酶肽，并在C

质谱分析

提取的肽被注射并在纳米超高效液相色谱(UPLC)系统(Waters nanoAcquity,Waters,Milford,MA)上通过纳流反相液相色谱法进行分离，使用nanoAcquity C18 150×0.075mm I.D.柱(Waters)，线性60分钟梯度设置，从95％溶剂A(milliQ水中0.1％甲酸)到100％溶剂B(0.1％甲酸、80％乙腈(Mallinckrodt Baker,Center Valley,PA)和20％milliQ水)，流速为0.4μL/min。将纳米UPLC在线耦合至Q-Exactive质谱仪，该质谱仪配备有纳米电喷雾离子源(Thermo Fisher Scientific,不莱梅,德国)设置以获取全扫描(70000分辨率)，并且使用与单电荷物质的高能碰撞解离选择用于破碎的前10个多电荷物质被忽略。碎片离子进行分析的分辨率设置为17500，离子阈值设置为1e5强度。激活时间设置为30ms，并且归一化碰撞能量步进±20％并设置为26。使用Maxquant算法(1.4版)搜索由全扫描MS和高分辨率MS/MS谱组成的原始文件。胰蛋白酶被设置为两个缺失的切割，并且搜索了具有氧化蛋氨酸的可变修饰集的文件，并以脲甲基化(carbamidomethyl)半胱氨酸残基的形式固定修饰(使用默认Maxquant设置，修饰肽的截止分数和δ分数分别设置为40和17)。还使用Mascot(Matrix Science,伦敦,UK；版本2.4.1)分析了所有MS/MS样本。使用0.040Da的碎片离子质量容差和20PPM的母离子容差搜索Mascot。半胱氨酸的脲甲基化在Mascot中被指定为固定修饰。甲硫氨酸的氧化和N末端的乙酰化(acetyl)在Mascot中被指定为可变修饰。

然后在Scaffold中分析报道的肽(版本Scaffold4.4.1.1，Proteome SoftwareInc.，波特兰，OR)。如果可以通过Scaffold Local FDR算法以大于95％的概率建立肽鉴定，则接受肽鉴定。如果蛋白质鉴定能够以大于90％的概率建立并且包含来自每个样本的至少一种鉴定的肽，则蛋白质鉴定被接受。

原代HEEC的培养与激素治疗

将汇合的HEEC接种到12孔板或玻璃盖玻片中，在湿润孵育器中于37℃和5％CO

来自正常健康女性的子宫内膜组织用于PCX蛋白的定位

子宫内膜组织是根据北卡罗来纳大学(University of North Carolina)和格林维尔医院系统(Greenville Hospital System)的人类受试者保护伦理委员会(EthicsCommittee for the Protection of Human Subjects)获得的。活检样本(Biopsies)取自月经周期不同阶段的正常健康女性，月经间隔为25-35天(n＝22)。排除标准包括：年龄<18或>35岁，体重指数>29，过去一年内PAP测试异常、尝试或当前怀孕、性活跃且未使用避孕套、已放置宫内节育器、流产史、子宫异常(如肌瘤)、母乳喂养、影响子宫内膜形态的药物、已知的宫颈狭窄、对必妥碘(betadine)过敏和潜在的医学疾病。周期天数由月经的第一天决定。尿液LH由家用检测试剂盒(Ovuquick One Step,Conception Technologies,SanDiego,CA)确定。子宫内膜样本按报告的周期天数和LH激增(LH+)后的天数进行分类。苏木精和曙红也证实了周期的天数。子宫内膜活检样本取自月经周期的增殖期(n＝5)、分泌早期(n＝6，LH+4-5)、分泌中期(n＝6，LH+7-10)与分泌晚期(n＝5，LH+12-13)。所有子宫内膜活检样本均固定在福尔马林中并包埋在石蜡中。

PCX在人子宫内膜组织中的免疫组织化学定位

子宫内膜切片(5μm)在组织溶胶(histosol)中脱蜡、再水化并通过微波(在pH 6.0的0.01M柠檬酸盐缓冲液中，高功率10分钟)回收抗原。将内源性过氧化物酶用3％H

子宫内膜组织中PCX染色的量化

使用图像分析软件Fiji 1.51o(国立卫生研究院(National Institutes ofHealth),Bethesda,MD)对载玻片进行盲分析。对于每个切片，获取LE、GE与BV的三个代表性图像。每个图像都通过使用滚球算法的背景减法以及使用内置载体苏木精和二氨基联苯胺(HDAB)插件的“颜色反卷积”进行分析，其将图像分成3个面板：苏木精、DAB和背景。在DAB面板(显示PCX染色)上，使用手绘工具选择感兴趣区域并测量其灰度值。每个切片的平均灰度值从三个代表性图像计算并转换为光密度单位[ODU＝log

