一种西唐氏链霉菌在抑制黑色素合成中的应用

摘要

本发明公开一种西唐氏链霉菌在抑制黑色素合成中的应用，针对现有技术中尚未记载有关西唐氏链霉菌(Streptomycessetonii)在抑制黑色素合成方面应用的技术现状。选用新疆罗布泊地区土壤中分离出的西唐氏链霉菌(Streptomycessetonii)制备液体种子，通过在无菌条件下加入液体培养基，扩大培养，提取代谢产物，对于蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性以及B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性、B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量均有较好的抑制作用，并且对于黑色素瘤细胞的增殖并无显著影响，该菌株具有高效抑制黑色素合成的特性，因此在微生物菌种应用技术领域具有广泛的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物及其应用的技术领域，具体的涉及一种西唐氏链霉菌的应用，更具体的涉及一种西唐氏链霉菌在抑制黑色素合成中的应用的技术领域。

背景技术

人体局部黑色素沉着如痣、雀斑，影响人的美观及身心健康，严重的如黑色素瘤还危及生命。因此，筛选黑色素生物合成抑制剂用作化妆品及药品有着良好的前景。目前，为了从微生物中寻找新的黑色素合成抑制剂，已先后从部分微生物中分离到一些有效物质，但是为数不多。

酪氨酸酶(Tyrosinase)，又称多酚氧化酶，是一种含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物和动植物中。酪氨酸酶是黑色素合成过程的限速酶，在黑色素的生物合成过程中起着极其重要的作用，当酪氨酸酶过量表达时可能会引起人体的黑色素瘤和果蔬褐变等。酪氨酸酶抑制剂可以抑制酪氨酸酶的表达，应用于美容保健、色素型皮肤病治疗、病虫害防治以及食品保鲜等多个领域，但目前发现的一些酪氨酸酶抑制剂如曲酸等均存在一定的安全隐患，所以寻找安全、高效的酪氨酸酶抑制剂受到越来越多人的关注。微生物资源具有数量多、分布广、易于培养等优点，从微生物中寻找特异、高效的酪氨酸酶抑制剂已成为目前研究的热点。

发明内容

针对现有技术中现有的一些黑色素合成抑制剂存在一定的安全隐患，所以寻找安全、高效的酪氨酸酶抑制剂受到越来越多人的关注，而现有技术尚未记载有关西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)属菌株在抑制黑色素合成方面应用的技术现状，且微生物抑制黑色素合成优势日益迫切，本发明旨在为微生物抑制黑色素合成技术提供具有实际效果且发酵性能稳定的菌株，提供的一株西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)属菌株在抑制黑色素合成中的应用。本发明分离筛选出一株西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)放线菌属菌株，该菌株通过多项分类鉴定分析可知是常见的西唐氏链霉菌(Streptomycessetonii)，利用该菌种西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)属菌株具有抑制黑色素合成的特性，对于微生物应用技术领域具有广泛的应用价值。

本发明提供一种利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用。

进一步的，本申请提供的一种利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，选用分离到的一株西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)接种于装有25mL液体培养基的250mL三角瓶中，扩大培养，发酵温度为30℃、180r/min振荡发酵培养3-5天。

更进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)属菌株在抑制黑色素合成中的应用，具体应用步骤如下：

(1)按5％接种量将西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)种子培养液接种到液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养3-5天；

(2)将步骤(1)中制备获得的发酵液6000r/min离心20min，分别收集发酵上清液和菌体沉淀；

(3)将步骤(2)中制备获得的上清液用乙酸乙酯萃取、蒸馏，最后用含5％DMSO的磷酸盐缓冲液溶解，获得上清液样品；

(4)将步骤(2)中制备获得的菌体沉淀先用60％丙酮浸提，然后用超声波破碎仪破碎细胞，功率200W，破碎30S，间歇30S，破碎至菌液透明，破碎液于4℃、6000r/min离心30min；获得的上清液用乙酸乙酯萃取，分别收集乙酸乙酯相和丙酮水相进行蒸馏，最后用含5％DMSO的磷酸盐缓冲液溶解，从而获得菌体乙酸乙酯相样品和菌体丙酮水相样品。

(5)收集步骤(3)中制备获得的上清液用乙酸乙酯萃取，获得上清液乙酸乙酯相样品和步骤(4)中制备获得的菌体乙酸乙酯相样品和菌体丙酮水相样品，用含5％DMSO的磷酸盐缓冲液溶解，得到菌株(Streptomyces setoni)的三个萃取相的提取物。

本申请提供的液体培养基采用酵母浸出粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，酸水解干酪素0.5g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，丙酮酸钠0.3g，K

