一种治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物及其应用

摘要

本发明提供一种治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物，所述的中药组合物由下列重量份的原料药制成：黄芪0‑100份，当归0‑100份，川芎0‑100份，白芍0‑100份，桃仁0‑100份，红花0‑100份，地龙0‑100份，生地0‑100份，肉桂0‑100份，猪苓0‑100份，泽泻0‑100份，茯苓0‑100份，白术0‑100份，黄连0‑100份，黄芩0‑100份，黄柏0‑100份，山栀0‑100份，葶苈子0‑100份，芦根0‑100份，薏米0‑100份。能够有效改善呼吸指数，降低临床死亡率；减轻肺水肿、抑制细胞凋亡和炎症因子释放。

说明书

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物及其应用。

背景技术

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)是一种以非心源性肺水肿、肺泡间质渗透性增加、炎症细胞浸润为病理特征的呼吸系统急重症。ALI/ARDS目前仍以呼吸支持治疗为主，尚无有效的治疗药物。近年来中药引入呼吸急重症治疗领域给ALI/ARDS的治疗带来新的希望。

ALI/ARDS根据其发病特点及临床表现，归属“暴喘”范畴，属于中医学“喘病”的急性发作阶段，是一种肺系“急性虚证”。肺气虚损、肺失宣降是ALI/ARDS的根本病因，“痰、热、瘀、虚”是ARDS发病过程中的关键病机，因此，清热豁痰、宣肺行水、活血化瘀、调气补虚是ARDS根本治则。中药施治的主要特点是多成分、多靶点、相互作用。

中国专利202011019678.6中公开了一种具有抗炎作用的中药组合物、应用及抗炎药物制剂。其中具有抗炎作用的中药组合物，由质量百分比为5-90％的柴胡总皂苷和10-95％的羊栖菜岩藻黄质组成。通过整体水平上、分子细胞水平的活性试验研究，对柴胡皂苷和羊栖菜岩藻黄质具有抗炎作用的活性化合物进行配比，柴胡皂苷和羊栖菜岩藻黄质组合后在治疗急性肺损伤方面达到具有协同效应，相比单独使用柴胡总皂苷或羊栖菜岩藻黄质具有更佳疗效，作为新型治疗急性肺损伤药物有着良好的应用前景。但其制备方法过于复杂。

中国专利202010220784.4中公开了一种中药组合物在制备治疗急性肺损伤的药物中的用途，中药组合包括如下原料药：重楼，黄芩，浙贝母，鸭跖草，知母，石膏，陈皮，枳壳，苍耳子，苦杏仁，桔梗，广藿香，紫苏叶，炙甘草。研究结果显示，上述的中药组合物能够降低急性肺损伤模型大鼠的肺含水量、肺通透性指数，降低细胞炎症因子水平，改善急性肺损伤的肺组织病理学改变，对急性肺损伤具有明显的治疗效果，适于临床推广应用。但其药物用量较大，有进一步优化的空间。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物。该药物以宁肺平血汤(Ning Fei Ping Xue,NFPX)为治法，能够有效改善呼吸指数，降低临床死亡率；减轻肺水肿、抑制细胞凋亡和炎症因子释放。

一方面，本发明提供了一种治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物。

所述的中药组合物由下列重量份的原料药制成：黄芪0-100份，当归0-100份，川芎0-100份，白芍0-100份，桃仁0-100份，红花0-100份，地龙0-100份，生地0-100份，肉桂0-100份，猪苓0-100份，泽泻0-100份，茯苓0-100份，白术0-100份，黄连0-100份，黄芩0-100份，黄柏0-100份，山栀0-100份，葶苈子0-100份，芦根0-100份，薏米0-100份。

优选地，所述的中药组合物中包括：黄芪1-10份，当归1-10份，川芎1-10份，白芍5-10份，桃仁1-10份，红花1-5份，地龙5-10份，生地10-20份，肉桂20-30份，猪苓10-30份，泽泻20-50份，茯苓5-10份，白术1-5份，黄连10-20份，黄芩20-30份，黄柏1-5份，山栀1-10份，葶苈子10-20份，芦根30-50份，薏米10-30份。

