一种基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板及其应用

摘要

本发明提供了一种基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板及其应用，所述微流控药敏板自下而上设置有底层、中层和顶层；所述中层为上下贯通的筒状结构，所述筒状结构的下底固定于底层；所述中层设置有至少一个检测单元；所述检测单元通过微流控管道连接废液池、加样孔、抗菌药物处理孔、清洗液孔和SERS活性基底孔；所述顶层覆盖在所述中层的筒状结构的上底。本发明所述的微流控药敏板检测成本低，检测效率高，结果准确，灵敏度高，容易操作，并且可以实现样本的高通量检测，具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于微生物药敏检测技术领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板及其应用。

背景技术

自1928年英国科学家亚历山大·弗莱明发现青霉素以来，抗菌药物便成为临床治疗感染性疾病的一线治疗手段。然而，随着广谱抗菌药物的广泛应用，临床上出现了越来越严重的抗菌药物耐药问题。2019年，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌、三代头孢菌素耐药大肠埃希菌、喹诺酮类耐药大肠埃希菌的耐药检出率均超过50％，细菌耐药问题的严峻程度可见一斑。而侵袭性真菌耐药问题同样不容忽视。随着抗菌药物耐药性的不断增强，临床上不断爆出一些毒性强、对绝大多数高效抗菌药物均耐药的“超级细菌”、“超级真菌”。2019年，“超级真菌”耳念珠菌爆发流行，一旦感染这种真菌，致死率超过60％，近50％的感染者会在90天内死亡。耐药菌株的不断蔓延给人类健康带来了巨大挑战。

导致抗菌药物耐药的重要原因之一是抗菌药物的不合理应用。临床上主要表现为仅凭习惯和临床经验选用抗菌药物、超剂量超范围使用广谱抗菌药物、错误使用无效或疗效差的抗菌药物等。因此，为有效遏制抗菌药物耐药性的蔓延，最重要的措施是实现感染性疾病的早期精准诊断与治疗，即在病原微生物种属鉴定的基础上，根据抗菌药物敏感性试验(antibiotic susceptibility test，AST)结果选用抗菌药物，实现抗菌药物的合理应用。

目前，国内外广泛认可的真菌药物敏感试验标准化方法主要是美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的纸片扩散法和稀释法(琼脂或肉汤稀释法)。纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映待检菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。纸片扩散法是一种半定量药敏检测法，简便易行，但不能给出直观的MIC值，检测结果受多种因素影响。稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比(lg2)稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最小抑菌浓度(MIC)，一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点(敏感、中介和耐药)的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC。稀释法准确，适用范围广，但操作繁琐，费时费力，不利于临床使用。

目前，VITEK 2、Microscan Panel、BD Phoenix和Sensititre等商用自动化系统被广泛用于临床常规检测，将AST的时间从几天缩短至6～16h左右。但上述常规方法均需要24～48h从患者样本中纯培养分离出病原微生物，并需要6～72h完成药敏试验，总耗时长达30h～7d，且对于难培养或生长缓慢的病原微生物的检测更为困难。而临床上对感染性疾病的针对性治疗越早效果就越好，对某些急性感染抢救的黄金窗口期仅为12h。因此，发展快速药敏检测(rapid antibiotic susceptibility test，RAST)技术对临床医疗具有重大意义。

发明专利CN110537087A公开了一种药敏试验试剂盒，其虽然可以产生抗生素梯度，但依赖的检测方法是刃天青显色法，该方法无法在短时间内完成药敏检测，且刃天青不被非发酵革兰氏阴性杆菌代谢，因此该方法无法用于所有病原微生物的药敏检测。发明专利CN110542757A公开了一种利用微流控芯片定量检测细菌及药敏实验的方法。采用抗原抗体技术定量检测细菌，并同步进行药敏检测。但药敏检测结果是基于显色反应，难以在短时间内完成。发明专利CN106238112A公布了一种微流控芯片及其在病原体的鉴定与药敏实验中的应用，但同样是基于显色反应对结果进行判断，用时较长。

