一种筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法

摘要

本发明公开了一种筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法。本发明提供了一种筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法，包括：选择与标准紫云英品种相比，AsSPX‑MFS2蛋白和/或其编码基因表达量更高且AsVPE1蛋白和/或其编码基因表达量更低的所述待测紫云英品种，即为或候选为无机磷高积累的紫云英品种。本发明主要通过实时荧光定量PCR技术对AsVPE1和AsSPX‑MFS2基因的表达水平快速检测来筛选紫云英无机磷高积累品种。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法。

背景技术

紫云英是我国主要农区的豆科绿肥作物。作为一种清洁能源，它能够养护土地，改善生态环境。由于根瘤(豆科植物根系与根瘤真菌的共生体系)的存在，紫云英具有很强的固氮能力，同时能积累大量的无机磷，实现以磷增氮的优化效应。紫云英通常在水稻种植前被翻压入田，释放大量作物所需的矿质营养。由于土壤中可利用的速效磷含量极少，选择无机磷积累量高的紫云英品种翻压入田不仅能为下茬作物供应更多的有效磷素养分，还能释放更多的氮素养分。但是，如何筛选培育无机磷高积累的紫云英品种一直没有一个简单行之有效的方法。使得紫云英品种的培育变得耗时耗力。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法。

第一方面，本发明要求保护一种筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法。

本发明所要求保护的筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法，可包括如下步骤：

(A1)检测待测紫云英品种中AsSPX-MFS2蛋白和/或其编码基因表达量，以及AsVPE1蛋白和/或其编码基因表达量；

(A2)选择与标准紫云英品种相比，AsSPX-MFS2蛋白和/或其编码基因表达量更高且AsVPE1蛋白和/或其编码基因表达量更低的所述待测紫云英品种，即为或候选为无机磷高积累的紫云英品种。

其中，所述标准紫云英品种可为信紫1号。

第二方面，本发明要求保护一种比较不同紫云英品种无机磷积累量高低的方法。

本发明所要求保护的比较不同紫云英品种无机磷积累量高低的方法，可包括如下步骤：

(B1)检测待测紫云英品种中AsSPX-MFS2蛋白和/或其编码基因表达量，以及AsVPE1蛋白和/或其编码基因表达量；

(B2)AsSPX-MFS2蛋白和/或其编码基因表达量相对较高且AsVPE1蛋白和/或其编码基因表达量相对较低的所述待测紫云英品种的无机磷积累量高于或候选高于AsSPX-MFS2蛋白和/或其编码基因表达量相对较低且AsVPE1蛋白和/或其编码基因表达量相对较高所述待测紫云英品种的无机磷积累量。

进一步地，所述AsSPX-MFS2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述AsVPE1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述AsSPX-MFS2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。所述AsVPE1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明中，步骤(A1)和(B1)中，是在转录水平上检测所述AsSPX-MFS2蛋白的编码基因的表达量，以及所述AsVPE1蛋白的编码基因表达量。

具体而言，是通过实时荧光定量PCR技术在转录水平上检测所述AsSPX-MFS2蛋白的编码基因的表达量，以及所述AsVPE1蛋白的编码基因表达量的。

更加具体地，检测所述AsSPX-MFS2蛋白的编码基因的表达量时采用的引物对为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成。检测所述AsVPE1蛋白的编码基因的表达量时采用的引物对为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成。

第二方面，本发明要求保护如下(a1)和(a2)在作为分子标记在筛选无机磷高积累的紫云英品种或比较不同紫云英品种无机磷积累量高低中的应用：

(a1)AsSPX-MFS2蛋白和/或其编码基因；

(a2)AsVPE1蛋白和/或其编码基因。

第三方面，本发明要求保护用于检测如下(a1)和(a2)的物质在筛选无机磷高积累的紫云英品种或比较不同紫云英品种无机磷积累量高低中的应用：

(a1)AsSPX-MFS2蛋白和/或其编码基因；

(a2)AsVPE1蛋白和/或其编码基因。

其中，所述用于检测如下(a1)和(a2)的物质可为能够用于检测所述(a1)和所述(a2)的任何物质，如引物、抗体等。

在本发明的具体实施方式中，所述用于检测如下(a1)和(a2)的物质具体为由SEQID No.5和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对1和由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对2。