蛋白质印迹分析

用含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mMEGTA、2mM EDTA、1％Triton X裂解细胞。将裂解物在干冰上冷冻10分钟，然后在室温下解冻5分钟。这种冻融循环重复了3次。然后，将样品在4℃以14000rpm离心10分钟，并且在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离含有蛋白质的上清液并转移到聚二氟乙烯膜(GE Healthcare,Rydalmere,NSW,澳大利亚)上。用含0.02％Tween20的5％BSA的Tris缓冲盐水[10mmol/LTris(pH7.5)和0.14mol/L NaCl]封闭膜。三种PCX抗体用于蛋白质印迹分析：Ab1针对高度糖基化的粘蛋白区域aa 23-427(AF1658,R&D Systems Minneapolis,MN)产生；Ab2针对细胞外结构域的一部分aa 251-427(3D3,Santa Cruz,Dallas,TX)产生(Kershaw等,1997)；Ab3针对PCX的细胞外、跨膜和细胞内部分aa 300-500(EPR9518,Abcam,Cambridge,UK)产生(Kershaw等,1997)。合适的二抗包括山羊IgG-HRP、小鼠IgG-HRP或兔IgG-HRP(Dako,Victoria,澳大利亚)。使用Lumi光增强剂溶液(Roche)使条带可视化。探测膜中的β-肌动蛋白(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)以进行上样控制。含有PCX细胞外部分的重组人PCX(rPCX,aa23-427,R&D Systems)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为阳性对照。将这个实验重复了四次。

Ishikawa细胞中PCX的瞬时敲低(knockdown)

将Ishikawa细胞(日本茨城县霞浦医疗中心国立医院组织(National HospitalOrganization,Kasumigaura Medical Center,Ibaraki-ken,Japan)的Masato Nishida教授慷慨捐赠)在完全培养基中在6孔板中以5.6×10

Ishikawa细胞中PCX的稳定过表达

人PCX开放读取(RC210816)的表达构建体和空pCMV6(对照质粒)购自Origene。Ishikawa细胞在6孔板上生长以在补充有10％FBS、1％抗生素-抗真菌剂和1％L-谷氨酰胺的MEM培养基中汇合，然后如前所述用PBS洗涤并在次日补充Opti-MEM培养基用于转染(Heng等,2015)。将质粒DNA(包含PCX或对照)和脂质体转染试剂(Life Technologies)以1:3比例在Opti-MEM培养基(Life Technologies)中的预混物添加到孔中(1μg DNA/孔)，并且在湿润孵育器中于37℃和5％CO

通过qRT-PCR确定Ishikawa细胞中的PCX

使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)从原代HEEC、HUVEC和Ishikawa细胞(PCX-OE、PCX-KD与对照)中提取总RNA，并用TURBO DNA去除(DNA-free)试剂盒处理(Invitrogen,Vilnius,立陶宛)。根据制造商的说明，使用Superscript III第一链合成系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)逆转录总RNA(500ng)。如上对PCX进行qRT-PCR。定量PCR在Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统上进行，使用Power SYBR Green PCR预混物(Applied Biosystems,Warrington,UK)和表1中列出的引物。

表1：引物序列

原代HEEC中PCX的免疫荧光分析

将在玻璃盖玻片上生长的细胞用冰冷的甲醇固定10分钟，然后用PBS冲洗3次。将细胞用0.1％Triton-X100的PBS渗透化5分钟，然后含有15％马血清和2％人血清的PBS封闭30分钟。将细胞与Ab1(6μg/ml)于4℃在5％马血清/PBS中孵育过夜。次日，用含有0.2％Tween20的PBS洗涤细胞3次5分钟，并与马抗山羊生物素化二抗(以10μg/ml，VectorLaboratories，Peterborough，UK)在RT下孵育1小时，然后与链霉亲和素偶联的AlexaFluor 488(以10μg/ml，Invitrogen，Carlsbad，CA)在RT下孵育2小时。细胞核用DAPI(以0.5μg/ml，Sigma)染色。通过荧光显微镜(Olympus Optical，Tokyo，日本)使信号可视化。

Ishikawa细胞对纤连蛋白的粘附的分析

Ishikawa细胞对纤连蛋白的粘附的分析如之前在Heng等(2015)中所描述的进行。

简而言之，96孔板用10μg/ml纤连蛋白(Corning Life Sciences,Tewksbury,MA)涂覆，并将Ishikawa细胞(PCX-OE、PCX-KD或对照)添加到纤连蛋白涂覆的孔(2×10

从足月胎盘中收集并分离滋养层绒毛(trophoblast villi)

从蒙纳士健康人类研究伦理委员会(Monash Health Human Research EthicsCommittee)获得伦理批准，且所有受试者都提供了知情的书面同意，以收集来自健康足月单胎妊娠的选择性剖腹产的胎盘样本。

如前所述分离滋养层(Wallace等,2017)。简而言之，将胎盘子叶切除并用Hank平衡盐溶液清洗，从子叶上刮下绒毛(约25g)，并且用含有DMEM低葡萄糖、1％青霉素、1％链霉素、0.25％胰蛋白酶、0.25％II级分散酶、0.1mg/ml DNase 1的缓冲液在37℃振动型水浴中消化15分钟。3个循环消化后，细胞悬液通过Percoll梯度离心分离，收集滋养层细胞并在含10％FBS、1％抗生素-抗真菌剂的DMEM中于37℃、8％O

原代滋养层球状体的制备

按照制造商的方案，AggreWellTM 400板(Stemcell Technologies,Vancouver,加拿大)用2ml抗粘附冲洗液预冲洗，在RT下以2000g离心5分钟，并用2ml的DMEM/F12培养基洗涤。将原代滋养层细胞胰蛋白酶化，并重悬于EB形成培养基(Stemcell)中，并且以9.6×10

