一种通过调节ABCF1进行免疫调节的方法

摘要

本发明涉及免疫调节的方法。具体而言，本发明涉及通过调节ABCF1来调节炎症和免疫反应。ABCF1的调节可能有助于治疗脓毒症、自身免疫性疾病、癌症或感染。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫调节的方法。具体而言，本发明涉及通过调节ABCF1来调节炎症和免疫反应。

背景技术

炎症和免疫反应是严格受控的细胞机制，有助于维持细胞内稳态。这些机制由几个调节下游效应物级联反应的蛋白控制。对这些下游效应物的调节可用于治疗疾病，包括治疗脓毒症、炎症性肠病、克罗恩病和癌症。ABCF1是一种已被证明可调节先天免疫反应的ABC转运蛋白家族的蛋白，是自身免疫性胰腺炎和关节炎的风险基因。与其他ABC家族成员不同，ABCF1缺乏跨膜结构域，似乎不能作为转运蛋白而发挥作用。ABCF1基因位于人类6号染色体和小鼠17号染色体上的主要组织相容性复合体基因座的I类区域。先前的研究表明，ABCF1通过与elF2和核糖体关联参与翻译起始(Garcia-Barrio,M.等人，2000；Marton,M.J.等人，1997；Paytubi,S.等人，2008；Campbell,S.G.等人，2005；Pestova,T.V.等人，2006)。已知ABCF1位于细胞质和核质中，而不存在于核仁中(Paytubi，S.等人，2008)。从类风湿性关节炎患者发炎关节分离的人滑膜细胞中发现ABCF1的基因表达显著升高，当TNF-α刺激时，这种表达进一步增加(Richard,M.等人，1998)。此外，ABCF1基因座与日本人群对自身免疫性胰腺炎的易感性增加有关(Ota,M.等人，2007)，重要的是，ABCF1与欧洲和亚洲人群对类风湿性关节炎的易感性有关。小鼠胚胎成纤维细胞的免疫学研究表明，ABCF1与双链DNA和DNA传感成分HMGB1和IFI204结合，并进一步与SET复合物成员(SET、ANP32A和HMGB2)相互作用，以促进细胞溶质DNA传感机制。

ABCF1(+/-)小鼠在特定的无病原体条件下表现正常。对这些小鼠的研究表明，ABCF1起到了充当TLR下游炎症途径之间的分子开关的作用(Arora,H.等人，2019)。ABCF1具有E2泛素酶活性，通过靶向K63多聚泛素化的关键蛋白，控制脂多糖-Toll(LPS-Toll)样受体-4(TLR4)介导的革兰氏阴性损伤。ABCF1的K63泛素化将炎症特征从早期MyD88依赖性信号通路转变为晚期TRIF依赖性信号通路，从而调节TLR4内吞作用并调节巨噬细胞从M1期到M2期的极化。生理学上，ABCF1调节从脓毒症炎症期到内毒素耐受期的转变，并通过免疫治疗中介体(mediator)SIRT1调节细胞因子风暴和干扰素β依赖的产生。因此，ABCF1通过抑制低血压引起的肾循环功能障碍来控制脓毒症引起的死亡。此外，ABCF1对于维持巨噬细胞极化处于M2b状态是必要的，ABCF1的缺乏将所述状态转变为促炎性M1状态(Arora,H.等人，2019)

在MyD88通路(M1巨噬细胞样)中，TLR4信号的早期阶段导致UBC13靶向TRAF6进行K63多聚泛素化，进而靶向cIAP1/2进行K63多聚泛素化。然后，cIAP1/2增强ABCF1和TRAF3的K48蛋白酶体降解。在缺乏ABCF1的情况下，TAK1被磷酸化，导致MAPK和NF-KB途径的激活以及促炎细胞因子如TNFα、IL-1β、IL-6的产生增加，从而将巨噬细胞极化为M1表型。随后在TRIF途径(M2巨噬细胞样)中，cIAP1/2的自身K48蛋白酶体降解造成ABCF1被TRAF6促成的K63多聚泛素化，导致ABCF1与TRAF3和SYK结合并形成复合物，从而形成K63多聚泛素化的TRAF3和SYK。这导致TLR4内吞进入内体，然后启动TRIF依赖的TLR4信号，并最终产生IFN-I刺激的基因。这会触发TBK1的磷酸化，从而导致IRF3的磷酸化和最终二聚化，并产生IFN-I刺激的基因。这种ABCF1引起的MyD88向TRIF信号转变导致IL-10的产生增加，TNFα、IL-1β、IL-6以及CD86、MHC-II表面标志物的产生减少，CD206水平降低，从而使巨噬细胞分化为M2b表型。