在本发明中，所述无机磷高积累的紫云英品种为与标准紫云英品种相比，体内无机磷含量更高的紫云英品种。

在本发明的具体实施方式中，所述无机磷积累具体为在2-200μM外源无机磷(Pi)浓度下的无机磷积累。

进一步地，所述标准紫云英品种可为信紫1号。

本发明通过紫云不同品种的AsVPE1和AsSPX-MFS2基因检测分析发现：无机磷高积累的紫云英品种AsVPE1基因表达水平低，AsSPX-MFS2表达水平高；相反，无机磷低积累的紫云英品种AsVPE1基因表达水平高，AsSPX-MFS2表达水平低。这说明AsVPE1基因和AsSPX-MFS2基因的表达水平和紫云英品种的无机磷含量是协同关联的，可以作为紫云英无机磷积累能力的一个判断依据，即分子筛选标记。

本发明主要通过实时荧光定量PCR技术对AsVPE1和AsSPX-MFS2基因的表达水平快速检测来筛选紫云英无机磷高积累品种。

附图说明

图1为6个紫云英品种在不同供磷水平下生理表型分析：6个紫云英品种幼苗在不同磷浓度(高磷，200μM Pi；中磷，20μM Pi；低磷，2μM Pi)水培条件下生长12天。a为不同供磷水平下不同紫云英品种的生长表型，Scale bar＝5cm；b和c分别为不同供磷水平下不同紫云英品种的地上部和地下部生物量；d为不同供磷水平下不同紫云英品种的地上部相对生物量；e为不同供磷水平下不同紫云英品种根冠比；f和g分别为不同供磷水平下不同紫云英品种的地上部及地下部有效磷含量。数据为平均值±SE，应用ANOVA和LSD进行不同物种间统计学显著性检测。不同字母代表每一组处理间的差异显著(p<0.05)，FW代表鲜重。

图2为不同磷处理条件下余江大叶和信紫1号中液泡磷转运基因的相对表达量。a为余江大叶和信紫1号中AsSPX-MFS2基因在不同磷浓度(高磷，200μM Pi；中磷，20μM Pi；低磷，2μM Pi)条件下的相对表达量。b为余江大叶和信紫1号中AsVPE1基因在不同磷浓度(高磷，200μM Pi；中磷，20μM Pi；低磷，2μM Pi)条件下的相对表达量。余江大叶和信紫1号的幼苗在高磷，中磷，低磷，条件下生长12天，获取地上部分做qRT-PCR。数据是3个生物学重复的平均值。将余江大叶在高磷条件下基因的表达量设置为1。*代表显著差异，ns代表无显著差异(p<0.05，with Student’s t-test)。

图3为6个紫云英品种间液泡磷转运基因的表达量。a为6个紫云英品种中AsSPX-MFS2基因的表达量。b为6个紫云英品种中AsVPE1基因的表达量。在中磷(20μM Pi)条件下生长12天的紫云英幼苗，收获地上部分，做qRT-PCR分析。数据是3个生物学重复的平均值±SE。将余江大叶在中磷条件下基因的表达量设置为1。应用ANOVA和LSD进行不同物种间统计学显著性检测。不同字母代表每一组处理间的差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、筛选无机磷高积累紫云英品种的方法的建立

本发明供试材料是中国普遍种植的6个紫云英品种：信白1号，余江大叶，弋江籽，信紫1号，皖紫1号，湘肥2号。

1、各紫云英品种的表型和生理差异比较

将各紫云英品种在不同供磷水平条件(高磷，200mM Pi；中磷，20mM Pi；低磷，2mMPi)下培养12天，紫云英在可控的光照培养箱中生长：12h光照(光照强度：～200μmol·m

