肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：S1.采取EHP阳性组织，提取核酸，用pMD8‑T载体在E.coli DH5α中克隆，克隆片段后进行生物测序，验证正确后经扩大培养后提取质粒；S2.QPCR采用SYBR染料法进行；S3.标准曲线建立；S4.样品进行检测时，提取样品核酸，检测DNA浓度后和标准品一起进行QPCR实验，最后根据标准品建立标准曲线后，将检测样品的Ct值代入标准曲线，得到样品的总体拷贝数，在除以样品的核酸浓度得到样品每ng DNA含有的EHP病毒拷贝数。该荧光定量PCR方法具有耗时短、通用性强、灵敏度较高、可重复性好且易于操作等优点，满足临床上对EHP快速定量检测的需求，对于控制该病的传播具有重要意义，相比于现有技术，更加经济实惠，适合大规模推广。

说明书

技术领域

本发明属于检测领域，具体是肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法。

背景技术

肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离而命名，其全名为“肠道上皮细胞微孢子虫”，属于微孢子虫科、肠胞虫属。

EHP易感染斑节对虾和凡纳滨对虾，2013年EHP在国内首次发现，据报道，EHP侵染对虾肝胰腺部位，感染了肝肠胞虫的对虾一般不像白斑综合征(WSD)、黄头病(YHD)造成的急性肝胰腺坏死出现急性、大规模死亡现象，感染EHP的对虾表现摄食正常，但体色、胃、肠均明显异常，体色发白、肠道吸收功能下降，严重的出现肝胰腺萎缩，个别凡纳滨对虾会出现白便，该病在早期难以发现，往往再养殖30～45d以上才发现生长缓慢、不长个的现象，极易造成饲料损耗，给养殖户的生产活动带来严重影响。

EHP的感染途径较广，可通过受精卵和虾苗垂直传播，也可以通过污染养殖水体水平传播。切断感染途径能有效防止感染，通过对亲虾与虾苗的检疫，能及早发现病原，防止感染健康虾苗，从而保障对虾养殖行业的根本利益。

目前，EHP的检测方法主要采用PCR或套式PCR方法，《SCT 7232-2020虾肝肠胞虫病诊断规程》规定了一种虾肝肠胞虫的套式PCR检测方法，这种方法耗时长、检出限高，对于早期感染或者潜伏感染的检出率较低，而且这种方法只能进行定性检测，不能分析肝肠胞虫的感染量。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

S1.采取EHP阳性组织，提取核酸，用常规PCR扩增获取目的产物主要是SSU rDNA这一段序列，用pMD8-T载体在E.coli DH5α中克隆，克隆片段后进行生物测序，验证正确后经扩大培养后提取质粒，检测质粒浓度后换算成拷贝数1.0×10

S2.QPCR采用SYBR染料法进行，扩增程序为95℃30s，95℃5s、60℃20s，40个循环，在60℃结束时收集荧光信号，扩增完成后测定产物的溶解曲线；

S3.标准曲线建立：将构建好的标准品进行10倍梯度稀释，得到1.0×10

S4.样品进行检测时，提取样品核酸，检测DNA浓度后和标准品一起进行QPCR实验，最后根据标准品建立标准曲线后，将检测样品的Ct值代入标准曲线，得到样品的总体拷贝数，在除以样品的核酸浓度得到样品每ng DNA含有的EHP病毒拷贝数。

作为本发明的进一步方案，在S1中，采用软件按荧光定量PCR引物的设计原则，在EHP-SSU rDNA基因保守区域设计多组特异性的扩增引物，经软件分析比较并适当修改优化获得三组评价较理想的引物，并通过NCBI数据库进行BLAST同源性比对验证特异性后合成。

作为本发明的进一步方案，在S1中，提取质粒pMD8-T-SSUEHP，测定其浓度并转换为拷贝数，并以10倍梯度稀释至1.0×10

作为本发明的进一步方案，在S1中，EHP扩增产物可以连接到pUC57、pUC58等克隆载体中构建重组质粒，作为标准品质粒。

作为本发明的进一步方案，在S1中，可以采用FAM、Cy5、ROX、HEX等染料法，或者采用MGB探针法、FRET探针法、分子信标探针法、Amplifluor引物法、LUX引物法等。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