免疫反应失调和炎症与许多疾病有关，因此需要调节免疫反应和炎症。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过调节ABCF1进行免疫调节的方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种抑制有需要的患者的炎症反应和/或免疫反应的方法，所述方法包括施用ABCF1激动剂。

根据本发明的另一方面，提供了一种抑制炎症反应和/或免疫反应的方法，所述方法包括施用ABCF1蛋白或编码ABCF1的多核苷酸。在本发明方法的一些实施方案中，所述ABCF1蛋白为可溶性ABCF1蛋白。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸为载体，任选地为病毒载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种预防和/或治疗脓毒症的方法，所述方法包括施用ABCF1激动剂。

根据本发明的另一方面，提供了一种预防和/或治疗脓毒症的方法，所述方法包括施用ABCF1蛋白或编码ABCF1的多核苷酸。在本发明方法的一些实施方案中，所述ABCF1蛋白为可溶性ABCF1蛋白。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸为载体，任选地为病毒载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括施用ABCF1激动剂。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括施用ABCF1蛋白或编码ABCF1的多核苷酸。在本发明方法的一些实施方案中，所述ABCF1蛋白为可溶性ABCF1蛋白。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸为载体，任选地为病毒载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种测定与炎症反应和/或免疫反应增加或减少相关的疾病和/或紊乱的临床结局的方法，所述方法包括测定ABCF1的表达。

根据本发明的另一方面，提供了ABCF1激动剂在减少对其有需要的患者的炎症反应和/或免疫反应中的应用。

根据本发明的另一方面，提供了一种抑制炎症反应和/或免疫反应的方法，所述方法包括施用ABCF1蛋白或编码ABCF1的多核苷酸。在本发明方法的一些实施方案中，ABCF1蛋白可溶性ABCF1蛋白。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸为载体，任选地为病毒载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种预防和/或治疗脓毒症的方法，所述方法包括施用ABCF1激动剂。

根据本发明的另一方面，提供了一种预防和/或治疗脓毒症的方法，所述方法包括施用ABCF1蛋白或编码ABCF1的多核苷酸。在本发明方法的一些实施方案中，所述ABCF1蛋白为可溶性ABCF1蛋白。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸为载体，任选地为病毒载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括施用ABCF1激动剂。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括施用ABCF1蛋白或编码ABCF1的多核苷酸。在本发明方法的一些实施方案中，所述ABCF1蛋白是一种可溶性ABCF1蛋白。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸为载体，任选地为病毒载体。

根据本发明的另一方面，提供了一种测定与炎症反应和/或免疫反应增加或减少相关的疾病和/或紊乱的临床结局的方法，所述方法包括测定ABCF1的表达。

根据本发明的另一方面，提供了一种通过调节ABCF1的活性或表达来调节免疫反应的方法。

根据本发明的另一方面，提供了一种通过抑制ABCF1的表达或活性来刺激免疫反应的方法。在一些实施方案中，所述免疫反应是抗癌或抗病原体免疫反应，可选地所述病原体是病毒或细菌病原体。

在本发明的一些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫性疾病患者，所述自身免疫性疾病包括炎症性肠病，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎或胰腺炎。

附图说明

以下参考附图的详细描述，本发明的这些特征和其他特征将变得更加明显。

图1示出了ABCF1在TLR2和TLR9信号中负调节促炎细胞因子，在TLR5信号中正调节抗炎细胞因子。简而言之，骨髓源性巨噬细胞(BMDM)用Abcf1 siRNA处理，并采用：A)TLR2激动剂肽聚糖(100ng/ml)、B)TLR9激动剂CpG DNA(5μM)、C)TLR5激动剂鞭毛蛋白(100ng/ml)刺激24小时。热图显示了在细胞培养上清液中存在和不存在激动剂时各种细胞因子的倍数变化。