因此，如何提供一种可以快速检测微生物药物敏感性的产品及方法，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板及其应用，其可以在一个药敏板上实现系列浓度药物的检测，配合全自动拉曼光谱药敏检测系统使用，实现了药敏检测的自动化，大大降低了工作量，缩短了检测时间。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板，所述微流控药敏板自下而上设置有底层、中层和顶层；

所述中层为上下贯通的筒状结构，所述筒状结构的下底固定于底层；

所述中层设置有至少一个检测单元；

所述检测单元通过微流控管道连接废液池、加样孔、抗菌药物处理孔、清洗液孔和SERS活性基底孔；

所述顶层覆盖在所述中层的筒状结构的上底。

本发明中，拉曼光谱技术是基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面的信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。微生物在抗生素作用后，会产生一定的生化反应，如自身组成变化、代谢产物变化、同化速率变化等，通过拉曼光谱技术对这些变化进行检测，从而确定抗生素对微生物是否有效。该方法的突出优势是可以实现即时检测。

本发明中，使用所述的微流控药敏板对微生物的药物敏感性进行检测，仅需极微量的样本即可对多个梯度浓度药物进行同时检测，降低了筛选成本，提高了检测效率，并且可以实现自动化检测。检测过程容易操作，步骤简单，用时较短，并且可以实现定量检测，具有实际应用的价值。

本发明中，所述底层为拉曼光谱检测提供低背景干扰的基底。

优选地，所述废液池、加样孔、清洗液孔和SERS活性基底孔的数量为1个。

优选地，所述抗菌药物处理孔的数量为至少2个，例如可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述废液池、清洗液孔和SERS活性基底孔的上方设置排气孔。

优选地，所述废液池与加样孔之间设置阀门。

优选地，所述阀门包括机械阀门或气动阀门。

本发明中，所述阀门可根据需求打开或关闭通道。

优选地，所述抗菌药物处理孔的后方、清洗液孔的出口和SERS活性基底孔的出口设置单向阀。

本发明中，在所述抗菌药物处理孔的后方设置单向阀，当加入菌液时，菌液充满抗菌药物处理孔而不会溢出，避免抗菌药物溶解于菌液中溢出而影响药物浓度；在清洗液孔的出口和SERS活性基底孔的出口设置单向阀，确保液体的单向流动，防止液体倒流可能带来的污染。

优选地，所述清洗液孔和SERS活性基底孔的底部设置具有形变能力的泡罩，用于挤压液体进入通道。

优选地，所述抗菌药物处理孔对应的底层上包被有4-MPBA和抗菌药物。

本发明中，4-MPBA分子中包含的硼酸基团可以与细菌/真菌细胞壁的肽聚糖可逆结合，从而特异性捕获各种细菌/真菌。

优选地，不同的所述抗菌药物处理孔对应的底层上包被的抗菌药物依次为梯度浓度。

优选地，所述清洗液孔对应的泡罩内装有清洗液。

优选地，所述SERS活性基底孔对应的泡罩内装有SERS活性基底。

优选地，所述SERS活性基底包括金胶体、银胶体或金银复合纳米粒子中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述底层的材料包括石英玻璃。

本发明中，底层选用石英玻璃作为制备材料，可以为拉曼光谱检测提供低背景干扰的基底。

优选地，所述顶层的材料包括透明塑料膜聚丙烯。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板的使用方法，所述使用方法包括：

将菌液加入加样孔中，进入抗菌药物处理孔，培养；

使用清洗液进行清洗，再加入SERS活性基底；

检测，判断微生物的药物敏感性。

优选地，所述菌液中含有质量分数为30％～100％的重水，质量分数例如可以是30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述培养的时间为0.5～4h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h或4h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述清洗前还包括打开阀门的步骤。

优选地，所述清洗后还包括排除废液的步骤。

优选地，所述加入SERS活性基底前还包括关闭阀门的步骤。

优选地，所述检测包括使用显微拉曼光谱仪进行检测。

优选地，所述判断的标准为氘峰的有无及大小。

作为优选技术方案，本发明所述的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板的使用方法，包括以下步骤：

