褪黑素在防治黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用及协同褪黑素增强其防治效果的方法

摘要

本发明属于植物保护领域，涉及防治黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，特别是指褪黑素在防治黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用及协同褪黑素增强其防治效果的方法。实施步骤为：在植物幼苗，根部浇灌或叶面喷施褪黑素溶液，每天一次，共处理3天。本申请还公开了一种协同褪黑素增强对黄瓜绿斑驳花叶病毒防治效果的方法，通过沉默基因NbCRISP1实现显著增强褪黑素对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防治作用。本申请以无毒大分子褪黑素和CGMMV之间的关系为研究对象，明确了褪黑素在防治CGMMV中的作用，拓展了褪黑素在防治植物病害中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，涉及防治黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，特别是指褪黑素在防治黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用及协同褪黑素增强其防治效果的方法。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是我国一种重要的进境和对内的检疫性病毒，侵染葫芦科作物造成严重危害。CGMMV侵染后，植株叶片表现为黄斑、花叶、褪绿、泡状等症状，有的可能产生绿色瘤状突起，使叶片表面凹凸不平；内部果肉往往出现变色、纤维化及腐烂。2006年传入我国辽宁地区，近年来呈现由局部地区向全国扩张，由最初的寄主植物向其他寄主植物扩散的趋势。鉴于CGMMV是一种重要的检疫性病毒，所以对于国内局部地区已经发生的CGMMV的防控至关重要，目前CGMMV主要的防控措施包括加强检疫、轮作和加强田间管理等措施。尚未见特效的针对CGMMV的生物或者化学药物。

褪黑素（Melatonin）是一种无毒大分子，1958年在牛的松果腺中发现。在动物中，褪黑激素作为一种时间生物学激素具有特别重要的作用，在调节睡眠、体温、警觉状态、注意力以及皮质醇分泌方面起着重要作用。直到1995年，褪黑素才在植物中发现。最近，褪黑素也被认为是一种新的植物激素。因为植物来源褪黑素和动物来源的褪黑素在很多方面都非常相似。植物褪黑素在种子萌发、生长、生根、结果、单性结实、成熟和果实储存等方面都有重要的作用。它也参与了植物代谢、光合作用、衰老、二氧化碳摄入以及氮、磷、硫循环等关键过植物生理过程。同时，褪黑素是一种很好的自由基清除剂，其抗氧化效果甚至比一些典型的氧化剂更好，例如坏血酸、维生素E等等。针对此功能，褪黑素在植物的生物胁迫和非生物胁迫方面承担中一种保护和缓解压力的作用。

在植物与细菌的相互作用中，褪黑素对植物病原菌具有有效的抑制作用。在植物-真菌相互作用模型中，褪黑素的外源喷施也起着积极的抗真菌病作用。褪黑素的抗病毒活性在动物病毒中已经得到证实。目前为止，关于褪黑素在植物抗病毒方面的研究鲜见报道。仅有两项研究显示褪黑素在植物抗病毒病害中的作用。当外源施加褪黑素浓度为100 μM时，可以通过增加水杨酸浓度来有效的抑制烟草和番茄上烟草花叶病毒（tobacco mosaicvirus，TMV）的RNA以及病毒浓度。外源施加15 μM褪黑素可以有效清除苹果茎沟病毒（applestem grooving virus，ASGV），使苹果种苗脱毒率达到95%。专利2020109862930公开了利用褪黑素降低雪茄烟发酵过程中烟草特有亚硝胺含量中的应用；关于褪黑素防治植物病害的相关研究越来越多，但是在目的不同、作物不同时，对褪黑素的施用方式和浓度存在明显的差异，且针对褪黑素防治黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法还未有人探索。另外如何增效褪黑素防治黄瓜绿斑驳花叶病毒的效果，以及通过哪种方式增效该防治效果，也是本课题要解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种褪黑素在防治黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）中的应用及协同褪黑素增强其防治效果的方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

褪黑素在防治黄瓜绿斑驳花叶病毒中的应用。

上述应用的实施步骤为：在植物幼苗，根部浇灌或叶面喷施褪黑素溶液，每天一次，共处理3天。

进一步的，所述植物为葫芦科作物（黄瓜、西瓜、南瓜、瓠瓜）和烟草中的任一种。

进一步的，所述植物幼苗为3-4叶期幼苗。

进一步的，所述褪黑素溶液的浓度为50-400 µM。

一种协同褪黑素增强对黄瓜绿斑驳花叶病毒防治效果的方法，步骤为：

（1）根据CRISP1（富半胱氨酸分泌蛋白1）基因的序列选择特异性片段设计VIGS引物对；

（2）以本氏烟的cDNA为扩增模板，以步骤（1）的VIGS引物对为引物扩增目的片段；

（3）将步骤（2）的目的片段与表达载体连接，构建CRISP1基因的中间载体；

（4）将步骤（3）的中间载体与TRV2质粒相连得TRV2-CRISP1载体；

（5）将步骤（4）的TRV2-CRISP1载体与TRV1共注射到待防治植株上，10天后根部浇灌或叶面喷施褪黑素溶液，每天一次，共处理3天。

进一步的，所述步骤（1）中CRISP1基因的序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述步骤（1）VIGS引物对的正向引物序列如SEQ ID No.2所示、反向引物序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述步骤（5）中褪黑素溶液的浓度为50-400 µM。