为了球状体侵入研究，离心之前将每1ml活跃细胞标记的溶液DiO或DiI(ThermoFisherScientific)5μl添加到培养基中。孵育48小时后形成直径约100μm的滋养层球状体。通过手动移液将球状体从Aggrewell板上移出，通过40μm细胞过滤器以去除尺寸小于约100μM的球状体。通过将细胞过滤器在板顶部反转，将最终的球状体收集到低结合的6孔板中，并用补充有10％FBS、1％抗生素-抗真菌剂的DMEM/F12冲洗，用于附着和侵入实验。评估原代滋养层球状体对Ishikawa单层的附着

对照或PCX-OE Ishikawa细胞在96孔平底板中于37℃培养过夜以形成单层。然后将同时制备的原代滋养层球状体转移到Ishikawa单层的顶部(在100μl培养基中每孔约30个球状体)，并且分别孵育1h、2h、4h、6h、12h或24h。在用PBS洗涤孔3次以去除未附着的球状体之前，计算每个孔中添加的滋养层球状体的确切数量。加入新鲜培养基，并且计数每个孔中附着的球状体，并计算附着率(附着的/洗涤前(pre-wahsed)的球状体的百分比)。每个实验均基于一式三份的孔的平均值，最终数据表示为3-5次独立实验的平均值±SD。

穿过Ishikawa单层的原代滋养层球状体的评估

包含8孔室的玻璃盖玻片(Sarstedt，德国)用在DMEM中的1型胶原蛋白(Merck-Millipore，USA)与人纤连蛋白(Corning，USA)的混合物涂覆，在RT下持续10分钟，然后在37℃持续1小时。对照与PCX-OE Ishikawa细胞在基质顶部在含有G418的条件培养基中培养，以在37℃、5％CO

人类胚胎附着的评估

将对照或PCX-OE Ishikawa细胞在含有G418的条件培养基中在37℃、5％CO

使用在生殖医学中心(Centre for Reproductive Medicine(CRG),UZ Brussels,比利时)收集的冷冻保存的人类胚胎得到了研究所伦理委员会和联邦体外人类胚胎科学研究委员会(Institute Ethical Committee and the Federal Committee for ScientificResearch on Human Embryos in vitro)的批准。在获得患者书面知情同意的情况下，用于这项特定研究的胚胎来自在法定冷冻保存期五年后捐赠给研究的胚胎。受精后5天(dpf)的优质玻璃化胚泡，其是根据Gardner和Schoolcraft标准(Gardner等,1999)的内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)的评分为A或B的完整且不断扩大的胚泡，按照制造商的方案使用玻璃化解冻试剂盒(Vit Kit-Thaw,Irvine Scientific,USA)对其进行加热，并转移到25μl的Origio胚泡培养基(Origio,荷兰)的小滴中，用于在37℃、20％O

穿过Ishikawa单层的人类胚胎评估

如前所述，在含有8孔室的玻璃盖玻片上的一层基质上制备对照与PCX-OEIshikawa细胞的单层，用于评估穿过Ishikawa单层的滋养层球状体。该模型还使用了与上述附着测定具有相同选择标准的6dpf胚胎，但不是加热5dpf胚胎，而是加热3dpf胚胎，因为在建立侵入模型之前，胚胎需要用DiO或DiI染色。因此，根据Gardner和Schoolcraft标准(Gardner等,1999)，在压实C1和C2阶段的优质玻璃化3dpf胚泡，按照制造商的方案使用玻璃化解冻试剂盒(Vit Kit-Thaw，Irvine Scientific，USA)进行加热，并被转移到25μl的Origio胚泡培养基(Origio,The Netherlands)的小滴中，用于在37℃、20％O

滋养层球状体与人胚胎侵入的共聚焦成像分析

使用Imaris软件(版本9.2.1，Bitplane，AG)对与Ishikawa单层(对照或PCX-OE)共培养的原代滋养层球状体或人类胚胎进行表面绘图。侵入的程度由通过单层侵入并存在于Ishikawa单层下方的球状体/胚胎的体积确定。

对照与PCX-OE Ishikawa细胞的RNAseq

在补充有10％FBS、1％抗生素-抗真菌剂和1％L-谷氨酰胺的MEM培养基中，以5.6×10

实施初始原始读数处理，并且使用FastQC(Andrews 2010)评估原始75bp单端FASTQ读数的质量，并使用R/Bioconductor包ngsReports(Ward等2018)汇总结果。然后，使用AdapterRemoval(Schubert等2016)修剪序列衔接头的读数并使用RNA-seq比对算法STAR(Dobin等2013)与人类基因组GRCh37比对。比对之后，使用featureCounts(Liao等2014)将映射的序列读数汇总到GRCh37.p13(NCBI:GCA_000001405.14 2013-09)基因间隔，并且将计数表转移到R统计编程环境中进行表达分析。还使用Picard工具包(http://broadinstitute.github.io/picard)中的MarkDuplicates函数研究了序列重复的效果。

