一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法，包括以下步骤：样品中加入灰色链霉菌蛋白酶溶液酶解提取天冬氨酸和谷氨酸，通过AQC衍生；样品中加入盐酸水解提取天冬氨酸和谷氨酸，通过AQC衍生；标准溶液的配制：采用液相色谱‑质谱测定。采用酸水解和创新酶解技术联合，建立了UPLC‑MS/MS婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品中天冬氨酸与谷氨酸的间接测定方法，为乳粉中天冬氨酸与谷氨酸的准确测定提供技术参考。

说明书

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法。

背景技术

婴幼儿配方乳粉与调制乳粉是我国最主要的乳制品。婴幼儿配方乳粉与调制乳粉中的乳蛋白包含相应人群人体生长发育所需要的全部必需氨基酸，是一种高效吸收的全价蛋白质。蛋白质是评价乳粉营养价值和质量的标志性营养成分，而蛋白质基本组成单位氨基酸组分，所以氨基酸含量的分析检测可以间接评价婴幼儿配方乳粉与调制乳粉的质量。天冬氨酸与谷氨酸是构成蛋白氨基酸的重要氨基酸，但是并没有相应的国准检测方法。

国内食品中氨基酸的检测标准仅有GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》，该标准采用酸水解测定了食品中16种氨基酸的含量。由于GB 5009.124-2016前处理采用酸水解，天冬酰胺和谷氨酰胺在水解过程中完全转化为天冬氨酸和谷氨酸，导致不能准确测定天冬氨酸与谷氨酸的含量。目前，国内外报道的氨基酸检测多采用酸水解的方法，对于婴幼儿配方乳粉与调制乳粉中天冬氨酸与谷氨酸的准确测定鲜有报道。

目前，氨基酸检测技术主要有氨基酸分析仪、高效液相色谱仪、液相色谱-串联质谱仪等。其中，氨基酸分析仪用途专一、灵活性差且分析时间长。液相色谱分析法虽然普适性广，但对色谱分离条件要求较高，婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品基质复杂，含有大量的维生素等营养成分，可能会干扰目标物化合物的测定。液相色谱-串联质谱法可以实现不同质荷比共洗脱化合物的准确定性与定量，可以有效减少色谱运行时间，具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，更适合于复杂基质中目标化合物的分析检测。由于氨基酸类化合物极性强、分子量小，复杂基质中特征离子受基体干扰严重，不适合质谱检测器直接检测。化学衍生化法可改变目标物的色谱与质谱特性，改善色谱分离效果、提升质谱信号强度。常用衍生化试剂有异硫氰酸苯酯(PITC)、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、邻苯二甲醛(OPA)、9-芴脂(FMOC)、OPA-FMOC联用、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)、茚三酮等。AQC与伯胺或仲胺反应均生成稳定的衍生物脲，操作简单，衍生速度快，过量的试剂能自然水解，不需要特殊的处理或提取；且不受样品基质干扰，与其他衍生试剂相比更适用于婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品等复杂基质中氨基酸的分析。

发明内容

本研究采用AQC柱前衍生，鉴于天冬氨酸与谷氨酸检不准的问题和婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品基质复杂的特性，采用酸水解和创新酶解技术联合，建立了UPLC-MS/MS婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品中天冬氨酸与谷氨酸的间接测定方法，为乳粉中天冬氨酸与谷氨酸的准确测定提供技术参考。

本发明的目的在于提供一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法。该方法能够准确测定了天冬酰胺与谷氨酰胺的含量。由酸水解结合酶水解，采用差减法实现了天冬氨酸与谷氨酸的准确测定。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种间接测定婴幼儿配方乳粉及调制乳粉中天冬氨酸和谷氨酸的方法，包括以下步骤：

（1）样品中加入灰色链霉菌蛋白酶溶液酶解提取天冬氨酸和谷氨酸，通过AQC衍生；

（2）样品中加入盐酸水解提取天冬氨酸和谷氨酸，通过AQC衍生；

（3）标准溶液的配制：

标准储备液10.0 mmol/L：分别准确称取适量标准品于10 mL容量瓶中，分别用0.1mol/L盐酸定容至刻度；

标准工作溶液：将以上各标准储备液稀释，配成混合标准溶液，使用前逐级稀释至各组分均为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的系列标准工作溶液；

（4）采用液相色谱-质谱测定：天冬氨酸的含量为步骤（2）中的天冬氨酸的浓度减去步骤（1）中测得的天冬氨酸的含量；谷氨酸的含量为步骤（2）中的谷氨酸的浓度减去步骤（1）中测得的谷氨酸的含量。