进一步优选地，所述的中药组合物中包括：黄芪5份，当归4份，川芎7份，白芍8份，桃仁2份，红花5份，地龙9份，生地20份，肉桂24份，猪苓30份，泽泻50份，茯苓6份，白术4份，黄连18份，黄芩30份，黄柏5份，山栀7份，葶苈子17份，芦根40份，薏米21份。

所述的药物组合物在施用时采用加水煎煮的方式。

优选地，所述的加水煎煮具体操作为：按比例称取中药原料，加水煎煮2次，每次1h，第一次加水12倍量(质量体积比)，第二次加8倍量(质量体积比)水，制得所述的中药组合物汤剂。所述的倍量指加水的体积为药物质量的倍数。

另一方面，本发明提供了一种治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的药物。

所述的药物中包括前述的中药组合物或其提取物。

所述的提取物包括但不限于水提取物或酒精提取物。

所述的药物中还包括药学上常规的辅料。

所述的药学上常规的辅料包括但不限于：乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂。

优选地，所述的药物为口服制剂，包括但不限于：颗粒剂、片剂、胶囊剂、汤剂、丸剂、口服剂和糖浆剂。

再一方面，本发明提供了前述的中药组合物在制备治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用。

所述的药物中包括前述的中药组合物或其提取物。

所述的提取物包括但不限于水提取物或酒精提取物。

所述的药物中还包括药学上常规的辅料。

所述的药学上常规的辅料包括但不限于：乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂。

优选地，所述的药物为口服制剂，包括但不限于：颗粒剂、片剂、胶囊剂、汤剂、丸剂、口服剂和糖浆剂。

本发明的有益效果：

1、本发明的中药组合物配伍得当，效果显著，用药方便，成本低廉，毒副作用小，值得推广。

2、本发明的中药组合物的组成和配比是在长期的临床和实验研究过程中通过不断筛选优化而成，具有效果显著的优点。

3、本发明的中药组合物可以有效改善ALI/ARDS患者的呼吸指数，降低临床死亡率；动物实验中，该中药组合物能有效缓解急性肺损伤小鼠肺的炎症反应、减轻肺水肿、抑制炎症因子释放和细胞凋亡，从能抑制急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的发生发展。

附图说明

图1为肺部超声评价宁肺平血汤减轻ALI/ARDS小鼠肺水肿的疗效。

图2为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织炎症反应的影响实验HE染色结果。

图3为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺损伤评分结果。

图4为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺湿/干比结果。

图5为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺泡灌洗液总细胞数结果。

图6为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织细胞凋亡的TUNEL免疫荧光染色结果。

图7为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织细胞凋亡的统计结果。

图8为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺泡灌洗液IL-1β浓度结果。

图9为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺泡灌洗液IL-6浓度结果。

图10为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺泡灌洗液TNF-α浓度结果。

图11为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠血清IL-1β浓度结果。

图12为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠血清IL-6浓度结果。

图13为宁肺平血汤对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠血清TNF-α浓度结果。

图14为宁肺平血汤与ARDS的中药-化合物-靶点网络关系图。

图15为宁肺平血汤治疗ALI/ARDS靶蛋白-靶蛋白之间的网络关系图(PPI)。

图16为转录组学分析小鼠肺组织差异表达基因(DEGs)热图。

图17为转录组学分析小鼠肺组织差异表达基因火山图。

图18为转录组学GO分析NFPX治疗ARDS相关的分子机制。

图19为转录组学KEGG通路富集分析主要富集信号通路。

图20为转录组学GO分析NFPX治疗ARDS相关的分子机制。

图21为转录组学KEGG通路富集分析主要富集信号通路。

图22为转录组学GO分析NFPX治疗ARDS相关的分子机制。

图23为转录组学KEGG通路富集分析主要富集信号通路。

图24为qRT-PCR分析宁肺平血汤治疗ALI/ARDS的潜在基因靶点。

需要特别说明的是，图14-16为分析软件直出图，无需进行修改，不影响本申请技术方案的确定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(一)

黄芪5份，当归4份，川芎7份，白芍8份，桃仁2份，红花5份，地龙9份，生地20份，肉桂24份，猪苓30份，泽泻50份，茯苓6份，白术4份，黄连18份，黄芩30份，黄柏5份，山栀7份，葶苈子17份，芦根40份，薏米21份。按常规方法煎煮。

实施例2治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(二)