进一步的，所述步骤（5）中待防治植株为葫芦科作物（黄瓜、西瓜、南瓜、瓠瓜等等）和烟草中的任一种。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请利用褪黑素实现了对作物黄瓜绿斑驳花叶病毒病的高效防治，研究发现在50 µM褪黑素浓度下褪黑素对CGMMV的防治效果最好；由说明书附图1可知经褪黑素处理后，在50 µM浓度的褪黑素在叶片喷施和根部浇灌方式下都可在一定程度上降低CGMMV CP的转录水平，抑制了CGMMV侵染。由说明书附图2可知针对感染CGMMV病毒的植物浇灌褪黑素，其治疗效果可以达到40%左右。

2、本申请还提供了一种协同褪黑素防治CGMMV病的方法，即通过沉默CRISP1基因，其防治效果由图5 C和D可知在蛋白水平上增加了29倍，而在RNA水平上增加了2.7倍。

3、本申请以无毒大分子褪黑素和CGMMV之间的关系为研究对象，明确了褪黑素在有效的预防和治疗CGMMV侵染寄主植物本氏烟（图3）和黄瓜（图4），拓展了褪黑素在防治植物病害中的应用。由图5所示发现了一个新的基因NbCRISP1，其沉默后可以有效增强褪黑素对CGMMV的防治作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为利用RT-qPCR在两种不同施用方式下不同浓度的褪黑素对CGMMV的防治效果，其中A为使用叶片喷施的方式施用褪黑素；B为使用根部浇灌的方式施用褪黑素。

图2为利用两种不同施用方式，施用50 µM褪黑素对CGMMV防治效果对比，其中A为褪黑素施用后对植物状态及发病叶片的展示图；B为利用RT-qPCR检测叶片中CGMMV的积累量；C为利用western blotting检测叶片中CGMMV的积累量。

图3为褪黑素对本氏烟上CGMMV的预防和治疗效果，其中A为褪黑素预防和治疗的方式施用后对植物系统叶发病症状的展示图；B为利用RT-qPCR检测叶片中CGMMV的积累量；C为利用western blotting检测叶片中CGMMV的积累量。

图4为褪黑素对黄瓜上CGMMV的预防和治疗效果，其中A为褪黑素预防和治疗的方式施用后对植物系统叶发病症状的展示图；B为利用RT-qPCR检测叶片中CGMMV的积累量；C为利用western blotting检测叶片中CGMMV的积累量。

图5为沉默NbCRISP1后增强褪黑素对CGMMV的防治作用，其中A为VIGS CRISP1后施用褪黑素接种CGMMV8 dpi植物系统叶发病症状的展示图；为VIGS CRISP1沉默效率检测；C为利用RT-qPCR检测叶片中CGMMV的积累量；D为利用western blotting检测叶片中CGMMV的积累量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：防治黄瓜绿斑驳花叶病毒的最佳的褪黑素施用浓度

一、本氏烟和黄瓜的培养

将本氏烟和黄瓜种子在黑暗中于25℃萌发7天，选择大小均一的幼苗转移到塑料盆（直径8厘米，高10厘米）中，盆中盛有含有蛭石和珍珠盐的土壤混合物，在22°C下，16 h/8h，光照/黑暗循环的生长室中种植。

二、摩擦接种CGMMV

（1）在健康的4-5叶期本氏烟上浸润CGMMV农杆菌。

（2）待本氏烟发病后，采取病叶组织置于研钵中，撒上适量金刚砂后研磨。

（3）叶片组织被研磨后加适量无菌水，静置沉淀5 min，吸取上清即可。

三、褪黑素在本氏烟上的施用浓度

在本氏烟幼苗3-4叶期时，选用叶片喷施和根部浇灌的两种方式，每株施用30 mL不同浓度的褪黑素溶液，分别为50 µM、100 µM、200 µM和400 µM，每天施用一次，共施用3天，第4天接种CGMMV毒汁，每株本氏烟接种两片系统叶（同一叶位），每片100 µL。