使用Bioconductor包edgeR(Robinson等2009；McCarthy等2012)和limma(Richie等2015)在R中进行基因表达分析。通过去除大于两个样本中低于百万分之一计数(cpm)的基因，过滤低表达计数的基因计数，然后通过M值的修剪平均值方法进行归一化(TMM；Robinson&Oshlack，2010)。通过线性建模与经验贝叶斯调节(empirical Bayesmoderation)，对limma中的voom函数中可获得的log-CPM计数和精确权重实施差异基因表达(Law等2014)。

使用biomaRt(Durinck等2009)中可用的Ensembl注释(http://grch37.ensembl.org)对结果实施注释，并使用pheatmap包在热图中显示表达结果(Kolde2019)。使用clusterProfiler(Yu等2012)和msigdbr(Dolgalev 2018)对KEGG通路(https://www.genome.jp/kegg/path way.html)和分子特征(MSigDB)数据库(Liberzon等2015)进行了额外的通路和基因集富集分析。

Ishikawa细胞中连接蛋白(junctional protein)的免疫荧光法

对照与PCX-OE Ishikawa细胞在玻璃盖玻片上生长，固定在4％(w/v)多聚甲醛(用于分析E-钙粘蛋白、Wnt-7A、闭合蛋白-4(claudin-4)与ZO-1)或100％甲醇(用于闭锁蛋白(occludin))中。然后使用针对单个抗体优化的方案在RT下封闭细胞，E-钙粘蛋白：10％马血清和1％BSA的PBS 1小时；Wnt-7A：10％马血清的PBS 2小时；闭合蛋白-4：含10％马血清、2％人血清、0.1％鱼皮明胶和0.1％Triton X-100的含0.2％Tween20的PBS 1小时；ZO-1：1％BSA的PBS 2小时；以及闭锁蛋白：含10％山羊血清、2％人血清、0.1％鱼皮明胶和0.1％Triton X-100的含0.2％Tween20的PBS 1小时。

用一抗、E-钙粘蛋白(2μg/ml，ab1416，Abcam)、Wnt-7A(6μg/ml，AF3008，R&D)、闭合蛋白-4(6μg/ml，sc-376643，Santa Cruz)、闭锁蛋白(1μg/ml，71-1500，Thermo Fisher)与ZO-1(10μg/ml，61-7300，Thermo Fisher)在4℃下对细胞进行过夜探测。次日，将细胞在PBS中洗涤3次，15分钟，与合适的生物素化二抗在RT下孵育1小时，然后，加入链霉亲和素偶联的Alexa Fluor 488在RT下持续1小时。细胞核在RT下用DAPI染色5分钟(0.5μg/ml，在PBS中，Sigma)。通过荧光显微镜(Olympus Optical,Tokyo,日本)可视化荧光信号。

Ishikawa单层通透性的评估

为了测量跨上皮电阻(TER)和异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的葡聚糖40,000从上孔到下孔的转运，使用了涂有10μg/ml纤连蛋白(BD Biosciences，NSW，AUST)的可渗透transwell小室(insert)(6.5mm，0.4μm孔，Corning，NY)。将对照与PCX-OE Ishikawa细胞接种(每个小室6×10

为了测量FITC葡聚糖的转移(passage)，还将对照与PCX-OE Ishikawa细胞培养96小时。然后，将含有2％G418的新鲜完全培养基添加至底腔室中，而将含有2％G418与FITC葡聚糖(1mg/ml，Sigma)的新鲜完全培养基添加至上腔室中。将细胞在37℃孵育2h，收集来自底腔室的培养基并用PBS按1:5稀释，用于在485/535nm处进行荧光测量(Clariostar,BMGLabTech,Victoria,澳大利亚)。在减去背景(仅PBS)后获得最终的荧光读数，并且数据表示为四个独立实验的平均值±SD。

从子宫内膜刮擦(scratching)过程中获得的子宫内膜组织

获取在生育治疗期间子宫内膜刮擦过程中活检的一组存档子宫内膜组织，用于腔上皮中PCX的免疫组织化学分析。所有活检均在紧接IVF治疗之前一个月的自然周期中的分泌中期(d20-24)进行。所有患者在进行刮擦过程之前都经历了≥2个周期的植入失败，并且在紧接刮擦后的下一个周期中移植了单个高质量的胚胎(A-C级)。样本于2012-2016年之间在Monash IVF(Clayton，VIC，澳大利亚)进行活检，并在福尔马林固定后由Anatpath服务(Gardenvale，VIC，澳大利亚)分析/存档。从Monash Health获得了从Anatpath获取此类组织用于本研究的伦理批准。

统计数据

GraphPad Prism 7.00版(GraphPad Software,San Diego,CA)用于非配对t检验、单向方差分析或Fisher精确检验的统计分析(在适当的情况下)，且数据表示为平均值±SD。显著性定义为*P<0.05，**P≤0.005，***P≤0.0005和****P≤0.0001。