黄芪30份，当归6份，川芎8份，白芍24份，桃仁7份，红花12份，地龙14份，生地30份，肉桂14份，猪苓16份，泽泻48份，茯苓20份，白术35份，黄连50份，黄芩6份，黄柏18份，山栀10份，葶苈子40份，芦根36份，薏米20份。按常规方法煎煮。

实施例3治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(三)

黄芪2份，当归4份，川芎8份，白芍12份，桃仁40份，红花4份，地龙4份，生地6份，肉桂16份，猪苓20份，泽泻60份，茯苓30份，白术6份，黄连12份，黄芩40份，黄柏20份，山栀25份，葶苈子40份，芦根3份，薏米6份。按常规方法煎煮。

实施例4治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(四)

黄芪28份，当归14份，川芎6份，白芍10份，桃仁14份，红花4份，地龙18份，生地5份，肉桂8份，猪苓17份，泽泻9份，茯苓20份，白术24份，黄连5份，黄芩6份，黄柏5份，山栀35份，葶苈子4份，芦根24份，薏米6份。按常规方法煎煮。

实施例5治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(五)

黄芪10份，当归30份，川芎20份，白芍20份，桃仁25份，红花15份，地龙50份，生地10份，肉桂20份，猪苓50份，泽泻75份，茯苓30份，白术10份，黄连20份，黄芩12份，黄柏5份，山栀7份，葶苈子8份，芦根25份，薏米10份。按常规方法煎煮。

实施例6治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(六)

黄芪24份，当归8份，川芎24份，白芍12份，桃仁8份，红花16份，地龙8份，生地10份，肉桂18份，猪苓40份，泽泻10份，茯苓50份，白术50份，黄连30份，黄芩20份，黄柏6份，山栀10份，葶苈子18份，芦根10份，薏米10份。按常规方法煎煮。

实施例7治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(七)

黄芪10份，当归4份，川芎14份，白芍30份，桃仁40份，红花50份，地龙12份，生地6份，肉桂70份，猪苓12份，泽泻6份，茯苓15份，白术15份，黄连6份，黄芩7份，黄柏15份，山栀15份，葶苈子30份，芦根18份，薏米6份。按常规方法煎煮。

实施例8治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(八)

黄芪60份，当归6份，川芎50份，白芍8份，桃仁6份，红花18份，地龙7份，生地6份，肉桂30份，猪苓25份，泽泻6份，茯苓35份，白术60份，黄连10份，黄芩8份，黄柏17份，山栀24份，葶苈子44份，芦根6份，薏米15份。按常规方法煎煮。

实施例9治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(九)

黄芪30份，当归15份，川芎8份，白芍10份，桃仁7份，红花40份，地龙8份，生地10份，肉桂30份，猪苓15份，泽泻35份，茯苓45份，白术28份，黄连10份，黄芩10份，黄柏50份，山栀50份，葶苈子8份，芦根30份，薏米20份。按常规方法煎煮。

实施例10治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(十)

黄芪10份，当归60份，川芎30份，白芍23份，桃仁70份，红花10份，地龙70份，生地75份，肉桂45份，猪苓80份，泽泻4份，茯苓5份，白术5份，黄连32份，黄芩40份，黄柏15份，山栀15份，葶苈子10份，芦根15份，薏米15份。按常规方法煎煮。

实施例11治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(十一)

黄芪20份，当归19份，川芎34份，白芍10份，桃仁22份，红花9份，地龙18份，生地15份，肉桂14份，猪苓15份，泽泻24份，茯苓28份，白术15份，黄连30份，黄芩15份，黄柏30份，山栀15份，葶苈子40份，芦根25份，薏米15份。按常规方法煎煮。

实施例12治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物(十二)

黄芪60份，当归30份，川芎7份，白芍12份，桃仁32份，红花10份，地龙42份，生地21份，肉桂15份，猪苓12份，泽泻10份，茯苓7份，白术15份，黄连8份，黄芩15份，黄柏16份，山栀15份，葶苈子10份，芦根15份，薏米15份。按常规方法煎煮。