接种CGMMV 10天后，观察叶片病毒发病症状，并进行RT-qPCR，结果显示综合两种方法，在50 µM褪黑素浓度下褪黑素对CGMMV的防治效果最好。

四、RT-qPCR检测CGMMV积累量

（1）将提取后的RNA反转录为cDNA，操作参照Takara Prime Script

第一步：

按照上述体系加入到EP管中，混合均匀，42℃ 10 min，冰上5 min；

第二步：

按照上述体系加入到EP管中，混合均匀。在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：

反转录产物可放于-20℃长期保存。

（2）参照SYBR Green Realtime PCR Master Mix说明书进行操作：

检测引物序列为：正向检测引物序列（5’-3’）为：ACAAGGTACCGCTTTCCAGA，反向检测引物序列（5’-3’）为：TACGACAGACGAGGGTAACG。

将上述试剂依次加入RNase-free EP管中，混匀后，分装到384孔定量板上，在实时荧光定量PCR仪中进行反应：预变性 95℃ 3 min；94℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 15 s，进行40个循环。

所得到的结果显示经褪黑素处理后，由图1A可知叶片喷施的方式显示仅有50 µM褪黑素处理可以有效抑制CGMMV侵染。由图1B可知、50 µM、200 µM浓度的褪黑素都可显著降低CGMMV CP的转录水平，抑制了CGMMV侵染。两种施用方式下400 µM浓度的褪黑素对CGMMV表达没有抑制作用（用Student，s t检验确定统计学显著性，*，P＜0.05，**，P＜0.01）。综合两种施用方式结果显示50 µM的褪黑素对于CGMMV的防治效果最佳。

实施例2：褪黑素的不同实施方法对防治黄瓜绿斑驳花叶病毒的影响

一、根部浇灌褪黑素对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防治效果

在本氏烟幼苗3-4叶期时，根部浇灌30 mL不同浓度的褪黑素溶液，浓度为50 µM，每天浇一次，共浇3天，第4天接种CGMMV毒汁，每株本氏烟接种两片系统叶（同一叶位），每片100 µL；对照为根部浇灌ddH

二、叶片喷施褪黑素对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防治效果

在本氏烟幼苗3-4叶期时，叶片喷施30 mL不同浓度的褪黑素溶液，浓度为50 µM，每天喷一次，共喷3天，第4天接种CGMMV毒汁，每株本氏烟接种两片系统叶（同一叶位），每片100 µL；对照为根部浇灌ddH

三、RT-qPCR比较两种施用方式对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防治效果

对接种CGMMV 10天后的植株叶片进行取样，每组处理为8组。对本氏烟叶片进行RNA提取和反转录，然后进行RT-qPCR检测CGMMV CP的转录水平变化。如图2所示，与叶片喷施褪黑素的方式相比较根部浇灌褪黑素的方式可以稳定的防治黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

实施例3：褪黑素在本氏烟和黄瓜上对黄瓜绿斑驳花叶病毒的预防和治疗效果。

一、褪黑素在本氏烟上对黄瓜绿斑驳花叶病毒的预防作用

在本氏烟幼苗3-4叶期时，选用根部浇灌的施用方式，每株施用30 mL褪黑素。褪黑素浓度为50 µM，每天施用一次，共施用3天，第4天接种CGMMV毒汁，每株本氏烟接种两片系统叶（同一叶位），每片100 µL。CGMMV侵染后10天后，观察植株病毒侵染后症状，取样后用RT-qPCR和western blotting等方法检测CGMMV CP积累量，从而比较CGMMV在褪黑素预防作用下的积累量变化。如图3所示，由图3A可知接种CGMMV前施用褪黑素可以有效抑制叶片的卷曲。由图3B和C可知对图3A中的叶片进行了RT-qPCR和western blotting检测，结果发现在CGMMV接种前浇灌褪黑素确实可以从蛋白及RNA水平上抑制CGMMV的积累，可以有效预防CGMMV的侵染，其防治效果可以达到30%左右。

二、褪黑素在本氏烟上对黄瓜绿斑驳花叶病毒的治疗作用

在本氏烟幼苗3-4叶期时，选用根部浇灌的两种方式，每株施用30 mL褪黑素。在CGMMV毒汁接种后1天，根部浇灌褪黑素浓度为50 µM，每天施用一次，共施用3天。CGMMV侵染后10天后，观察植株病毒侵染后症状，取样后用RT-qPCR和western blotting等方法检测CGMMV CP积累量，从而比较CGMMV在褪黑素预防作用下的积累量变化。如图3所示，由图3A可知接种CGMMV前施用褪黑素可以有效抑制叶片的卷曲。由图3B和C可知对图3A中的叶片进行了RT-qPCR和western blotting检测，结果发现根部喷施褪黑素确实可以从蛋白及RNA水平上抑制CGMMV的积累。在CGMMV接种后浇灌褪黑素可以有效治疗CGMMV的侵染，其治疗效果可以达到40%左右。