实施例2：原代人子宫内膜上皮细胞中足糖萼蛋白的蛋白质组学鉴定

如实施例1所描述的，分离来自人子宫内膜组织的原代子宫内膜上皮细胞(HEEC)并富集质膜蛋白质。

通过质谱分析得到的蛋白质，共鉴定出250种蛋白质(表2)。其中47个被认为是细胞膜蛋白，其中10个与细胞粘附有关，包括足糖萼蛋白(PCX)。

为了证实蛋白质组学发现，使用针对人PCX不同区域的3种抗体通过蛋白质印迹法分析从增殖期子宫内膜(至于蛋白质组学研究)分离的原代HEEC的总细胞裂解物。

由所有3种抗体均检测到约150kDa的优势条带，在两种细胞类型中具有相容性水平。Ab1在HUVEC和HEEC中检测到额外的约80kDa较弱的条带，而Ab2主要在HUVEC中识别出约45kDa、37kDa和30kDa的额外条带。rPCX的大小略小于150kDa，与它仅包含细胞外结构域一致。这些数据证实PCX在增殖期的子宫内膜上皮细胞中表达。

RT-PCR分析进一步验证了这一发现，检测了HEEC和HUVEC中PCX mRNA转录物的相容性水平(阳性对照；图1)。

实施例3：PCX定位于人子宫内膜上皮细胞和内皮细胞的顶端膜，并在腔上皮中特异性下调，与容受性建立相符合

如实施例1所描述的，通过免疫组织化学检查PCX在整个月经周期中在人子宫内膜中的细胞定位。

所有3种PCX抗体都检测到类似的染色模式。在增殖期，PCX强烈定位于腔上皮细胞与腺上皮细胞(分别为LE与GE)以及血管(BV)中的内皮细胞的顶端表面。基质显示没有/低于检测。这种模式或多或少地持续到分泌早期，之后出现了巨大的差异，尤其是在LE中。在分泌中期，虽然PCX染色在GE与BV两者中仍然很强，但在LE中几乎检测不到。在分泌后期，虽然LE继续具有最小的PCX，但与较早期相比，GE显示出较淡的PCX染色。

对整个周期的LE、GE和BV中的PCX染色进行量化(图2A-C)。如图2所示，LE随着周期的进展显示出最剧烈的变化。LE中的PCX在增殖期最高，但从分泌中期显著且特别地减少，这与容受性的建立相符合。相比之下，GE中的PCX为可变的，直到分泌后期才显示出显著减少。BV中的PCX没有显示出显著的周期依赖性变化。

实施例4：在体外原代HEEC中，PCX被雌激素增强并被黄体酮减少

因为雌激素(E)和黄体酮(P)分别驱动子宫内膜增殖与分化，所以确定了这些激素对原代HEEC中PCX的影响。

来自增殖期(至于蛋白质组学研究)的原代HEEC被分离并单独用E处理(以模拟增殖期)，或分别在E引发48、72和96小时后用P处理(E+P，以模拟分泌期)。实时RT-PCR分析显示，尽管E和E+P的时间依赖性变化在统计学上均不显著，但是PCX mRNA通过E逐渐但细微地增加，而通过E+P随着时间减少(图3A)。然而，在72小时，用E+P处理比单独用E处理的细胞中的PCX mRNA显著更低，并且在96小时极其显著(图3A)。蛋白质印迹分析显示了类似的PCX蛋白变化的模式，尽管E与E+P之间的差异仅在96小时显著(图3B)。

为了进一步验证此发现，通过免疫荧光分析了用E或E+P处理96小时的HEEC。用E处理的细胞显示出强烈的PCX染色，而用E+P处理的细胞显示出大大减少的PCX的水平。总体而言，这些结果与原代HEEC中E促进而P减少PCX一致。然而，分离的细胞中的PCX的变化不像在子宫内膜组织的LE中观察到的那样剧烈，很可能是因为原代细胞为LE和GE来源的混合物(由于缺乏标记物，进一步的亚型纯化是不可能的)。然而，这些结果支持P减少子宫内膜上皮细胞中PCX的观点。

实施例5：PCX敲低增加而过表达减少Ishikawa细胞粘附性

PCX独特的表达模式和激素调节促使研究PCX是否影响对于胚胎植入的上皮细胞容受性。由于原代HEEC的稀缺性，Ishikawa细胞被用于功能研究。Ishikawa细胞中的PCX表达水平被改变，并确定了它们对纤连蛋白的粘附性。

PCX在Ishikawa细胞中被siRNA瞬时敲低(KD)。实时RT-PCR分析显示，与对照(CON)细胞相比，PCX-KD中的PCX mRNA减少了60％(图4A)。蛋白质印迹分析进一步证实了这种敲低。当测试对纤连蛋白的粘附性时，PCX-KD细胞的粘附性是对照的2.5倍(图4B)，这表明减少PCX增加了它们的粘附性。

在此之后，PCX在Ishikawa细胞中过表达(OE)。全长人PCX稳定转染到Ishikawa细胞中，并且通过RT-PCR(图4C)和蛋白质印迹证实了PCX过表达。PCX-OE细胞表达的PCX是对照细胞表达的2.8倍。这些PCX-OE细胞对纤连蛋白的粘附性比对照低75％(图4D)。总体而言，这些结果表明PCX表达的水平与Ishikawa细胞粘附性之间存在负相关。