需要说明的是，实施例1-12所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。

实施例13治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物汤剂的制备

按照实施例1-12任一所述的比例称取中药原料，加水煎煮2次，每次1h，第一次加水12倍量，第二次加8倍量水，制得所述的中药组合物汤剂。

实施例14治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物片剂的制备

按照实施例1-12任一所述的比例称取中药原料，加水煎煮2次，每次1h，第一次加水12倍量，第二次加8倍量水，滤药渣，合并两次滤液，将水溶液合并后浓缩至相对密度为1.05-1.06(70℃)，加乙醇使含醇量达55％，静置，滤过，滤液回收乙醇后并浓缩至相对密度为1.12-1.16(60℃)的流浸膏；将上述药物药渣细粉、包合物、流浸膏、与适量辅料混匀后一步制粒，压片，包薄膜衣即得。

实施例15治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物颗粒的制备

按照实施例1-12任一所述的比例称取中药原料，加水煎煮2次，每次1h，第一次加水12倍量，第二次加8倍量水，滤药渣，合并两次滤液,与上述水溶液合并后浓缩至相对密度为1.05-1.06(70℃)，加乙醇使含醇量达55％，静置，滤过，滤液回收乙醇后并浓缩至相对密度为1.12-1.16(60℃)的流浸育；将上述药物细粉、包合物、流浸膏、与适量辅料混匀后一步制粒，即得。

实施例16治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物胶囊的制备

按照实施例1-12任一所述的比例称取中药原料，加水煎煮2次，每次1h，第一次加水12倍量，第二次加8倍量水，滤药渣,合并两次滤液，与上述水溶液合并后浓缩至相对密度为1.05-1.06(70℃)，加乙醇使含醇量达55％，静置，滤过，滤液回收乙醇后并浓缩至相对密度为1.12-1.16(60℃)的流浸膏；将上述药物细粉、包合物、流浸膏、与适量辅料混匀，装胶囊即得。

实施例17治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物合剂/口服液/糖浆剂的制备

按照实施例1-12任一所述的比例称取中药原料，加8-10倍量水，煎煮3小时，滤出药汁。再加8倍量水，煎煮2小时，滤出药汁，合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料，制成合剂、口服液或糖浆剂。

实验例1临床研究中药组合物治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的临床疗效

1.研究方法

回顾分析2020年1月至2021年1月在郑州大学第一附属医院呼吸ICU诊断为ARDS(根据柏林定义)的住院患者61人。其中32人给予常规治疗(呼吸支持、抗感染、脏器功能保护、糖皮质激素等)，29人在常规治疗的同时给予宁肺平血汤(NFPX)(黄芪5份，当归4份，川芎7份，白芍8份，桃仁2份，红花5份，地龙9份，生地20份，肉桂24份，猪苓30份，泽泻50份，茯苓6份，白术4份，黄连18份，黄芩30份，黄柏5份，山栀7份，葶苈子17份，芦根40份，薏米21份，按常规方法煎煮)口服或鼻饲(20g，每日两次)。对比两组患者的呼吸指数(PaO

2.研究结果

宁肺平血汤+常规治疗组呼吸指数(氧合指数)改善率为82.8％，28天死亡率为10.3％，均优于常规治疗组(呼吸指数改善率：56.3％，28天死亡率：31.3％)，p<0.05(表1)。

表1中药联合常规疗法治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的临床疗效对比

实验例2中药组合物对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺水肿的影响

1.研究方法

肺超声采用高分辨率的Vevo2100超声系统(Visualsonics Inc,Toronto,Canada)，换能器探头为超高频(40MHz)，最大分辨率为30μm，成像深度为10.0mm。小鼠暴露于脂多糖24小时后，用脱毛膏去除小鼠前胸的毛发。分组设置：健康对照组、ARDS组、ARDS+低浓度NFPX组、ARDS+中浓度NFPX组、ARDS+高浓度NFPX组、高浓度NFPX组，NFPX组合物(黄芪5份，当归4份，川芎7份，白芍8份，桃仁2份，红花5份，地龙9份，生地20份，肉桂24份，猪苓30份，泽泻50份，茯苓6份，白术4份，黄连18份，黄芩30份，黄柏5份，山栀7份，葶苈子17份，芦根40份，薏米21份。按常规方法煎煮)各组别的处理方式为：