进一步地，液相色谱的条件为：色谱柱：AccQ-Tag Ultra C18，2.1 mm×100 mm，1.7 µm；流动相：A. 10 mmol/L甲酸铵缓冲溶液、B.乙腈；进样体积1 µL；柱温40℃；检测波长260 nm，梯度洗脱程序见表：

进一步地，质谱条件为：离子源：喷射流电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式（ESI+）；干燥气温度250℃；干燥气流量7 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度350℃；鞘气流量， 12 L/min；毛细管电压4000 V；喷嘴电压0 V；采集模式：多反应监测。

具体地，步骤（1）具体步骤为：

提取：样品混匀后称取0.1g于50 mL螺纹带盖的离心管中，加入0.5 mL10 mg/mL灰色链霉菌蛋白酶溶液、0.1mol/L，pH 8.5的3.0 mL Tris缓冲液、200 μL甲醇，涡旋混匀，超声20 min后，于50℃恒温水浴振荡器中振荡18 h ~ 20 h，然后将样品置于90℃加热15-20分钟；取出样品，冷却至室温，将试样溶液转移至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度；充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用；

衍生：移取10 μL标准工作溶液或上述样品提取液于6 mm×50 mm试管的底部，加入70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液涡旋混合后，加入20 μL AccQ-Fluor衍生剂（6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯），立即涡旋混合，室温下放置1 min，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，置于55℃加热装置上加热10 min，冷却至室温后上机测定。

具体地，步骤（2）具体步骤为：样品混匀后称取0.1g于水解管中，加入10 mL 6mol/L盐酸，充入高纯氮气后封口，将已封口的水解管放入110℃的电热鼓风恒温箱内，水解22 h后，取出，冷却至室温；将水解管内试样溶液全部液体转移到25 mL容量瓶内，用水定容至刻度；充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL 12种氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用；

衍生：移取10 μL标准工作溶液或上述样品提取液于6 mm×50 mm试管的底部，加入70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液涡旋混合后，加入20 μL AccQ-Fluor衍生剂6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯，立即涡旋混合，室温下放置1 min，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，置于55℃加热装置上加热10 min，冷却至室温后上机测定。

有益效果

本研究鉴于天冬氨酸与谷氨酸检测不准确的难题，且无相关国标检测方法的问题，发展了UPLC-MS/MS间接测定婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品中天冬氨酸与谷氨酸的分析方法。

通过考察酶的浓度、酶水解时间及温度等酶水解条件对天冬酰胺、谷氨酰胺的影响，发展了创新的酶水解技术，准确测定了天冬酰胺与谷氨酰胺的含量。由酸水解结合酶水解，采用差减法实现了天冬氨酸与谷氨酸的准确测定。

针对婴幼儿配方乳粉与调制乳粉中的基质复杂性且无空白基质的特点，采用内标法定量，提高了方法的准确性；采用内标代替目标物评价基质效应，并将基质效应考察应用于色谱条件的选择中，有效降低了共流出物对目标物的干扰，从而降低了基质效应，提高了分析方法的准确性和稳定性。

本研究填补了婴幼儿配方乳粉与调制乳粉中天冬氨酸与谷氨酸的检测标准空白和技术缺失，有效解决了氨基酸检测中天冬氨酸与谷氨酸检不准的技术难题，对婴幼儿配方乳粉与调制乳粉生产质量控制和政府监管具有重要意义。

附图说明

图1不同水解方式对天冬酰胺与谷氨酰胺提取效果的影响；

图2不同酶解条件对天冬酰胺与谷氨酰胺提取的影响；

图3不同灭活方法对天冬酰胺与谷氨酰胺提取的影响；

图4不同色谱柱对4种氨基酸基质效应的影响；

图5氨基酸及其内标标准溶液的MRM色谱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：天冬氨酸（Asp）（纯度≥99.7%）、谷氨酸（Glu）（纯度≥98.0%）、谷氨酰胺（Gln）（纯度≥99.2%），均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；天冬酰胺（Asn）（纯度≥98.7%）上海安谱实验科技股份有限公司；