(1)利用进样针将含有30％～100％重水配制的培养基的菌液加入加样孔中，经过微流控管道进入含有梯度浓度的抗菌药物处理孔中，培养0.5～4h；

(2)打开阀门，通过挤压将清洗液孔中预封的清洗液挤出，清洗抗菌药物处理孔，废液排入废液池中；关闭阀门，将SERS活性基底孔中的SERS活性基底挤入抗菌药物处理孔中；

(3)使用显微拉曼光谱仪进行检测，根据氘峰的有无及大小，判断微生物的药物敏感性。

第三方面，本发明提供了第一方面所述的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板和/或第二方面所述的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板的使用方法在微生物药物敏感性检测中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述微流控药敏板使用微升级体积即可进行药敏测定，大大减少了试剂消耗量，减低药物筛选成本；所需菌量少，可以直接用于临床样本中病原微生物的富集检测；将梯度药物配制、菌液分配、培养、药物效果检测等多个步骤集成到一块药敏板中，实现了药敏活性测定的自动化；该微流控药敏板可以集成多个微阵列，实现多种病原微生物及多种抗菌药物的测定，实现了药物筛选的高通量化，且可以进行定量检测，结果准确、反应灵敏，具有直接适用于临床样本检测、操作简便、耗时短等突出优势；

(2)本发明所述基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板采用封闭的微流体设计，将含有细菌或真菌悬浮液的样品装入微流控芯片，所有进一步的样品处理都以自动方式进行，而不需要与样品进行任何个人接触，从而节省了动手时间，且避免了操作人员与感染样本的进一步接触，检测过程更为安全；

(3)本发明不但可以用于纯培养细菌或真菌的药敏检测，还可以直接用于临床样本中富集到的细菌或真菌的药敏检测，样本类型包括但不限于血液、尿液、肺泡灌洗液、脑脊液、关节腔积液等。临床样本在滤膜过滤前进行选择性裂解，在滤膜上保留的病原微生物经反向洗脱得到富集，即可用于后续的药敏试验。

附图说明

图1为本发明实施例1中的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板的结构示意图；

图中，1-废液池，2-加样孔，3-抗菌药物处理孔，4-清洗液孔，5-SERS活性基底孔，6-阀门，7-单向阀。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一系列基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板，其结构示意图如图1所示。

所述基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板自下而上设置有底层、中层和顶层；

所述中层为上下贯通的筒状结构，所述筒状结构的下底固定于底层；

所述中层设置有1个检测单元；

所述检测单元通过微流控管道连接废液池1、加样孔2、抗菌药物处理孔3、清洗液孔4和SERS活性基底孔5；

所述顶层覆盖在所述中层的筒状结构的上底；

所述废液池1、加样孔2、清洗液孔4和SERS活性基底孔5的数量为1个，所述抗菌药物处理孔3的数量为8个；

所述废液池1、清洗液孔4和SERS活性基底孔5的上方设置排气孔；

所述废液池1与加样孔2之间设置阀门6，所述阀门6为机械阀门；

所述抗菌药物处理孔3的后方、清洗液孔4的出口和SERS活性基底孔5的出口设置单向阀7；

所述清洗液孔4和SERS活性基底孔5的底部设置具有形变能力的泡罩；

所述抗菌药物处理孔3对应的底层上包被有4-MPBA(Sigma)和抗菌药物氟康唑、氟胞嘧啶、两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑、艾沙康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、伏立康唑、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、红霉素、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素或万古霉素(上述药物均购自Sigma)中的任意一种；

不同的所述抗菌药物处理孔3对应的底层上包被的抗菌药物浓度分别如表1和表2所示。

表1

表2

所述清洗液孔4对应的泡罩内装有清洗液，所述清洗液为PBS缓冲液和Tris缓冲液(购自HyClone)；

所述SERS活性基底孔5对应的泡罩内装有SERS活性基底；

所述SERS活性基底为金胶体、银胶体或金银复合纳米粒子，制备方法如下：

金胶体：将50mg的HAuCl

银胶体：取500mL 1.0×10

金银复合纳米粒子：将50mL制备的金胶体用柠檬酸钠稀释至200mL，加热至沸腾。将1.0×10

实施例2

本实施例使用实施例1中制备的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板，对质控菌近平滑念珠菌ATCC22019进行检测，步骤如下：