健康对照组：40uL生理盐水气道内滴注+0.4mL生理盐水灌胃；

ARDS组：2mg/kg脂多糖溶于40uL生理盐水气道内滴注+0.4mL生理盐水灌胃；

ARDS+低浓度NFPX组：2mg/kg脂多糖溶于40uL生理盐水气道内滴注+2.6g/kg宁肺平血汤溶于0.4mL生理盐水灌胃；

ARDS+中浓度NFPX组：2mg/kg脂多糖溶于40uL生理盐水气道内滴注+5.2g/kg宁肺平血汤溶于0.4mL生理盐水灌胃；

ARDS+高浓度NFPX组：2mg/kg脂多糖溶于40uL生理盐水气道内滴注+10.4g/kg宁肺平血汤溶于0.4mL生理盐水灌胃；

高浓度NFPX组：40ul生理盐水气道内滴注+10.4g/kg宁肺平血汤溶于0.4mL生理盐水灌胃；

肺部超声图像由彩超专业技术人员采集并分析。

2.研究结果

用肺部超声评价NFPX改善肺水肿的作用。正常肺组织的典型超声表现为A线(胸膜线以下均匀的水平短线)。而ARDS的肺部超声表现为：B线(与胸膜线垂直的类似彗星尾状高回声影)、胸膜增厚和磨玻璃区。结果如图1：与健康对照组相比，ARDS小鼠肺部超声表现为较多B线、明显胸膜增厚和磨玻璃区(图1中的b)。与ARDS组相比，低浓度、中浓度和高浓度NFPX均明显减轻肺水肿征象，且高浓度NFPX治疗效果最佳(图1中的c-e)。此外，单独高浓度NFPX处理小鼠未见明显肺水肿(图1中的f)。这些数据提示宁肺平血汤可有效减轻ARDS小鼠肺水肿，且无明显副作用。

实验例3中药组合物对脂多糖诱导的ALI/ARDS小鼠肺组织炎症反应的影响

针对实验例2中的各组小鼠进行肺组织炎症反应的研究，具体如下：

1、研究方法

处死小鼠，取肺组织，左肺叶灌注4％多聚甲醛，石蜡包埋，切片机切4微米厚的切片，进行HE染色，并由两名熟练的病理学家复查。为了量化肺损伤和炎症反应，采用半定量组织学评分方法。即肺泡水肿、肺出血、肺不张和炎症细胞浸润均按0-4分进行评分。将四项组织学指标得分相加，计算总得分。根据说明书，使用TUNEL试剂盒检测小鼠肺组织样本的凋亡细胞。对照组用PBS代替一抗。湿/干比是计算血管外肺水肿的指标。采集右肺叶，尽快称重，得到“湿重”。然后将肺组织置于65℃培养箱中48小时，重新称重，得到“干重”。肺湿/干比＝湿重除以干重。取小鼠眶后静脉血入2mL Eppendorf管，室温下静置2小时，直到血液凝固。离心机1000×g离心15分钟分离血清。气管内滴注给予1mL PBS收集BALF(肺泡灌洗液)。采用ELISA试剂盒(购自Cusabio，货号为CSB-EL0523、CSB-EL01370、CSB-EL04532)检测血清和BALF中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度，按照说明书的方法进行实验。

2、研究结果

ARDS模型组小鼠肺泡-间质水肿、肺出血、肺不张和炎症细胞浸润最严重，肺损伤评分最高(图2-3)。宁肺平血汤(NFPX)治疗有效地减轻了脂多糖引起的病理改变，且表现为剂量依赖性。单用NFPX治疗无明显的病理损伤。再者，NFPX显著降低了ARDS小鼠的肺湿/干重比(图4)和BALF细胞数(图5)。此外，NFPX显著抑制了ARDS小鼠肺组织的细胞凋亡水平(图6-7)，以及BALF中和血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(图8-13)。

实验例4采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法分析宁肺平血汤化学物质成分

1、研究方法

运用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法(UPLC-Q-TOF-MS)对宁肺平血汤样品进行色谱条件优化，采集样品数据结合文献报道以及天然产物高分辨质谱数据库，对宁肺平血汤样品进行化学成分鉴定。

2、研究结果

采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法(UPLC-Q-TOF/MS)对宁肺平血汤样品进行分析，根据样品多级质谱信息，结合天然产物高分辨质谱数据库及相关文献，从宁肺平血汤样品中鉴定出150个化合物(表2)。