表1紫云英全营养液1000×母液配方(单位为mg/L)：

然后，将各紫云英品种的幼苗进行生物量，地上部相对生物量，根冠比，无机磷含量的测定，具体测定方法是本领域公知的常规方法，在此不做赘述。通过计算和对比，挑选出两个对低磷敏感差异的品种，余江大叶(敏感品种)和信紫1号(耐受品种)。两者相比，信紫1号的无机磷积累量更高。图1为6个紫云英品种在不同供磷水平下具体的生理表型分析结果。

2、AsVPE1和AsSPX-MFS2基因表达水平的定量化检测

用实时荧光定量PCR检测技术(Real time Quantitative PCR)对两个对低磷敏感差异的品种(余江大叶，敏感品种；信紫1号，耐受品种)中负责液泡无机磷内排AsVPE1和AsSPX-MFS2基因进行转录水平的量化。

本研究将紫云英As18sRNA作为内参基因。

分析相对表达量的方法(2

a)待测样品CT

b)对照样品CT

c)△CT＝△CT

表达量的比值＝2

用于检测AsSPX-MFS2基因的引物如下：

AsSPX-MFS2-F：5’-CTTGCCTGGGTGGGTTATG-3’(SEQ ID No.5)；

AsSPX-MFS2-R：5’-ATTTGACTGTTGTGGCGTATGA-3’(SEQ ID No.6)。

用于检测VPEs基因的引物如下：

AsVPE1-F：5’-GTTTGTCGTGCCAGGGTTAA-3’(SEQ ID No.7)；

AsVPE1-R：5’-TTTCCTCGTTCGGAGTTTCA-3’(SEQ ID No.8)。

用于检测内参基因As18sRNA的引物如下：

As18sRNA-F：5’-TCAACCATAAACGATGCCGA-3’；

As18sRNA-R：5’-GTTTCAGCCTTGCGACCATAC-3’。

不同磷处理条件下余江大叶和信紫1号中液泡磷转运基因的相对表达量如图2所示。信紫1号的AsVPE1基因表达水平低，AsSPX-MFS2表达水平高；余江大叶的AsVPE1基因表达水平高，AsSPX-MFS2表达水平低。

3、结果分析

综合步骤1和2的结果，可以看出：相比于无机磷积累量低的余江大叶，无机磷积累量高的紫云英品种信紫1号体内的AsSPX-MFS2基因的表达水平更高且AsVPE1基因的表达水平更低。步骤1和2的结果提示：选择与标准紫云英品种(信紫1号)相比，AsSPX-MFS2基因表达量更高且VPEs基因表达量更低的紫云英品种，可以作为无机磷高积累紫云英候选品种。这样的品种对于土壤归还有效磷素养分的贡献率最大。

实施例2、本发明筛选无机磷高积累紫云英品种的方法的验证实例

本发明的供试材料是中国普遍种植的6个紫云英品种：信白1号，余江大叶，弋江籽，信紫1号，皖紫1号，湘肥2号。

按照实施例1步骤2的方法，对中磷(20mM Pi)条件下各待测紫云英品种进行AsVPE1和AsSPX-MFS2基因表达水平的定量化检测。

结果显示：无机磷含量高的紫云英品种信紫1号的AsSPX-MFS2基因表达量最高，而AsVPE1基因的表达量最低(图3)。该结果表明无机磷积累高的紫云英品种具有较强的液泡运进能力，和较低的液泡磷输出能力。紫云英无机磷积累量与AsSPX-MFS2的表达水平正相关，与AsVPE1的表达水平负相关。

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 一种筛选无机磷高积累的紫云英品种的方法

<130> GNCLN201689

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 696

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Val Ala Phe Gly Lys Lys Leu Lys Asp Arg Gln Ile Gln Glu Trp

1 5 10 15

Gln Arg Tyr Tyr Ile Asn Tyr Lys Ile Met Lys Lys Arg Val Arg Gln

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35 40 45

Lys Asp Phe Ser Arg Met Leu Asp Asn Gln Ile Glu Lys Ile Val Leu

50 55 60

Phe Leu Leu Glu Gln Gln Gly Leu Leu Ala Ser Arg Ile Ala Lys Leu

65 70 75 80

Gly Glu His Gln Asp Ala Val Gln Gln Glu Pro Glu Ile Asn Lys Ile

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100 105 110

Leu Leu Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Ala Ile Gly Leu Arg Lys Ile Leu