实施例6：PCX过表达减少了Ishikawa细胞对滋养层球状体附着的容受性

使用体外模型(Heng等,2015)检测了PCX-OE对Ishikawa对胚胎附着的容受性的影响，其中Ishikawa细胞的单层模拟子宫内膜腔上皮，并且由原代人类滋养层制成的球状体(约100μm)模拟胚泡。在Ishikawa单层的顶部共培养相同数量的球状体，并且在24h内评估了稳定的球状体附着(图5)。对于对照单层，25％的添加的球状体在1h内附着，42％在2h内附着，72％在4h内附着。此后，随着时间的推移，附着缓慢增加，到12h达到76％，到24h达到最大值91％。然而，如图5所示，PCX-OE单层显示出非常不同的附着动力学。1h内只有6％的球状体附着，2h内则为11％；到4h时附着缓慢增加到22％，到6h时附着增加到27％。即使在12h，球状体对PCX-OE单层的附着(64％)仍然显著低于对照(76％)。仅仅到24h，PCX-OE达到82％的最大附着率时才与对照没有显著差异。这些结果表明，PCX减少了Ishikawa细胞对滋养层球状体附着的容受性，并减慢了附着的过程。

实施例7：PCX过表达阻碍滋养层球状体通过Ishikawa单层的侵入

在人类中，植入需要胚胎附着至腔上皮，然后在上皮细胞之间穿过以移动到基质。为了研究PCX是否影响滋养层球状体穿过Ishikawa单层的过程，我们用不同的染料标记了滋养层球状体与Ishikawa细胞，在一层基质上培养Ishikawa细胞以形成单层，然后分别在上面共培养球状体24小时和48小时。通过共聚焦z堆栈扫描显微镜检测了Ishikawa单层内滋养层球状体的位置。到24小时，对照单层清晰可见球状体侵入，然而，PCX-OE单层的过程才刚刚开始。到48小时，所有球状体都穿透了单层，但PCX-OE的穿透程度仍然明显低于对照细胞。Ishikawa单层下方存在的球状体的体积被量化为侵入的测量(图6)。PCX-OE单层下方的平均球状体体积在24小时和48小时分别为对照的30％(非常显著)和40％(显著)。这些数据表明，PCX-OE使滋养层球状体更难穿过Ishikawa单层。

实施例8：Ishikawa细胞中的PCX过表达也阻碍了人类胚胎的附着和侵入

使用人类胚胎代替滋养层球状体重复体外附着和侵入测定。将人胚泡在对照与PCX-OE Ishikawa细胞单层上共培养，并且分别在15h和24h评估稳定附着(图7A)。在15h时，65％的添加的胚泡附着于对照单层，而只有25％的胚泡附着于PCX-OE单层。然而，到24h，两种单层的附着率都达到了78％。该数据表明，Ishikawa单层中的PCX再次减少了胚胎附着的速度，这与使用滋养层球状体的观察结果一致。

然后，评估了通过Ishikawa单层的胚胎侵入。将染料标记的胚泡在染料标记的Ishikawa单层上共培养24h，通过共聚焦成像检测单层内胚胎的位置。PCX-OE的胚胎侵入在视觉上比对照单层更少。穿透PCX-OE单层的胚胎的量化体积显著小于对照(图7B)。还评估了在48h时的胚胎侵入，然而到那时，所有胚胎都已经塌陷，没有可用的数据。这些结果表明，PCX还阻碍了胚胎穿过Ishikawa单层，这再次与使用滋养层球状体的观察结果一致。

实施例9：PCX过表达下调细胞粘附与植入所需的基因，但上调那些控制上皮屏障功能的基因

对照与PCX-OE Ishikawa细胞的RNAseq分析

为了理解PCX如何使Ishikawa细胞对胚胎附着与侵入的容受性降低，通过RNAseq比较了对照与PCX-OE Ishikawa细胞的总mRNA转录。检测到15103个基因的表达，并且通过无监督聚类分析将两种细胞类型聚类为两个不同的组(数据未示出)。发现两组之间共有940个基因表达显著不同[p<0.01，Log(2)FC>2或<-2]，与对照相比，PCX-OE中有659个下调和281个上调(表3)。

表3.PCX-OE与对照Ishikawa细胞之间表达显著不同的基因。

通过KEGG通路富集分析发现这些差异表达基因(DEG)在20个分子通路中富集(表4)，在这些通路中更多的基因被下调而不是上调。可以与胚胎植入相关的通路包括ECR受体相互作用、细胞粘附、局灶粘附(focal adhesion)与钙信号传导、Wnt和cAMP以及白细胞跨内皮迁移(表4)。

表4：差异表达基因富集的分子通路

由于细胞粘附与上皮细胞连接对于胚胎附着与侵入特别重要，所以对这些途径实施了更集中的分析。对于细胞粘附相关基因，59个差异表达，其中41个(70％)下调，18个(30％)上调。对于上皮紧密连接，46个基因显示出差异表达，其中20个(43％)下调并且26个(57％)上调。对于粘附连接，32个基因差异表达，12个(37％)下调，20个(63％)上调。对于间隙连接，36个显示差异表达，26个(72％)下调并且10个(28％)上调。总体而言，这些数据表明PCX-OE优先降低参与细胞粘附与间隙连接的基因的表达，但增加与紧密/粘附连接相关的基因的表达。特别是，在PCX-OE中的主要粘附连接基因CDH1(编码E-钙粘蛋白)、紧密连接基因TJP1(ZO-1)、CLDN4(闭合蛋白4)与OCLN(闭锁蛋白)均比对照细胞显著上调，这通过实时RT-PCR分析得到了进一步验证(图8)。