图2示出了聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后，ABCF1对ISG特异性细胞因子、转录因子产生和IRF3二聚化是必需的。A)评估过表达ABCF1的BMDM(Over Exp.)或在存在和不存在聚肌胞苷酸(10μg/ml)的情况下用特异性siRNA处理24小时的BMDM。热图显示了细胞培养上清液中各种细胞因子和趋化因子的倍数变化。B)热图显示了Abcf1 siRNA处理和聚肌胞苷酸刺激的BMDM全细胞裂解物(WCL)中各种MAPK和ISG特异性磷蛋白和转录因子的倍数变化。C)通过免疫印迹(IB)分析在存在和不存在聚肌胞苷酸的情况下用Abcf1特异性siRNA处理的BMDM细胞质和细胞核部分，确定TLR3信号转导中涉及的转录因子的水平。D)用天然PAGE凝胶分离了WCL，并分析了IRF3二聚化。

图3示出了ABCF1与OAS1a关联并控制OAS1a的活性。A)BMDM用聚肌胞苷酸(10μg/ml)处理24小时，WCL用抗ABCF1抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物用抗ABCF1和抗OAS1a抗体进行免疫印迹。B)ABCF1在BMDM中过表达(Over Exp.)，WCL用抗ABCF1抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀物用抗ABCF1抗体和抗OAS1a抗体进行免疫印迹。C)在存在或不存在聚肌胞苷酸的情况下，从Abcf1 siRNA处理的BMDM的WCL中分析OAS1a、ABCF1和核糖核酸酶L(RNaseL)的蛋白水平。D)在存在和不存在2'5'a的情况下，测定了乱序的(scrambled)和Abcf1 siRNA处理的BMDM中焦磷酸盐产量的增加(2'5'a活性的读数)。

图4提供了ABCF1如何通过OAS1a、TLR3和JAK-STAT信号调节双链RNA(dsRNA)感染的模型。简言之，在dsRNA感染后，细胞内会触发几个信号级联以消除感染。首先产生的抗病毒蛋白之一是OAS1a。ABCF1以ATP依赖的方式与OAS1a结合并与dsRNA关联。这种结合导致2'5'A的产生，2'5'A结合并RNaseL，RNaseL降解病毒RNA。TLR3也可以检测到内体中的dsRNA。一旦激活，TLR3会导致IRF3的磷酸化和二聚化，并将其转运至细胞核。IRF3导致IFNβ和其他促炎细胞因子的产生，这一步骤由ABCF1调节。IFNβ通过激活JAK-STAT通路导致正反馈环路的产生。发现ABCF1在ST的2、3和6磷酸化时是必需的，这导致甚至更高水平的IFNβ，因此有助于清除病毒感染。

图5示出了在LPS刺激后，ABCF1正调节抗炎细胞因子和ISG特异性转录因子，负调节MAPK。A)ABCF1在BMDM中过表达(OverExp.)，或者BMDM在LPS(100ng/ml)存在和不存在的情况下用特异性siRNA处理24小时。细胞培养上清液中各种细胞因子和趋化因子倍数化的热图。B)Abcf1 siRNA和LPS处理的BMDM的WCL中各种MAPK和ISG特异性磷蛋白和转录因子的倍数变化热图。

图6示出了ABCF1对于FcgR II A介导的吞噬作用是必需的。A)在存在和不存在LPS的情况下，Abcf1 siRNA处理的BMDM与荧光标记IgG包被的乳胶珠孵育2小时，或Abcf1siRNA处理的BMDM与荧光标记的大肠杆菌孵育2小时，测定吞噬作用的吸光度值。B)用流式细胞术分析BMDM处理后的CD32水平。柱状图表示平均荧光强度(MFI)的变化，误差棒表示标准差。C)在LPS存在和不存在的情况下，ABCF1在BMDM中过表达。WCL用抗CD32抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物用抗CD32和抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹。D)热图显示Abcf1 siRNA处理和LPS刺激BMDM后WCL中SFK磷酸化水平的倍数变化。

图7提供了ABCF1如何调节FcγR II a介导的吞噬作用的一个模型。简言之，经发现，ABCF1对于SRC、LYN或FGR将ITAM磷酸化，从而启动FcγR介导的大肠杆菌颗粒的吞噬作用是至关重要的。ABCF1随后靶向SYK进行K63连接的多聚泛素化，接着发生SFK介导的SYK磷酸化。SYK的磷酸化导致下游的PLCγ2、FYN和其他SFK的磷酸化，从而导致肌动蛋白聚合和吞噬杯的形成。下游级联导致ABCF1依赖的STAT2、3和6磷酸化水平升高，从而增加抗炎细胞因子的产生。