氨基酸混合标准溶液内标(其中瓜氨酸-D

实验用婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品均为市售。

Waters AccQ-Tag氨基酸测定试剂盒(AccQ-Fluor试剂盒(包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释液2B))；灰色链霉菌蛋白酶（活力≥3.5 U/mg） Sigma-Aldrich公司；盐酸(浓度≥36%,优级纯) 国药集团化学试剂有限公司；Tris 生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈(色谱纯) 美国Fisher公司；甲酸铵(色谱纯) 美国Fisher公司；有机微孔滤膜(0.22 µm) 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent1290 Infinity Ⅱ液相色谱系统和Agilent 6470三重四极杆液质联用系统，配有喷射流电喷雾（Jet ESI）电离源，使用 Agilent Mass Hunter 采集软件（B.08.00版）和 Agilent Mass Hunter 定量分析软件（B.07.00版）进行数据采集和分析 (美国Agilent公司)；AB204-S型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超声波清洗器、中国宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温水浴振荡器、优莱博技术(北京)有限公司；MS3涡旋混合器、德国IKA公司； Milli-Q超纯水制备器、美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液(10.0 mmol/L)：分别准确称取适量(精确至0.1 mg)标准品于10 mL容量瓶中，分别用0.1 mol/L盐酸定容至刻度。

标准工作溶液：将以上各标准储备液稀释，配成混合标准溶液，使用前逐级稀释至各组分均为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L（均含甘氨酸-

1.3.2 AccQ-Fluor衍生剂的制备

吸取2B瓶中1 mL AccQ-Fluor稀释剂放入装有AccQ-Fluor衍生剂粉末的2A瓶中，加盖密封，涡旋10 s，在55℃加热装置上加热2A瓶，直至AccQ-Fluor衍生剂粉末全部溶解，加热时间不超过10 min。密封，室温下保存于干燥器中，有效期一周。

1.3.3 样品前处理

1.3.3.1 谷氨酰胺、天冬酰胺的测定：

提取：样品混匀后称取0.1g(精确到0.0001 g)于50 mL螺纹带盖的离心管中，加入0.5 mL灰色链霉菌蛋白酶溶液（10 mg/mL）、3.0 mL Tris缓冲液（0.1mol/L，pH 8.5）、200 μL甲醇，涡旋混匀，超声20 min后，于50℃恒温水浴振荡器中振荡18 h ~ 20 h，然后将样品置于90℃加热15-20分钟。取出样品，冷却至室温，将试样溶液转移至25 mL容量瓶中，用水定容至刻度。充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用。

衍生：移取10 μL标准工作溶液或上述样品提取液于6 mm×50 mm试管的底部，加入70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液(Buffer 1)涡旋混合后，加入20 μL AccQ-Fluor衍生剂，立即涡旋混合，室温下放置1 min，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，置于55℃加热装置上加热10 min，冷却至室温后上机测定。

1.3.3.2 天冬氨酸总量（含由天冬酰胺转化为天冬氨酸的部分）、谷氨酸总量（含由谷氨酰胺转化为谷氨酸的部分）的测定：

提取：样品混匀后称取0.1g(精确到0.0001 g)于水解管中，加入10 mL 6mol/L盐酸，充入高纯氮气后封口，将已封口的水解管放入110℃的电热鼓风恒温箱内，水解22 h后，取出，冷却至室温。将水解管内试样溶液全部液体转移到25 mL容量瓶内，用水定容至刻度。充分摇匀后，精确量取100 μL至5 mL容量瓶中，加入50 μL氨基酸混合标准溶液内标，然后用超纯水定容至5 mL，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用。

衍生：步骤同1.3.3.1中衍生的操作步骤。

1.3.3.3 天冬氨酸与谷氨酸的测定：

1.3.3.2步骤中测得的天冬氨酸的摩尔浓度减去1.3.3.1测得的天冬酰胺的摩尔浓度即为天冬氨酸的摩尔浓度，得出天冬氨酸的含量；1.3.3.2步骤中测得的谷氨酸的摩尔浓度减去1.3.3.1测得的谷氨酰胺的摩尔浓度即为谷氨酸的摩尔浓度，得出谷氨酸的含量。

1.3.3.4 空白实试验

除不加试样外，其他操作步骤同试样的操作步骤。

1.3.4 分析条件

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱：AccQ-Tag Ultra C18 (2.1 mm×100 mm，1.7 µm)；流动相：A.甲酸铵缓冲溶液(10 mmol/L)、B.乙腈；进样体积1 µL；柱温40℃；检测波长260 nm，梯度洗脱程序见表1：

表1 HPLC梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program

1.3.4.2 质谱条件

离子源：喷射流电喷雾离子源(Jet ESI)；离子化模式：正离子模式（ESI+）；干燥气温度250℃；干燥气流量7 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度350℃；鞘气流量, 12 L/min; 毛细管电压4000 V；喷嘴电压0 V；采集模式：多反应监测(MRM)；质谱参数见表2。