进一步研究DEG以鉴定已知与胚胎植入相关的那些。如图8A-F所示，许多它们的表达与植入失败有关的基因，如WNT7A(Wnt家族成员7A、Wnt 7A)和LEFTY2(左右决定因子2)，在PCX-OE细胞中极其显著上调。相比之下，许多容受性促进因子，包括LIF(白细胞介素6家族细胞因子)、CSF1(集落刺激因子1)、ERBB4(HER4)、FGF2(成纤维细胞生长因子2)、TGFB1(TGF-β-1)，以及一些基质金属肽酶，如MMP14(MT1-MMP)，在PCX-OE细胞中极其显著下调(图8G-L)。这些结果表明PCX作为子宫内膜容受性的上游负调节物。

PCX加强细胞间连接并提高上皮屏障功能

由于PCX-OE细胞的主要功能特征为抑制通过Ishikawa单层的胚胎侵入，研究了细胞连接蛋白E-钙粘蛋白、Wnt 7A、闭锁蛋白、闭合蛋白4与ZO-1的免疫荧光。与对照细胞相比，所有这些蛋白质在PCX-OE中都明显升高，这与它们的mRNA表达显著上调一致。这些染色结果表明，PCX-OE细胞比对照Ishikawa细胞更紧密地相互连接。为了证实此结果，测量了跨单层的跨上皮电阻(TER)，其为对上皮屏障完整性的生物物理测量。PCX-OE中的TER显著高于对照单层(图9A)。还确定了单层对于大分子的通透性。将FITC标记的葡聚糖(Mol wt40kDa)添加到单层的顶部，并且通过测量底腔室中的荧光信号以量化其到底部的通量。通过PCX-OE单层的葡聚糖转移非常显著低于对照(图9B)，这与更紧密地连接的PCX-OE细胞一致。总体而言，这些结果表明PCX作为主要的上皮细胞密封剂，上调一系列细胞连接蛋白以加强细胞间连接并提高上皮屏障功能。因此，这些数据为滋养层球状体和胚胎为什么穿过PCX-OE单层比对照Ishikawa单层更难提供了新的分子与机制见解。

总体而言，这些研究表明，PCX在控制上皮细胞连接和单层完整性方面发挥关键的调节作用。因此，PCX负调节上皮细胞对胚胎附着和侵入的容受性，并且子宫内膜LE中的PCX下调是建立子宫内膜容受性的功能必需条件。

实施例10：推定的容受性子宫内膜中LE中的阳性PCX免疫染色与IVF患者的植入失败显著相关

为了进一步证实LE中的PCX为胚胎植入的子宫内膜容受性的负调节物，对来自IVF患者的子宫内膜组织中的PCX进行了检测。在许多生育中心的当前实践中，在2-3个周期后未能植入形态正常胚胎的患者在下一个周期之前的分泌中期(推定容受的)进行“子宫内膜刮擦活检”。该活检是在胚胎正常移植的这个特定时间进行的，因为1级证据表明，与刮擦相关的损伤导致下一个周期中的植入率更高，尽管其有效性存在争议(van Hoogenhuijze等,2019；Frantz等,2019；Sar-Shalom等,2018:Nastri等,2015；Gnainsky等,2010)。获得了之前在澳大利亚Monash的IVF处进行活检的86个此类组织。这些患者已在下一个周期移植了单个高质量的胚胎，并且他们的植入结果是已知的。

通过免疫组织化学检测了这些子宫内膜组织中的PCX，并确定了LE中的PCX染色与植入结果之间的关系(表5)。所有组织(n＝86)在腺体和血管中都显示出阳性PCX染色(数据未示出)。当检测LE染色时，这些组织中有66个(77％)对PCX呈阴性(PCX-)，而剩余20个(23％)的LE细胞中大于1/4对PCX染色呈阳性，其被定义为PCX+。

表5.足糖萼蛋白表达与植入失败的关系

然后，分别分析PCX-和PCX+组中的植入结果(6周超声)(图10)。整个组中总共有30例(35％)实现了成功植入。在PCX-组(总共66例)中，27例(41％)植入成功，而其他39例(59％)则植入失败。然而，在PCX+组(总共20例)中，仅3例(15％)植入成功，17例(85％)植入失败。两组之间的差异为统计显著的(p＝0.036，Fisher精确检验)。

这些结果提供了重要的临床证据，证明LE中的PCX是胚胎植入的重要的负调节物。此外，该数据结合早期的功能研究表明，LE中的子宫内膜PCX阳性也可以导致IVF患者的植入失败。

实施例11：microRNA对子宫内膜上皮细胞的PCX的调控

研究了黄体酮诱导人子宫内膜上皮细胞中的PCX下调对于容受性背后的分子机制。生物信息学鉴定了13种可以靶向PCX的潜在miRNA(表6)，并且检测了它们对于黄体酮诱导的子宫内膜上皮细胞中PCX下调的参与。