图8示出了ABCF1在TLR4介导的LPS信号中使巨噬细胞极化为M2b状态。在有和无LPS(100ng/ml，持续30分钟)的情况下，ABCF1在BMDM中过表达(Over Exp.)或被特异性siRNA敲低(knocked down)。A)用LPS刺激经处理的BMDM，并通过流式细胞术分析M1(CD86和MHC-II)和M2a(CD206)特异性表面标志物。图表表示了平均荧光强度(MFI)的变化，误差棒表示标准差。B)细胞培养上清液中各种细胞因子和趋化因子倍数变化的热图。C)全细胞裂解物(WCL)通过天然PAGE凝胶分离并分析IRF3二聚化。

图9示出了ABCF1是巨噬细胞极化为M2b表型所必需的。ABCF1或在BMDM中过表达，或在LPS存在和不存在的情况下用特异性siRNA进行处理(100ng/ml，持续30分钟)。A)通过免疫印迹法分析参与巨噬细胞极化的转录因子水平。用调节蛋白、激酶和转录因子对B)在存在和不存在LPS的情况下用Abcf1特异性siRNA处理的BMDM的WCL以及C)在存在和不存在LPS的情况下ABCF1过表达的BMDM的WCL进行免疫印迹。

图10示出了ABCF1负调节MyD88依赖性信号传导和细胞焦亡(pyroptosis)，是BMDM中TRIF依赖性信号传导所必需的。简而言之，在LPS(100ng/ml)存在或不存在的情况下刺激Abcf1 siRNA处理的BMDM 30分钟，并测定WCL中的磷蛋白水平。A)各种MAPK和ISG特异性磷蛋白和转录因子倍数变化的热图，B)细胞存活特异性磷蛋白倍数变化的热图。

图11示出了ABCF1是一种新的IV类E2泛素结合酶，对647位半胱氨酸残基的反应进行催化。A)使用Clustal Omega软件，将小鼠ABCF1蛋白序列与其他已知小鼠E2结合酶的UBC结构域保守区域进行比对。B)ABCF1具有E2泛素结合活性。ABCF1从WCL中免疫沉淀，并在存在或不存在还原剂DTT的情况下，通过添加E1激活酶和泛素进行体外泛素化试验。ABCF1似乎通过647位的半胱氨酸催化泛素结合。C)根据基因结构，ABCF1看起来是一种IV类E2结合酶。

图12示出了ABCF1的泛素化活性是TLR4内吞所必需的。通过流式细胞术分析BMDM中TLR4的内吞作用A)不同LPS浓度刺激30分钟后。B)不同时间点用10ng/ml浓度的LPS刺激。C)将LPS(100ng/ml)刺激的BMDM处理30分钟。D)野生型(WT)和Abcf1+/-小鼠均经腹腔(i.p.)注射50μg LPS，在不同时间点后，对小鼠实施安乐死并采集脾脏。使用流式细胞术(每组9只小鼠)测定CD1 b+巨噬细胞上TLR4的表面表达。图表示MFI的百分比变化。误差棒表示标准差。

图13示出了ABCF1多聚泛素化状态的变化使TLR4内吞作用成为可能，从MyD88依赖性信号转变为TRIF依赖性信号就可以看出。A)在不同时间点用LPS(100ng/ml)刺激BMDM，然后用抗ABCF1抗体免疫沉淀WCL，并用抗多聚泛素抗体免疫印迹。ABCF1的K63多聚泛素化代表ABCF1的激活，而ABCF1的K48多聚泛素化代表蛋白酶体降解。B)用不同浓度的LPS(0～1000ng/ml)刺激BMDM 30分钟，然后用抗ABCF1抗体免疫沉淀WCL，并用抗多泛素抗体进行免疫印迹。C)cIAP1/2 K48将ABCF1多聚泛素化。BMDM用SMAC模拟物(SM)处理，在有或无Dynasore(发动蛋白抑制剂)的情况下降解cIAP1/2，并用LPS(100ng/ml)刺激30分钟。然后用抗ABCF1抗体免疫沉淀WCL，并用抗多泛素抗体进行免疫印迹。D)TNF受体相关因子6(TRAF6)K63将ABCF1多聚泛素化。BMDM转染含有Flag标记的Traf6、HA标记的WT泛素、K48泛素、K63泛素和GFP标记的Abcf1的质粒。用相应的抗体印迹WCL以检测过表达的程度，并用抗GFP抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀用抗HA抗体进行免疫印迹分析。