本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成活性包括抑制蘑菇酪氨酸酶二酚酶的活性。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成活性包括对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制作用。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成活性中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制作用应用时，选用100～1000μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

优选的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成活性中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制作用应用时，选用750μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成包括对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量的抑制作用。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量的抑制作用应用时，选用100-1000μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

优选的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量的抑制作用应用时，选用100μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

通过实施本发明提供上述具体技术方案，实施本发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，菌株代谢产物的提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力有较强的抑制作用，菌株的上清液乙酸乙酯相酶活性抑制率高达72.2％，其次是菌体乙酸乙酯相和菌体丙酮水相部位的酶活性抑制率分别为44.9％和31.4％。

(2)本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，菌株的上清液提取物对B16黑色素瘤细胞增殖活力的抑制效果较弱，当菌株上清液提取物浓度在100～1000μg/mL范围内，细胞培养12～72h后，其对细胞活力均没有显著影响，表明菌株上清液提取物对B16黑色素瘤细胞较安全，没有毒害作用。

(3)本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，菌株代谢产物在作用24、48、72h后对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的总活性均具有显著的抑制作用(P<0.05)。菌株代谢产物的提取物抑制酪氨酸酶活性的强弱可能与它穿透细胞膜的能力或与细胞表面受体的结合能力有关。

(4)本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，菌株代谢产物的提取物对B16细胞内黑色素合成具有显著地抑制作用(P<0.05)，但细胞内黑色素相对含量随浓度呈波动性变化。当菌株代谢产物的提取物浓度为1000μg/mL，细胞培养时间为48h时，细胞内黑色素相对含量为69.6％，即菌株代谢产物的提取物对黑色素生成量的抑制率达30.4％。当菌株代谢产物的提取物浓度为100μg/mL时，黑色素含量下降为57％，且不同浓度处理组之间的差异达到显著性水平(P＜0.05)。

附图说明

图1所示为菌株培养菌落形态图。

图2所示为光镜下菌株的菌丝形态图。

图3所示为全细胞水解液氨基酸层析图谱。

图4所示为菌株基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树。

图5所示为菌株代谢产物的提取物对酪氨酸酶二酚酶活力的影响图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

本发明实施例中采用如下固体培养基：

酵母浸出粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，酸水解干酪素0.5g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，丙酮酸钠0.3g，K

本发明实施例中小鼠黑色素瘤B16细胞购自中科院上海细胞生物研究所。采用如下培养条件培养：

无菌条件下，将B16细胞接种于含10％的胎牛血清的RPMI-1640培养基的培养瓶中(含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)，在二氧化碳培养箱中37℃，5％CO

本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：一种利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用

本发明提供一种利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用。

进一步的，本申请提供的一种利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，选用分离到的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)接种于装有25mL液体培养基的250mL三角瓶中，扩大培养，发酵温度为30℃、180r/min振荡发酵培养3-5天。

更进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)属菌株在抑制黑色素合成中的应用，具体应用步骤如下：

(1)按5％接种量将西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)种子培养液接种到液体发酵培养基中，30℃、180r/min振荡培养3-5天；

(2)将步骤(1)中制备获得的发酵液6000r/min离心20min，分别收集发酵上清液和菌体沉淀；

(3)将步骤(2)中制备获得的上清液用乙酸乙酯萃取、蒸馏，最后用含5％DMSO的磷酸盐缓冲液溶解，获得上清液样品；

(4)将步骤(2)中制备获得菌体沉淀先用60％丙酮浸提，然后用超声波破碎仪破碎细胞，功率200W，破碎30S，间歇30S，破碎至菌液透明，破碎液于4℃、6000r/min离心30min；获得的上清液用乙酸乙酯萃取，分别收集乙酸乙酯相和丙酮水相进行蒸馏，最后用含5％DMSO的磷酸盐缓冲液溶解，从而获得菌体乙酸乙酯相样品和菌体丙酮水相样品。

(5)收集步骤(3)中制备获得的上清液用乙酸乙酯萃取，获得上清液乙酸乙酯相样品和步骤(4)中制备获得的菌体乙酸乙酯相样品和菌体丙酮水相样品，用含5％DMSO的磷酸盐缓冲液溶解，得到菌株(Streptomyces setoni)的三个萃取相的提取物。

本申请提供的液体培养基采用酵母浸出粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，酸水解干酪素0.5g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，丙酮酸钠0.3g，K

本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成活性包括抑制蘑菇酪氨酸酶二酚酶的活性。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成活性包括对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制作用。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制作用应用时，选用100～1000μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

优选的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制作用应用时，选用750μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成包括对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量的抑制作用。