三、褪黑素在黄瓜上对黄瓜绿斑驳花叶病毒的预防作用

在黄瓜幼苗子叶期时，选用根部浇灌的施用方式，每株施用30 mL褪黑素。褪黑素浓度为50 µM，每天施用一次，共施用3天，第4天接种CGMMV毒汁，每株黄瓜接种两片子叶，每片100 µL。CGMMV侵染后10天后，观察植株病毒侵染后症状，取样后用RT-qPCR和westernblotting等方法检测CGMMV CP积累量，从而比较CGMMV在褪黑素预防作用下的积累量变化。如图4所示，由图4A上图可知接种CGMMV前施用褪黑素可以有效抑制叶片的卷曲。由图4B左和C上可知对图4A上图中的叶片进行了RT-qPCR和western blotting检测，结果发现在CGMMV接种前浇灌褪黑素确实可以从蛋白及RNA水平上抑制CGMMV的积累，可以有效预防CGMMV的侵染，其防治效果可以达到85%左右。

四、褪黑素在黄瓜上对黄瓜绿斑驳花叶病毒的治疗作用

在黄瓜子叶期时，选用根部浇灌的两种方式，每株施用30 mL褪黑素。在CGMMV毒汁接种后1天，根部浇灌褪黑素浓度为50 µM，每天施用一次，共施用3天。CGMMV侵染后10天后，观察植株病毒侵染后症状，取样后用RT-qPCR和western blotting等方法检测CGMMV CP积累量，从而比较CGMMV在褪黑素预防作用下的积累量变化。如图4所示，由图4A下图可知接种CGMMV前施用褪黑素可以有效抑制叶片的卷曲。由图4B右图和C下图可知对图4A下图中的叶片进行了RT-qPCR和western blotting检测，结果发现根部喷施褪黑素确实可以从蛋白及RNA水平上抑制CGMMV的积累。在CGMMV接种后浇灌褪黑素可以有效治疗CGMMV的侵染，其治疗效果可以达到60%左右。

实施例4：基因NbCRISP1的抑制可以增强褪黑素对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防治作用。

一、利用病毒介导的基因沉默技术将新基因CRISP1进行沉默

CRISP1基因的系统沉默是利用TRV侵染性克隆介导的VIGS技术进行的。以本氏烟的cDNA为扩增模版，利用SGN VIGS Tool(http://vigs.solgenomics.net)在基因上预测一段200 bp的片段进行TRV介导的VIGS，并设计引物，通过PCR扩增出目的片段：

CRISP1基因序列如SEQ ID No.1所示：

TACAAACAAGCTGTAAAAGCATTTGTAATAAGTCATAAAATTGATCTCCATAAATTCTCACCAAAGCAAATATTCCTGAAACGCTTATATAATAAAGGCAAGAGCCAATTATTCAATGCACTTTCCCTAGAAACAATCTATCTTTCTCTCCATAACCAAAAA

其中单划线为特异性片段，双划线为ORF序列。

引物序列为：

VIGS正向引物序列如SEQ ID No.2所示（5’-3’）：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGTTACCATTAACGTGG；

VIGS反向引物序列如SEQ ID No.3所示（5’-3’）：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAATACTTTTGTTCATCAGCCCAAG

将CRISP1-VIGS片段利用Gateway克隆技术与入门载体pDonr207进行连接，体系如下：

混匀后，25℃ 1 h，将上述连接产物转化入DH5α感受态细胞；37℃培养过夜，挑取单克隆进行菌落PCR并测序。测序后提取质粒进行第二轮LR反应，将连有目的片段的pDonr207与处理过的表达载体进行LR反应，体系如下：

混匀后，25℃ 1 h，将上述连接产物转化入DH5α，得TRV-CRISP1载体；37℃培养过夜，挑取单克隆进行菌落PCR并提取质粒。

将TRV2-CRISP1和TRV1共注射到本氏烟在CRISP1沉默10天后，利用RT-qPCR检测其沉默效率。CRISP1定量引物序列为：正向引物（5’-3’）：GGTGGGCAAATTCAAGAAAA；反向引物（5’-3’）：CACAAAGTTGCCCTTCAACA。如图5A所示，CRISP1沉默后对植株表型不产生影响；如图5B所示TRV介导的CRISP1沉默效率可以达到65%左右。

二、对沉默后NbCRISP1植株施用褪黑素，并检测8天后CGMMV积累

确定Nifu2沉默效率后，对沉默7 dpi的植株连续施用褪黑素3天，并接种CGMMV，接种后8天利用RT-qPCR和western blotting检测病毒积累量。明确CRISP1沉默后褪黑素对CGMMV的防治效果。如图5C和D所示，CRISP1沉默后可以有效增强褪黑素对CGMMV的防治效果，在蛋白水平上增加了29倍，而在RNA水平上增加了2.7倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南农业大学

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<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum L.

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