图14示出了ABCF1水平在TLR4信号的早期阶段受到cIAP1/2的负调节，而ABCF1与SYK、TRAF6和TRAF3形成复合物，并在BMDM的TLR4信号的晚期阶段负调节SYK和PLCγ2磷酸化水平。A)BMDM在LPS(100ng/ml)存在和不存在的情况下用cIAP1/2 siRNA处理30分钟，并对抗ABCF1抗体、抗TAK1抗体、抗磷酸化TAK1抗体和抗cIAP1/2抗体进行免疫印迹。B)BMDM用LPS(100ng/ml)处理30分钟，WCL用抗ABCF1抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物用抗ABCF1、抗SYK、抗TRAF6和抗TRAF3抗体进行免疫印迹。C)SYK在BMDM中过表达(Over Exp.)，WCL用抗SYK抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀物用抗ABCF1抗体和抗SYK抗体进行免疫印迹。D)TRAF3在BMDM中过表达，WCL用抗TRAF3抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀物用抗ABCF1抗体和抗TRAF3抗体进行免疫印迹。E)在存在或不存在LPS的情况下，Abcf1 siRNA处理的BMDM中p-SYK和p-PLCg2的蛋白分析。

图15示出了ABCF1是一种K63特异性E2结合酶，靶向SYK和TRAF3进行K63多聚泛素化，从而调节TLR4早期和晚期通路。A)ABCF1以SYK为靶点进行K63多聚泛素化。BMDM用含有Myc标记的Syk、HA标记的WT泛素、K48泛素、K63泛素、GFP标记的Abcf1\NT和/或Abcf1C647S的质粒转染。WCL用抗MYC免疫沉淀，免疫沉淀物用抗SYK抗体和抗HA抗体进行免疫印迹。B)ABCF1靶向TRAF3使K63多聚泛素化。用Myc标记的Traf3和上述质粒转染BMDM。WCL用抗MYC进行免疫沉淀，免疫沉淀物用抗TRAF3和抗HA抗体进行免疫印迹。C)ABCF1-TRAF3复合物与TRIF的结合是TRAF3泛素化所必需的。在LPS存在或不存在的情况下用TrifsiRNA处理BMDM，并用抗TRIF、抗p-TBK1和抗TBK1对WCL进行免疫印迹。WCL用抗ABCF1进行免疫沉淀。免疫沉淀物用抗TRAF3和抗ABCF1进行免疫印迹。

图16提供了ABCF1如何调节巨噬细胞中TLR4内吞的模型。cIAP1/2以ABCF1为靶点进行K48介导的蛋白酶体降解，从而反向调节早期TLR4介导的MyD88信号。cIAP1/2的自身K48蛋白酶体降解触发晚期TLR4信号的开始。cIAP1/2的降解导致TRAF6激活ABCF1并使其K63多聚泛素化。然后ABCF1与TRAF6和SYK形成复合物，并以环状结构域的方式靶向SYK进行K63多聚泛素化。这导致SYK和随后的PLCg2磷酸化，从而导致TLR4内吞和TRIF依赖性信号的激活。ABCF1还与TRAF3和TRIF形成复合物，以环状结构域的方式靶向TRAF3进行TRIF依赖的K63多聚泛素化，从而调节IRF3磷酸化和二聚化，由此使巨噬细胞极化为M2b表型。