115 120 125

Lys Lys Phe Asp Lys Arg Phe Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr Tyr Val

130 135 140

Lys Thr Arg Ala Asn His Pro Tyr Ser Gln Leu Gln Gln Val Phe Lys

145 150 155 160

His Val Gly Leu Gly Ala Val Val Gly Ala Leu Ser Arg Asn Leu His

165 170 175

Glu Leu Gln Asp Arg Gln Gly Ser Tyr Leu Ser Ile Tyr Asp Gln Pro

180 185 190

Ser Leu Pro Leu Gln Asp Pro Val Val Asp Ser Ile Asn Ala Ala Val

195 200 205

Asp Arg Leu Ser Asn Ser Thr Asn Phe Leu Asn Phe Leu Ala Gln His

210 215 220

Ala Leu Ile Met Gln Asp Glu Leu Pro Ala Pro Thr Glu Glu His Val

225 230 235 240

Asp Asp Asn Arg Tyr His Phe Met Ser Leu Leu Leu Asn Leu Ala Asn

245 250 255

Thr Phe Leu Tyr Met Val Asn Thr Tyr Ile Ile Val Pro Thr Ala Asp

260 265 270

Asp Tyr Ser Thr Ser Leu Gly Ala Ala Pro Thr Val Cys Gly Ile Val

275 280 285

Ile Gly Ala Met Ala Val Ala Gln Leu Phe Ser Ser Val Tyr Phe Ser

290 295 300

Ala Trp Ser Asn Arg Ser Tyr Phe Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Ile

305 310 315 320

Val Leu Phe Leu Gly Asn Ile Leu Tyr Ala Leu Ala Tyr Asp Ala His

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Ser Ile Trp Ile Leu Leu Ile Gly Arg Leu Phe Cys Gly Leu Gly Ser

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Ala Arg Ala Val Asn Arg Arg Tyr Ile Ser Asp Cys Val Pro Leu Lys

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Ile Arg Met Gln Ala Ser Ala Gly Phe Val Ser Ala Ser Ala Leu Gly

370 375 380

Met Ala Cys Gly Pro Ala Leu Ala Gly Ile Leu Gln Ile Asn Phe Lys

385 390 395 400

Ile His Lys Val Thr Phe Asn Gln Asn Thr Leu Pro Gly Trp Val Met

405 410 415

Ala Ile Ala Trp Leu Val Tyr Leu Val Trp Leu Trp Ile Thr Phe Lys

420 425 430

Glu Pro Ser His Phe Val Glu Glu Asp His Thr Pro Gln Gln Ser Asn

435 440 445

Asn Val Asp Asn Ser Ser Leu Glu Lys Gly Leu Gln Gln Pro Leu Leu

450 455 460

Ile Ser Ser Ser Glu Asp Lys Val Asp Glu Asp Gly Asp Gln Asp Tyr

465 470 475 480

Asp Asp Ser Glu Glu Ala Pro Glu Glu Ser Arg Leu Pro Ala Asn Ser

485 490 495

Ile Gly Glu Ala Tyr Arg Leu Leu Thr Pro Ser Val Lys Val Gln Leu

500 505 510

Leu Ile Tyr Phe Met Leu Lys Tyr Val Met Glu Ile Leu Leu Ser Glu

515 520 525

Ser Ser Val Val Thr Thr Tyr Tyr Phe Asn Trp Ser Thr Ser Thr Val

530 535 540

Ala Ile Phe Leu Ala Cys Leu Gly Leu Thr Val Leu Pro Val Asn Ile

545 550 555 560

Val Val Gly Asn Tyr Ile Ser Asn Met Phe Glu Asp Arg Gln Ile Leu

565 570 575

Met Thr Ser Glu Ile Met Val Cys Ile Gly Val Leu Leu Ser Phe His

580 585 590

Ile Ile Phe Pro Tyr Thr Glu Pro Gln Tyr Ile Cys Ser Gly Leu Leu

595 600 605

Leu Phe Val Ser Ala Glu Val Leu Glu Gly Val Asn Leu Ser Leu Leu

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Ser Arg Val Met Ser Ser Arg Leu Ser Arg Gly Thr Tyr Asn Gly Gly