表2宁肺平血汤样品成分鉴定结果

实验例5采用中药网络药理学方法构建该中药组合物的化合物-靶点网络关系图

1、研究方法

在TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及SymMap数据库(https://www.symmap.org)中，检索方中20味中药的化合物成分和药物靶点，以OB≥30％和DL指数≥0.18作为筛选标准。在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM数据库(http://www.omim.org/)检索急性呼吸窘迫综合征及炎症相关的靶标。比较NFPX的蛋白靶标与toxicogenomics数据库检索的ARDS的基因靶点(CTD)(http://ctdbase.org/)，生成基因交集。采用STRING11.0(http://string-db.org/)软件获得NFPX治疗ARDS靶蛋白-靶蛋白之间的网络关系图(PPI)。为了进一步预测NFPX治疗ARDS的分子机制，利用Cytoscape3.7.2软件建立了中药-化合物-基因靶点网络关系图。通过GO富集分析和KEGG pathway分析明确了可能的信号通路。

2、研究结果

TCMSP数据库和SymMap数据库共筛选出1610个NFPX成分，有821个组分(51.0％)满足OB≥30％标准，663个组分(41.2％)满足DL指数≥0.18标准，254个组分(15.8％)同时满足OB≥30％和DL指数≥0.18标准。因此，我们选择这254个成分作为候选活性成分进行进一步分析。从TCMSP数据库和SymMap数据库中检索到13754个蛋白靶蛋白，从GeneCards数据库和OMIM数据库中检索到ARDS基因符号3381个，然后利用CTD数据库将NFPX与ARDS靶蛋白进行比对，得到基因相交点。共筛选出NFPX中11味中药，37种化合物和77个基因靶点与ARDS相关(图14)。利用STRING软件构建PPI网络，显示77个目标蛋白的关联(图15)。

实验例6转录组学的方法预测宁肺平血汤治疗ALI/ARDS的分子靶点

1.研究方法

将6组小鼠肺组织样本送至华大基因研究所进行RNA提取、cDNA文库构建、鉴定，利用Illumina HiSeqTM测序平台进行RNA-seq检测，并最终进行生物信息学分析。基于GO功能和KEGG通路分析对DEGs进行定量分析。以log2(Fold Change)≥1和FDR≤0.05为显著DEGs的阈值。

2.研究结果

基因聚类分析热图显示了11629个差异表达基因(DEGs)。结果如图16：LPS小鼠与健康对照组基因表达谱截然相反，而LPS+NFPX组的基因表达谱介于LPS组和健康对照组之间。LPS+LNFPX(低浓度NFPX)组的基因表达谱接近于LPS组，而LPS+HNFPX(高浓度NFPX)组和LPS+MNFPX(中浓度NFPX)组的基因表达谱更接近于健康对照组。用DESeq2软件对DEGs进行了火山图分析。结果如图17：与LPS组对比，LPS+LNFPX组筛选出21个上调基因和48个下调基因(图17中的a)；LPS+MNFPX组筛选出1个上调基因和2个下调基因(图17中的b)；LPS+HNFPX组筛选出96个上调基因和403个下调基因(图17中的c)。转录组GO分析提示NFPX治疗ARDS相关的分子机制与免疫反应、淋巴细胞激活、炎症反应等相关(图18、图20、图22)。同样的，KEGG富集分析表明，主要富集信号通路涉及到免疫炎症反应、感染性疾病相关通路，如：CAMs通路、Ras通路、NF-κB通路、Notch通路等(图19、图21、图23)。

实验例7qRT-PCR验证宁肺平血汤治疗ALI/ARDS的分子靶点

1.研究方法

使用RNA提取试剂盒从肺组织中提取总RNA。使用ABI Stepone plus PCR系统进行反转录和扩增。ACTB mRNA表达量作为内参。引物设计如下：

2.研究结果

结果如图24所示，与LPS处理组相比，MNFPX处理组和HNFPX处理组SMAD4表达显著下调(p<0.05)。此外，NFPX处理组显著降低HIF-1和AMPK的表达呈剂量依赖性(p<0.05)。NFPX+LPS组HRAS、SOD1、AKT2、RAC1、P53表达与LPS组比较差异无统计学意义。因此，SMAD4、HIF-1和AMPK是宁肺平血汤治疗ALI/ARDS的潜在分子靶点。

序列表

<110> 北京三医智慧科技有限公司

<120> 一种治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的中药组合物及其应用

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