图17示出了ABCF1对于脓毒症期间从SIRS到ET期的TRIF依赖性转变是必要的。A)Abcf1Het-ETT小鼠产生更多促炎细胞因子，并恢复到SIRS期。血清是从WT和Abcf1+/-小鼠的全血中分离出来的，这两种小鼠均接受NETT或ETT处理。热图表示小鼠血清中细胞因子和趋化因子的倍数变化。B)当使用NETT或ETT处理时，Abcf1+/-小鼠比WT小鼠更早地死亡。第二次LPS注射后，检查各组n＝9只小鼠的存活率直到96小时，p值<0.001。C)分析来自NETT或ETT小鼠的BMDMWCL中的调节蛋白、磷酸化蛋白和半胱天冬酶的表达。D)ABCF1对于ET期TRAF3的K63多聚泛素化是必需的。BMDM WCL用抗TRAF3进行免疫印迹，然后用抗TRAF3进行免疫沉淀。免疫沉淀物用抗TRAF3抗体和多泛素抗体进行免疫印迹。E)BMDM的WCL通过天然PAGE凝胶分离，并进行IRF3二聚化分析。第二次注射LPS3小时后对所有细胞因子和蛋白进行分析。

图18示出了ABCF1对于脓毒症期间从SIRS到ET期的TRIF依赖性转变和细胞凋亡是必需的。对BMDM中磷蛋白水平进行分析。从NETT或ETT小鼠中分离BMDM并制备WCL。A)BMDM中MAPK和ISG特异性磷蛋白和转录因子水平的倍数变化的热图。B)细胞存活蛋白和各种Src家族激酶磷酸化水平的折叠变化的热图。C)通过对来自Abcf1 siRNA处理和LPS刺激的BMDM的WCL进行免疫印迹分析，检测细胞焦亡特异性蛋白水平。

图19证明了ETT-Abcf1+/-小鼠恢复到SIRS脓毒症阶段，并因肾循环衰竭死亡。第二次注射LPS3小时后，灌注并处死ETT-WT和ETT-Abcf1+/-小鼠。肾组织在4％多聚甲醛中固定24小时，在PBS中洗涤并包埋在石蜡中。切下5μm厚的切片，并用苏木精和伊红(HE)染色。在Olympus BX51显微镜下观察载玻片，并使用Olympus cellSens软件拍摄图像。黑色箭头表示红细胞沉淀的区域。

图20示出了ABCF1在LPS刺激下使巨噬细胞极化至M2状态。在存在或不存在LPS(100ng/ml-30分钟)的情况下，在BMDM中用siRNA沉默ABCF1。A)用LPS刺激处理后的BMDM并进行分析。柱状图表示平均荧光强度(MFI)，误差棒表示平均值±标准差，显示p值。B)BMDM细胞培养上清液中各种细胞因子和趋化因子倍数变化的热图，p值<0.01。C)全细胞裂解物(WCL)通过天然PAGE凝胶分离，并分析IRF3二聚化。D)用氯化钴CoCl

图21示出了ABCF1是一种IV类E2泛素结合酶，其活性严格依赖647位的半胱氨酸残基。A)将小鼠ABCF1的UBC结构域的蛋白序列与已知小鼠E2结合酶的UBC结构域序列比对。B)在体外泛素化试验中，在辅因子和DTT存在和不存在情况下培养重组蛋白，并对反应进行免疫印迹。C)用BMDM(转染了Abcf1 WT或Abcf1 C647S过表达构建物)WCL免疫沉淀的ABCF1进行(B)中所述的体外泛素化分析。在转染Abcf1 C647S之前，用特异性siRNA沉默内源性ABCF1表达。反应按B)进行分析。D)用BMDM WCL免疫沉淀的ABCF1进行(C)中所述的体外泛素化测定，并用与FL4结合的ABCF1抗体和与FL1结合的泛素抗体进行免疫印迹反应。E)显示了各种类别的E2酶N端和C端的突出端(overhang)。

图22示出了ABCF1多聚泛素化状态的变化与TLR4内吞有关。在存在或不存在LPS(100ng/ml，持续30分钟)的情况下刺激经Abcf1 siRNA处理的BMDM，并测定WCL中磷酸化蛋白的表达。A)各种MAPK和ISG磷酸蛋白和转录因子倍数变化的热图，p值<0.01。B)与细胞存活相关的磷酸化蛋白的倍数变化的热图，p值<0.01。C)在指定的时间间隔内用LPS刺激BMDM，然后将细胞裂解，用ABCF1抗体将WCL免疫沉淀，然后进行免疫印迹。D)用不同浓度的LPS刺激BMDM 30分钟，然后如(C)所述测定ABCF1的多聚泛素化物是否存在。