进一步的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量的抑制作用应用时，选用100-1000μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

优选的，本申请提供的利用西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)在抑制黑色素合成中的应用，所述的抑制黑色素合成中对于小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量的抑制作用应用时，选用100μg/mL的西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)菌株代谢产物。

实施例二：菌种鉴定

在新疆罗布泊地区的土壤中分离获得菌株。

(1)16S r RNA基因型分析及其系统发育分析

采用Chelex-100法提取菌株的基因组DNA，扩增16S r DNA并测定序列，将所得到的序列利用Blast软件在GenBank，EMBL及DDBJ等数据库中进行相似性搜索，并与基因库中已知菌株比较，最终确定菌株的初步分类地位。

(2)培养特征及细胞形态观察

参照《放线菌系统学》进行菌株的菌落及细胞形态观察。

(3)生理生化特征测定

依据《放线菌系统学》，检测该菌株的相关生理生化特性。使用API 50CH试剂盒测定菌株产酸酶学特性指标，GENⅢ鉴定板测定碳源利用指标。

(4)全细胞壁氨基酸的提取及分析

全细胞壁氨基酸的提取及分析均参照文献的标准操作进行，用薄层层析扫描法分析氨基酸组成。

(5)测定结果

将菌株接种到8种斜面培养基中(ISP2/ISP3/ISP4/ISP5/PDA/TSA/察氏琼脂/营养琼脂)，分别培养4、7、10、14d后，记录菌株的培养特征。菌株在ISP4培养基上生长良好；在ISP4培养基上气生菌丝较发达呈灰黄色，基内菌丝棕黄色，无可溶性色素产生。在ISP4固体培养基上，在28℃下培养4d，菌落背面呈棕黄色，正面呈白色，圆形，表面有褶皱，最大菌落直径约为2.5mm，参见附图1。光学显微镜下观察结果参见附图2，菌株基内菌丝生长都比较丰富，分支不断裂，气生菌丝生长丰富，有分支，成熟的气生菌丝分化形成孢子丝，孢子丝为直或波曲形，培养4d左右，孢子丝断裂生成柱状孢子。

采用API 50CH试剂条对菌株进行生理生化检测，结果显示该菌七叶灵为阳性。采用GENⅢ鉴定板检测唯一碳源利用特性，结果显示该菌可将葡聚糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露醇、D-阿拉伯醇等作为唯一碳源。菌株能够使淀粉水解，牛奶凝固和胨化，硝酸盐还原反应为弱阳性，明胶液化为阳性。菌株的细胞壁含有alanine，glycine，glutamic acid，含LL-DAP，参见附图3。

菌株的16SrRNA基因特异序列为1411bp(GenBank登录号为OK255534)利用MEGA5.0软件，以NeighborJoining法构建菌株的系统发育树，参见附图4所示。结果表明，菌株和Streptomyces setonii NBRC

实施例三：菌株次级代谢产物的提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的影响

放线菌代谢产物的提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶抑制率的测定参考文献(付建红等，2017年)的方法测定菌株代谢产物的提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率。

放线菌代谢产物的提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性IC

结果表明，菌株的上清液乙酸乙酯相酶活性抑制率最高为72.2％，其次是菌体乙酸乙酯相和菌体丙酮水相部位的酶活性抑制率分别为44.9％和31.4％。

在以L-DOPA为底物的测酶活体系中，加入不同质量浓度的菌株代谢产物的提取物溶液，以不加提取物为对照，测定相对酶活力，结果参见附图5。由附图5可知，菌株代谢产物的提取物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力有较强的抑制作用，IC

实施例四：CCK-8法检测放线菌次级代谢提取物对B16细胞增殖率的影响

取指数生长期的B16黑色素瘤细胞，经消化分散制备1×10

细胞增殖率＝(实验孔OD值－空白孔OD值)/(对照孔OD值－空白孔OD值)×100％。

测定结果如表1所示。

表1：菌株次级代谢产物的提取物对B16细胞增殖率的影响

注：a、b、c表示同一代谢物处理不同浓度之间的差异性，相同字母表示无显著性差异，不同字母表示存在显著性差异(P＜0.05)。

如表1所示，菌株上清液提取物及熊果苷对小鼠B16黑色素瘤细胞生长均没有明显的抑制作用。菌株上清液提取物对B16黑色素瘤细胞活力的抑制效果较弱，当菌株上清液提取物浓度在100～1000μg/mL范围内，细胞培养12～72h后，其对细胞活力均没有显著影响。当菌株上清液提取物浓度为100μg/mL时，细胞存活率较高，随着上清液提取物浓度增大和细胞培养时间延长，其对细胞活力的影响均不显著(P>0.05)，尤其是当上清液提取物浓度为1000μg/mL，细胞培养72h时，细胞活力仍能达到120.18％，表明上清液提取物对细胞没有毒性。而阳性对照熊果苷浓度为31.25～500μg/mL范围内，细胞培养12～72h时，其作用下的B16黑色素瘤细胞存活率较高，与菌株上清液提取物作用下的细胞存活率相比差异不显著(P>0.05)，表明上清液提取物和熊果苷对B16黑色素瘤细胞较安全。