625 630 635 640

Leu Leu Ser Thr Glu Ala Gly Thr Ile Ala Arg Val Ile Ala Asp Ala

645 650 655

Thr Ile Thr Leu Ala Gly Phe Leu Gly Glu Ser Arg Leu Leu Asn Val

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Cys Tyr Thr Tyr Asn Ser Leu Phe

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<210> 2

<211> 507

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

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Phe Gly Val Gly Tyr Trp Gly Asn Ile His Asn Phe Tyr Tyr Tyr Leu

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Val Ile Gln Met Ile Ala Gly Leu Phe Gln Ser Thr Gly Trp Pro Ser

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Val Val Ala Val Leu Gly Lys Trp Phe Gly Lys Lys Lys Arg Gly Leu

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Ile Met Gly Ile Trp Asn Ala His Thr Ser Val Gly Asn Ile Ala Gly

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Ser Leu Ile Ala Ser Ala Met Leu Gly Tyr Gly Trp Gly Trp Ser Phe

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Ile Leu Pro Ile Ser Pro Glu Ser Val Gly Ala Glu Glu Asp Asp Asp

245 250 255

Ser Ser Phe Glu Lys Ser Gly Glu Glu Ala Ser Glu Pro Leu Leu Arg

260 265 270

Asn Glu Thr Pro Asn Glu Glu Lys Glu Lys Ala Val Gly Phe Leu Glu

275 280 285

Ala Trp Arg Ile Pro Gly Val Ala Pro Phe Ala Leu Cys Leu Phe Phe

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Ala Lys Leu Val Ala Tyr Thr Phe Leu Tyr Trp Leu Pro Phe Tyr Val

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Ser His Thr Ala Ile Asp Gly Lys Tyr Leu Ser Ser Glu Thr Ala Gly

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Thr Leu Ser Thr Leu Phe Asp Val Gly Gly Val Leu Gly Gly Ile Leu

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Gly Pro Leu Leu Thr Gly Tyr Ile Ser Ala Lys Ser Trp Ser Ala Val

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<211> 2091

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<213> Artificial sequence

<400> 3

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ataaactaca aaatcatgaa gaaaagggtt aggcaatatg ctcaacaaat taacaatgga 120

acactagatc gacgacatgt actcaaggat ttctcacgga tgttggataa tcagattgag 180

aaaattgtcc tattcctgtt ggaacaacaa gggcttttgg caagcaggat agcaaagctt 240

ggagagcatc aagatgctgt gcagcaggag cctgaaataa acaaaataac tgaactacga 300

gaagcttaca gaacagtggg acaagatcta ttgaagcttc tctattttat agagatcaat 360

gctattggct tgcgtaagat attgaagaag tttgacaaac gctttggcta tagattcact 420

gattactatg tcaaaacccg tgcaaatcat ccttactccc agctgcaaca agtgttcaag 480

catgtgggat taggtgctgt tgtgggagcc ttatctcgca atcttcatga gcttcaggac 540

cgccagggga gctacttatc aatttatgat cagccgtctc ttcctctcca ggatcccgtt 600

gttgattcaa taaatgcagc tgttgatagg ttatccaact caacaaactt ccttaacttt 660

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gacgataata gataccattt tatgtctctt ttgctaaacc ttgcaaatac atttttgtat 780

atggtcaata catatattat tgtacctaca gcagatgatt attcaacgag ccttggggct 840

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ctcttaatcg gtcgcctttt ctgtggattg ggttctgcca gggctgttaa ccggcgttat 1080

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agcgctcttg gaatggcatg tggtcctgca ttagctggca tacttcagat taattttaag 1200

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tcttggaaac ttggagatgg ttggtctcca tttaatggat cagatggaac atctcttctt 300

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cacaaatcgc taaagggaaa ttcacgagca cttgcaactg tcactgctat tatcgacgga 1320

acgggttcta taggagctgc aattggaccg ttattaacag ggtatatatc tgctaaaagt 1380

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