图23示出了ABCF1的多聚泛素化状态受cIAP1/2和TRAF6调节。A)在LPS存在或不存在的情况下，用SMAC模拟物(100nM)和/或Dynasore(80μM)处理BMDM。然后分析细胞中是否存在多聚泛素化的ABCF1，并用ABCF1抗体对WCL进行免疫印迹。B)BMDM与指定的结构组合共转染。将细胞裂解，用GFP抗体将WCL免疫沉淀，然后进行免疫印迹。C)BMDM与指定的结构组合共转染。裂解细胞，用MYC抗体对WCL进行免疫沉淀(IP)，然后进行免疫印迹。

图24示出了ABCF1靶向TRAF3进行K63多聚泛素化。A)BMDM与指定的结构组合共转染，并按图23C中所述进行处理。B)用ABCF1抗体将WCL免疫沉淀，并在存在和不存在LPS的情况下对Trif siRNA处理的BMDM的WCL进行免疫印迹。

图25示出了ABCF1靶向TRAF3进行K63多聚泛素化，并控制脓毒症期间SIRS到ET的时期转变。A)热图表示各种血清细胞因子和趋化因子的倍数变化，p值<0.01。B)在第二次LPS注射后，监测经NETT和ETT处理的WT和Abcf1+/-小鼠的存活百分比直到96小时，每组n＝9只小鼠，p值<0.001。C)分析NETT和ETT小鼠BMDM的WCL中的调节蛋白、磷酸化蛋白和半胱天冬酶的表达。D)用TRAF3抗体将BMDM的WCL进行免疫沉淀。免疫沉淀物用TRAF3和多泛素抗体进行免疫印迹。E)BMDM的WCL通过天然PAGE凝胶分离，并分析IRF3二聚化。第二次注射LPS3小时后对所有细胞因子和蛋白进行分析。

图26示出了低血压诱导的肾衰竭导致Abcf1+/-小鼠死亡率增加。A)通过免疫印迹分析经ETT和NETT处理的WT和Abcf1+/-小鼠的BMDM细胞质和细胞核部分。B)NETT和ETT小鼠BMDM制备的WCL中的MAPK-和ISG-特异性磷酸蛋白和转录因子表达倍数变化的热图，p值<0.01。通过ELISA测定的经ETT和NETT处理的WT和Abcf1+/-小鼠的C)降钙素原、D)L-乳酸盐、E)肌酐的血清表达。

图27与图20相关，示出了ABCF1调节巨噬细胞极化至TRIF依赖的M2表型。简而言之，在存在或不存在各种TLR激动剂的情况下，ABCF1在BMDM中被特异性siRNA沉默。A)TLR2激动剂肽聚糖(100ng/ml，刺激24小时)、TLR9激动剂CpG DNA(5μM)刺激24小时和TLR3激动剂聚肌胞苷酸(10μg/ml)刺激24小时后BMDM细胞培养上清液中各种细胞因子和趋化因子倍数变化的热图，p值<0.01。生成热图，并按照材料和方法中的说明进行倍数变化的计算。在存在或不存在LPS(100ng/ml)的情况下，在BMDMs中用特异性siRNA沉默ABCF1 30分钟，B)通过免疫印迹分析细胞质和细胞核部分，测定参与巨噬细胞极化的指定转录因子的表达和磷酸化。C)在LPS存在或不存在的情况下，用Abcf1特异性siRNA处理BMDM的WCL，并在LPS存在或不存在的情况下，用特异性抗体对ABCF1过表达BMDM的WCL进行免疫印迹，检测调节蛋白、激酶和转录因子的表达。E)用重组TNFα(10ng/ml)处理BMDM24小时，重组IL-1β(10ng/ml)处理24小时，重组IL-10(50ng/ml)处理24小时，重组IFNβ(10000IU/50μl)处理24小时，制备全细胞裂解物并用ABCF1抗体进行免疫印迹。

图28与图20、22和24相关。ABCF1是TLR4内吞所必需的。通过流式细胞术分析BMDM中的TLR4内吞。A)用不同LPS浓度刺激30分钟。B)用10ng/ml浓度的LPS刺激不同时间点。C)用LPS(100ng/ml)刺激处理后的BMDM 30分钟，D)不使用LPS刺激。E)WT和Abcf1+/-小鼠均经腹腔(i.p.)注射50μg LPS，并在不同时间点后，对小鼠实施安乐死并采集脾脏。使用流式细胞术(每组9只小鼠)测定CD11b+和F4/80+脾巨噬细胞上TLR4的表面表达。柱状图表示平均荧光强度(MFI)，误差棒表示标准差，显示p值。