实施例五：菌株代谢产物的提取物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响

细胞培养和药物处理方法同实施例四。药物处理一定时间后，弃去上清液。用pH7.4的PBS洗涤2次，每孔加入1％Triton 50μL，迅速放入-80℃超低温冰箱冻存30min，随后室温融化使细胞完全破裂，酪氨酸酶释放出细胞外，37℃预温5min后加入1％的L-DOPA溶液10μL/孔，37℃反应1h，在酶标仪490nm处测其吸光度。酪氨酸酶活性＝实验组OD/空白对照组OD×100％。

测定结果如表2所示。

表2：菌株代谢产物的提取物对B16细胞内酪氨酸酶活性的影响

注：a、b、c表示同一代谢物处理不同浓度之间的差异性，相同字母表示无显著性差异，不同字母表示存在显著性差异(P＜0.05)。

如表2所示，与空白对照组相比，菌株代谢产物的提取物和熊果苷(阳性对照)在作用24、48、72h后对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的总活性均具有显著的抑制作用(P<0.05)。随着代谢产物的提取物浓度增大和细胞培养时间的延长，细胞内酪氨酸酶相对活性逐渐降低。菌株代谢产物的提取物抑制酪氨酸酶活性的强弱可能与它穿透细胞膜的能力或与细胞表面受体的结合能力有关。当细胞培养48～72h时，750～1000μg/mL菌株代谢产物的提取物对酪氨酸酶活性的抑制效果要比500μg/mL的熊果苷好。熊果苷作用72h时随浓度增大酪氨酸活性逐渐增强(如表2)，即对酶活性的抑制作用降低，其可能的原因是高浓度熊果苷在体外可提高小鼠B16黑色素瘤细胞的增殖率，从而促进其大量分泌酪氨酸酶，最终增强酪氨酸酶活性。菌株代谢产物的提取物和熊果苷两种药物处理与空白对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)，但是两种药物处理组之间无明显差异(P＞0.05)。

实施例六：菌株代谢产物的提取物对B16黑色素瘤细胞内黑色素合成总量的影响

细胞培养和药物处理方法同实施例四。药物处理72h，弃去上清液，用PBS清洗2次，消化并收集细胞于离心管中，1500r/min离心10min，弃去上清液。加入2mL的PBS重新悬浮，然后加入500μL体积比为1:1的乙醇/乙醚混合液，室温下放置30min，3000r/min离心5min，弃去上清液，加入1mL含10％DMSO的1.0mol/LNaOH溶液完全溶解裂解细胞，80℃水浴2h，测定其405nm吸光值。黑色素合成总量＝实验组OD值/对照组OD值×100％。

测定结果如表3所示。

表3：菌株代谢产物的提取物对B16黑色素瘤细胞中黑色素含量的影响

注：a、b、c、d、e表示同一代谢物处理不同浓度之间的差异性，相同字母表示无显著性差异，不同字母表示存在显著性差异(P＜0.05)。

如表3所示，菌株代谢产物的提取物对B16细胞内黑色素合成具有显著地抑制作用(P<0.05)，但细胞内黑色素相对含量随浓度呈波动性变化。当菌株代谢产物的提取物浓度为1000μg/mL，细胞培养时间为48h时，细胞内黑色素相对含量为69.6％，即代谢产物的提取物对黑色素生成量的抑制率达30.4％。当代谢产物的提取物浓度为100μg/mL时，黑色素含量下降为57％，且不同浓度处理组之间的差异达到显著性水平(P＜0.05)。当细胞培养48h时，250～500μg/mL熊果苷对细胞内黑色素合成的抑制效果优于菌株代谢产物的提取物，这与表2中结果有所不同。熊果苷对黑色素瘤细胞内黑色素合成的抑制作用较强，而对细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用较弱，表明熊果苷对黑色素合成的抑制作用主要通过降低酪氨酸酶的催化活性实现的，但它不是唯一决定因素。它也可通过抑制某种激素，通过有关黑色素合成的信号通路下调酪氨酸酶基因的表达，从而抑制酪氨酸酶的含量。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。