表2. 氨基酸衍生物的质谱参数

Table 2 Optimized parameters of MS/MS for amino acids derivatives

注：

1.4 基质效应评价

通过在纯溶剂与样品中添加同水平同位素内标，测定二者的峰面积响应值，评价基质效应 (Matrix effect）。Matrix effect factor (MEF, %)=(A-B)/A×100，其中MEF为基质效应因子，A为纯溶剂中内标的峰面积响应值，B为样品提取液中内标的峰面积响应值。MEF为0表示无基质效应，绝对值越大基质效应越强，在-15%~15%之间，表示基质效应影响不明显。

1.5 数据处理

通过与仪器配套的Agilent Mass Hunter采集软件和Agilent Mass Hunter定量分析软件完成数据采集与处理，Origin 8.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 水解方式的选择

水解是氨基酸分析准确性的关键。由于酸水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺被完全水解成天冬氨酸和谷氨酸，导致天冬氨酸和谷氨酸测定数值不准确，因此准确测定天冬氨酸和谷氨酸的前提是首先准确测定天冬酰胺和谷氨酰胺。实验采用更加温和的酶水解模式水解天冬酰胺与谷氨酰胺。

实验考察了酶水解、弱化的酸水解及其组合模式对天冬酰胺、谷氨酰胺提取效果的影响（图1）。具体考察条件如下：

A.样品按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h；

B.样品用0.1 mol/L盐酸溶解后在121℃下水解30 min，调节试样溶液的pH至pH8.5；再按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h；

C.样品用Tris缓冲液（0.1mol/L，pH 8.5）溶解后在121℃下水解30 min；再按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h；

D.样品按照样品前处理1.3.3.1酶解18 h ~ 20 h后，调节试样溶液的pH至pH 1.0在121℃下水解30 min；

实验表明（图1），单独的酶水解模式（A）样品中Asn与Gln的提取效果良好且回收率正常。酶水解和弱化的酸水解组合模式（B、D）的水解方法，Asn与Gln的提取均存在不同程度的降低，回收率的影响趋势基本一致；缓冲溶液水解与酶水解组合（D）时，Gln提取效果与回收率正常，而Asn有一定程度的降低。因此，Asn与Gln水解方式选择单纯的酶水解模式（A）。

由于酶水解方法较温和，Asp与Glu无法水解完全，而前处理1.3.3.2酸水解测定的Asp是Asp与Asn的和、Glu是Glu与Gln的和，所以Asp、Glu的摩尔浓度由酸水解测定的Asp、Glu的摩尔浓度分别减去酶水解测定的Asn、Glu的摩尔浓度得出，从而间接测出Asp与Glu的含量。

2.1.2 酶水解条件的优化

酶种类的选择，实验考察了灰色链霉菌蛋白酶、胰酶、脂肪酶及淀粉酶对实验结果的影响。实验发现，胰酶、脂肪酶、淀粉酶均不能使蛋白质水解出游离的天冬氨酸、谷氨酸及色氨酸。原因可能是链霉蛋白酶是一种非特异蛋白水解酶混合物，能够裂开蛋白质的肽键，有极强的蛋白水解作用，能够将蛋白质消化成单个氨基酸，因此实验采用采用链霉蛋白酶进行酶解。

酶解条件是准确测定天冬氨酸与谷氨酸的关键因素，因此实验分别考察了酶浓度、酶解温度及酶解时间对天冬酰胺、谷氨酰胺提取效果的影响（图2）。

实验考察了酶浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL时，对样品中目标物提取效果的影响（图2）。结果表明，随着酶浓度的增加，目标物含量逐渐增加，当浓度超过10.0 mg/mL时Asn与Gln不再增加。所以实验选择酶的浓度为10.0 mg/mL。

实验比较了不同温度（40、45、50、55、60℃）对Asn和Gln提取效果的影响（图2）。实验表明，目标物的提取效果随着温度的增加逐渐增加，超过50℃后呈明显的下降趋势。本实验酶解温度确定为50℃。

实验考察了样品酶解时间分别为14、16、18、20、22 h时，对2种氨基酸提取效果的影响（图2）。研究发现，随着酶解时间的增加，酶解效率增加，提取效率提高，18 h后趋于平稳，超过20 h后Asn与Gln均有不同程度的下降趋势。所以实验选择酶解时间为18 ~ 20 h。