(1)用100％重水配制的RPMI1640培养基重悬菌体，利用进样针将菌液加入加样孔2中，经过微流控管道进入含有梯度浓度的抗菌药物处理孔3中，培养2h；

(2)打开阀门6，通过挤压将清洗液孔4中预封的清洗液挤出，清洗抗菌药物处理孔3，废液排入废液池1中；关闭阀门6，将SERS活性基底孔5中的SERS活性基底挤入抗菌药物处理孔3中；

(3)使用显微拉曼光谱仪进行检测，根据氘峰的有无及大小，判断微生物的药物敏感性。

检测结果与MIC值质控范围进行对比，结果如表3所示。由此可以看出，采用本申请中的微流控药敏板进行检测，MIC值均在质控的范围内，说明本申请中的药敏检测结果符合药敏检测质控的要求。除此以外，本发明的MIC值在质控范围内偏低，表明相比于常规的检测方法，本申请具有更高的灵敏度，可适用的范围、检测的样本类型更加丰富。

表3

实施例3

本实施例对实施例1制备的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板的检测结果准确度进行检测。

(1)菌种复苏：收集临床分离的敏感和耐药白念珠菌。使用前，取菌液10μL在沙氏固体培养基(SDA)划线，35℃培养箱中培养24h。挑取单克隆，再划线培养1次；

(2)按照CLSI推荐的微量肉汤稀释法测定各菌株对氟康唑的MIC值，同时用本发明所述药敏卡进行MIC值测试。根据CLSI规定的敏感折点，当白念珠菌对氟康唑MIC≤2μg/mL时，判定为敏感菌(S)；当白念珠菌对氟康唑MIC≥8μg/mL时，判定为耐药菌(R)。

结果如表4所示。可以看出本发明中的微流控药敏板检测的各白念珠菌菌株对氟康唑的MIC值与标准微量肉汤稀释法的检测结果均一致，说明本发明所述的微流控药敏板具有非常高的准确度。此外，本申请中的微流控药敏板还具有操作简单、检测用时较短的优点，实现了对样本的快速、准确检测。

表4

表4中，S表示敏感，R代表耐药。

实施例4

本实施例使用实施例1中制备的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板，对白念珠菌感染尿液样本进行检测，步骤如下：

(1)尿液经0.22μm滤膜过滤，以PBS缓冲液对滤膜上保留的病原微生物进行反向洗脱，3000g离心5min，得到菌体沉淀；

(2)用100％重水配制的RPMI1640培养基重悬菌体沉淀，利用进样针将菌液加入加样孔2中，经过微流控管道进入含有梯度浓度的抗菌药物处理孔3中，培养2h；

(3)打开阀门6，通过挤压将清洗液孔4中预封的清洗液挤出，清洗抗菌药物处理孔3，废液排入废液池1中；关闭阀门6，将SERS活性基底孔5中的SERS活性基底挤入抗菌药物处理孔3中；

(4)使用显微拉曼光谱仪进行检测，根据氘峰的有无及大小，判断微生物的药物敏感性，并与微量肉汤稀释法测定的MIC值进行对比，结果如表5所示。

结果显示，使用本发明提供的基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板对样本进行检测，检测的结果与微量肉汤稀释法的检测结果一致，表明使用本申请中的微流控药敏板进行检测的结果与传统的微量肉汤稀释法的检测结果具有相近的检测精度及准确性，但操作更为简便，用时更短，促进了相关产品的推广与使用。

表5

综上所述，本发明所述基于拉曼光谱快速检测微生物药物敏感性的微流控药敏板仅需极微量的样本即可进行药物敏感性检测，减少了实际的用量，且降低了药物筛选的成本；检测结果准确，平行性好，可进行定量检测，且容易操作，检测效率高，可应用于临床样本的高通量检测中，具有重要的应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。