表6.生物信息学预测的可以靶向PCX的miRNA

分离原代人子宫内膜上皮细胞，用雌激素(E，以模拟增殖期)或雌激素加黄体酮(E+P，以模拟分泌期)处理96h，并且通过实时RT-PCR分析上述miRNA的水平。此外，使用了对照microRNA(hsa-miR-361-5p)。

简而言之，通过mirVana

在E+P处理后，一些miRNA显示没有检测到，并且许多显示出可变的和不一致的变化。然而，与单独用E处理的细胞相比，miR-145与miR-199在E+P中显示出适中但一致且显著的上调(图11)。E+P相对于E处理后的平均倍数变化对于miR-145为1.38，对于miR-199为1.50。

这些结果表明，这两种miRNA可以介导黄体酮在容受性建立中下调PCX。

为了证实这两种miRNA能够直接下调PCX，将这些miRNA的模拟物转染到人子宫内膜上皮Ishikawa细胞系中，并检测对PCX表达的水平的影响。

Ishikawa细胞在12孔板(3.0×10

转染后，miR-145与miR-199均显著下调PCX mRNA(图12)。两种miRNA在24h时都将PCX mRNA抑制了约34％，并且这种抑制增加至约50-60％，并在48-72h达到稳定状态。当两种miRNA一起转染时，没有明显的协同效应。

这些结果证实了miR-145与miR-199都能够抑制子宫内膜上皮细胞中PCX的表达。

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序列表

<110> 哈德逊医学研究所

<120> 预测子宫内膜容受性的方法

<130> 530033PCT

<150> AU 2019902204

<151> 2019-06-25

<160> 44

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> PODXL (PCX) 正向引物

<400> 1

gagcagtcaa agccaccttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> PODXL (PCX) 反向引物

<400> 2

tggtccccta gcttcatgtc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CDH1 正向引物

<400> 3

gaaggtgaca gagcctctgg at 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CDH1 反向引物

<400> 4

gatcggttac cgtgatcaaa atc 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TJP1 正向引物

<400> 5

gggaacaaca tacagtgacg c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TJP1 反向引物

<400> 6

ccccactctg aaaatgagga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CLDN4 正向引物

<400> 7

ccccgagaga gagtgccctg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CLDN4 反向引物

<400> 8

agcgtccacg ggagttgagg a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> OCLN 正向引物

<400> 9

ctctctcagc cagcctactc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> OCLN 反向引物

<400> 10

gttccatagc ctctgtccca 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WNT7A 正向引物

<400> 11

tgcccggact ctcatgaac 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WNT7A 反向引物

<400> 12

gtgtggtcca gcacgtcttg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LEFTY2 正向引物

<400> 13

ctggacctca gggactatgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LEFTY2 反向引物

<400> 14

tcaatgtaca tctcctggcg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LIF 正向引物

<400> 15

tgccaatgcc ctctttattc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> LIF 反向引物

<400> 16

gttgacagcc cagcttcttc 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CSF1 正向引物

<400> 17

tagccacatg attgggagtg ga 22

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CSF1 反向引物

<400> 18

ctcaaatgta atttggcacg aggtc 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> ERBB4 正向引物

<400> 19

gatgatcgta tgaagcttcc ca 22

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> ERBB4 反向引物

<400> 20

cggtatacaa actggttcct attc 24

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FGF2 正向引物

<400> 21

cggatggggg tagtgagca 19

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FGF2 反向引物

<400> 22

atcttgaggt ggaagggtct 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TGFB1 正向引物

<400> 23

caacaattcc tggcgatacc t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TGFB1 反向引物

<400> 24

gctaaggcga aagccctcaa t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> MMP14 正向引物

<400> 25

gcagaagttt tacggcttgc a 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> MMP14 反向引物

<400> 26

tcgaacattg gccttgatct c 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> YWHAZ 正向引物

<400> 27

ccgccaggac aaaccagtat 20

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> YWHAZ 反向引物

<400> 28

acttttggta cattgtggct tcaa 24

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 18S 正向引物

<400> 29

cggctaccac atccaaggaa 20

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 18S 反向引物

<400> 30

gctggaatta ccgcggct 18

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-199a-5p

<400> 31

cccaguguuc agacuaccug uuc 23

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-152-3p

<400> 32

ucagugcaug acagaacuug g 21

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-145-5p

<400> 33

guccaguuuu cccaggaauc ccu 23

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-219a-5p

<400> 34

ugauugucca aacgcaauuc u 21

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-34a-5p

<400> 35

uggcaguguc uuagcugguu gu 22

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-mir-181a-5p

<400> 36

aacauucaac gcugucggug agu 23

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-144-3p

<400> 37

uacaguauag augauguacu 20

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-802

<400> 38

caguaacaaa gauucauccu ugu 23

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-125b-5p

<400> 39

ucccugagac ccuaacuugu ga 22

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-143-3p

<400> 40

ugagaugaag cacuguagcu c 21

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-202-5p

<400> 41

uuccuaugca uauacuucuu ug 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-506-3p (124-3p.2)

<400> 42

uaaggcaccc uucugaguag a 21

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-16-5p (15-5p)

<400> 43

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hsa-miR-361-5p (对照)

<400> 44

uuaucagaau cuccaggggu ac 22