2.1.3 酶灭活方法的选择

为保证分析方法的稳定性和准确性，实验分别考察了酶解后加入甲醇与90℃加热15-20分钟两种不同灭活方法对目标物提取和回收率的影响（图3）。

研究表明，采用甲醇灭活的方法会导致目标含量和回收率偏低。原因可能是，一方面甲醇的加入在使酶失去活性的同时也沉淀了部分干扰物质，此过程可能也吸附或包裹了部分目标物；另一方面可能是目标物在甲醇和水中溶解度的差异造成的。因此实验选择酶解后将样品置于90℃加热15-20分钟使酶灭活。

2.2 分析条件的优化

2.2.1 色谱条件的选择

2.2.1.1 色谱柱的选择

实验选取Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）、Waters AcquityBEH Shield RP18（2.1×100 mm，1.7 μm）和AccQ-Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）三种色谱柱对峰面积响应值和峰形的影响。实验考察了三种色谱柱对基质效应（图4）的影响。

结果表明，目标物在三种色谱柱上的峰面积响应值无明显差别，Ultra C18与HSST3目标物峰形良好，但在Shield RP18上Asp与Glu拖尾。由图4可知，4种氨基酸在Ultra C18色谱柱上的基质效应明显低于HSS T3和Shield RP18。本实验选择Ultra C18色谱柱。

2.2.1.2 流动相的选择

实验选用乙腈为有机相，采用4种氨基酸的混合标准溶液（10 μmol/L），比较了10mmol/L甲酸铵、10 mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）、10 mmol/L醋酸铵三种不同流动相对目标物的灵敏度及峰形的影响。实验表明，目标物在三种流动相中峰形无明显差异；但在乙腈-10 mmol/L甲酸铵体系中峰面积响应值最高、灵敏度最高，且基质效应最小。因此，实验选取乙腈-10 mmol/L甲酸铵为流动相。

实验考察了不同盐浓度（5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L甲酸铵溶液），对4种氨基酸峰面积响应值和峰形的影响。结果表明，盐浓度对目标化合物的灵敏度无明显差异，但浓度为5 mmol/L时，目标物峰形有拖尾现象。考虑到盐浓度对仪器和色谱柱的影响，所以实验选取甲酸铵溶液浓度为10 mmol/L。

2.2.2 质谱条件的优化

氨基酸衍生物在ESI源下易电离形成正离子。在电喷雾正离子模式下，将500 μmol/L的各个目标化合物的标准溶液衍生后通过一级质谱扫描获得相应的母离子及优化的离子源参数，再优化Fragmentor电压，随后通过子离子扫描选择信号强且稳定的特征碎片离子，确定定性离子及定量离子，并进一步优化碰撞能量等参数，具体见表2。在优化的HPLC-MS/MS条件下，4种氨基酸混合标准溶液（10 μmol/L）及内标（甘氨酸-

AQC与伯胺或仲胺反应均生成的衍生物具有良好的反相色谱和质谱特性。单氨基氨基酸衍生物形成[M+Acq+H]

2.3 基质效应的考察

氨基酸是婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品中一类重要的营养物质，难以获得空白基质，不能采用常规的提取后添加法和柱后注射法来评价基质效应，也无法使用基质校正曲线定量。由于同位素内标与目标物具有相同的化学性质，所以实验采用引入同位素内标代替目标物进行基质效应评价，有效消除了基质效应的影响，提高分析方法的准确性及稳定性，并可实现对每个样本进行基质效应评估。实验表明，本方法基质应均在-15.0%~15.0%之间，基质效应影响较小。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

将1.3.1节步骤配制的标准系列工作液按1.3.3.1节衍生后，按质量浓度由低到高的顺序依次测定，以各目标化合物的摩尔浓度（X，μmol/L）为横坐标，各目标化合物的峰面积与其内标面积之比（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。以RSN≥3得到目标化合物的检出限，以RSN≥10得到目标化合物的定量限（表3）。结果表明，各目标化合物在各自线性范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.9991。

表3 氨基酸的线性回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.4.2 回收率和精密度

选取某婴幼儿配方乳粉为代表进行回收率试验。样品中目标化合物按其含量的50%、100%、150%，分别添加低、中、高3个不同水平浓度的标准溶液进行回收率实验，各个水平平行测定6次(表4)。由表4可知，加标回收率在92.5%～103.4%之间，相对标准偏差在1.79%～3.25%之间。

表4 方法的回收率和精密度

注：ND表示未检出

2.5 实际样品的测定

应用本方法对不同生产厂家的婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品中的天冬氨酸与谷氨酸进行分析（表5）。

表5 婴幼儿配方乳粉与调制乳粉品中天冬氨酸与谷氨酸的含量

结果表明，不同生产厂家或不同配方中天冬氨酸与谷氨酸含量差异均较大，可能是因为用料的差异导致的结果差异。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。