该荧光定量PCR方法具有耗时较短、通用性强、灵敏度较高、可重复多次使用且易于操作等优点，满足临床上对EHP快速定量检测的需求的同时，且能提高EHP低感染水平如早期感染或潜伏感染的阳性检出率，对于控制该病的传播具有重要意义，相比于现有技术，更加经济实惠，适合大规模推广。

附图说明

图1是实施例3中标准品溶液的荧光信号；

图2是实施例3中标准品溶液的溶解曲线；

图3是实施例3中阴性对照的荧光信号；

图4是实施例3中阴性对照的溶解曲线；

图5是实施例3中空白对照的荧光信号；

图6是实施例3中空白对照的溶解曲线；

图7是实施例3中根据标准品溶液作出的标准曲线；

图8是实施例3中标准品DNA为20拷贝/反应时的荧光信号；

图9是实施例3中标准品DNA为20拷贝/反应时的溶解曲线；

图10是实施例3中标准品DNA为2拷贝/反应时的荧光信号；

图11是实施例3中标准品DNA为2拷贝/反应时的溶解曲线；

图12是实施例4中待测样品的荧光信号；

图13是实施例4中待测样品的溶解曲线；

具体实施方式

实施例1：

采用PrimerExpress软件按荧光定量PCR引物的设计原则，在EHP-SSU rDNA基因保守区域设计多组特异性的扩增引物，经Oligo软件分析比较并适当修改优化获得三组评价较理想的引物(如下表)，并通过NCBI数据库进行BLAST同源性比对验证特异性后合成。

用常规PCR扩增获取目的产物主要是SSU rDNA这一段序列。

实施例2:

阳性组织病原核酸的提取及重组质粒标准品的制备。

采取EHP阳性组织，提取基因组DNA，最后加50～100μL洗脱缓冲液溶解DNA，置于–20℃保存备用。

以EHP阳性组织基因组DNA为模板，灭菌ddH2O为空白对照，进行PCR扩增。参考试剂及仪器使用说明。

PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD8-T连接，制备重组质粒pMD8-T-SSUEHP，转化到Ecoli.DH5α中，并进行PCR及测序鉴定，验证正确后扩大培养，提取重组质粒pMD8-T-SSUEHP，测定其浓度并转换为拷贝数，–20℃保存备用。

结果表明：以EHP阳性组织基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得与预期目的片段大小一致的特异性条带；重组质粒pMD8-T-SSUEHP经PCR、测序鉴定，所得目的片段序列与GenBank上公布的EHP-SSU rDNA基因在本发明上下游引物之间序列的同源性为100％，说明目的基因片段正确连接入pMD8-T载体，即重组质粒pMD8-T-SSUEHP构建成功。

取阳性克隆菌液提取质粒，测定浓度并转换为拷贝数，pMD8-T-SSUEHP浓度为9.79×10

实施例3

标准曲线建立：将构建好的标准品进行10倍梯度稀释，得到1.0×10

上述结果表明，本发明建立的EHP荧光定量PCR检测方法对标准品具有很高的扩增效率，标准品起始模板为2.0×10

实施例4

样品进行检测时，提取样品核酸，检测DNA浓度后和标准品一起进行QPCR实验，最后根据标准品建立标准曲线后，将检测样品的Ct值代入标准曲线，得到样品的总体拷贝数，再除以样品的核酸浓度得到样品每ng DNA含有的EHP病毒拷贝数(copies/ng DNA)。待测样品3个重复的Ct值分别为16.53、16.60、16.50，有明显的扩增曲线，且重复性好，如图12所示，溶解曲线单一，如图13所示。

该荧光定量PCR方法具有耗时短、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点，不仅能满足临床上对EHP快速定量检测的需求，且能提高EHP低感染水平如早期感染或潜伏感染的阳性检出率，对于控制该病的传播与扩散具有重要意义。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。