图29与图22、23和24相关，示出了在LPS-TLR4信号传导过程中，ABCF1与SYK、TRAF6和TRAF3形成复合物。a)在有或无LPS(100ng/ml)的情况下，用cIAP1/2特异性siRNA处理BMDM 30分钟。将细胞裂解，用ABCF1、TAK1、p-TAK1和cIAP1/2抗体对WCL进行免疫印迹。B)用LPS(100ng/ml)刺激BMDM 30分钟，用抗ABCF1和抗IgG抗体将WCL进行免疫沉淀。免疫沉淀物用ABCF1、SYK、TRAF6、TRIF和TRAF3抗体进行免疫印迹。C)SYK在BMDM中过表达(过表达)，WCL用SYK抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀物用抗ABCF1和SYK抗体进行免疫印迹。D)TRAF3在BMDM中过表达，WCL用TRAF3抗体进行免疫沉淀，免疫沉淀物用ABCF1和TRAF3抗体进行免疫印迹。E)在存在或不存在LPS的情况下，Abcf1 siRNA处理的BMDM中p-SYK和p-PLCγ2的蛋白分析。

图30与图25和26相关，示出了ABCF1对于脓毒症期间从SIRS到ET期的TRIF依赖性转变和细胞凋亡是必需的。A)对ETT和NETT处理的WT和Abcf1+/-小鼠的脾巨噬细胞进行A20和TAK1磷酸化分析。B)用ABCF1抗体和IRF3抗体对未处理的WT、Abcf1+/-和脓毒症诱导的小鼠在死亡后不同时间点的BMDM WCL进行免疫印迹。C)细胞存活蛋白和各种Src家族激酶磷酸化倍数变化的热图，这些蛋白和激酶来自NETT和ETT小鼠的BMDM制备的WCL，p值<0.01。生成热图，并按照材料和方法中的说明进行倍数变化的计算。D)通过经LPS(100ng/ml，持续30分钟)刺激的Abcf1 siRNA处理的BMDM的WCL进行免疫印迹分析，检测与凋亡相关蛋白(CASP-3)和细胞焦亡相关蛋白(CASP-1，NLRP3，ASC)的表达。E)第二次注射LPS 3小时后，灌注ETT、NETT WT和Abcf1+/-小鼠并处死。肾组织在4％多聚甲醛中固定24小时，在PBS中洗涤并包埋在石蜡中。切下5μm厚的切片，并用苏木精和伊红(HE)染色。在Olympus BX51显微镜下观察载玻片，并使用Olympus cellSens软件拍摄图像。比例尺20pm。黑色箭头表示红细胞沉淀的区域。

图31与图25和26相关，示出了骨髓细胞中脓毒症诱导的发病机制是ABCF1依赖的。A)所有受体小鼠的骨髓移植效率均大于95％。外周血细胞的代表性流式细胞图描绘了供体和受体小鼠在骨髓移植前和骨髓移植后8周的骨髓移植(BMT)CD45.1与CD45.2状态。B)热图表示未经处理的WT、Het和骨髓移植小鼠的各种血清细胞因子和趋化因子的倍数变化，p值<0.01。生成热图，并按照材料和方法中的说明进行倍数变化的计算。C)在第二次LPS注射后，对NETT和ETT处理的骨髓移植小鼠的存活百分比进行监测直到96小时，每组n＝10只小鼠，p值<0.001。采用ELISA法检测的经ETT和NETT处理的骨髓移植小鼠血清中D)降钙素原、E)L-乳酸、F)肌酐的表达。

具体实施方案

本发明基于以下发现：ABCF1是一种E2泛素结合酶，通过靶向关键炎症通路蛋白进行多聚泛素化，作为天然免疫调节剂而发挥作用。研究还发现，ABCF1在控制促炎细胞因子的产生以及脓毒症从全身炎症反应(SIRS)阶段向内毒素耐受(ET)阶段的转变中发挥作用。鉴于这种活性和参与，本发明提供了通过调节ABCF1的活性和/或表达来调节炎症反应和/或免疫反应的方法和组合物。本领域技术人员应容易理解，根据特定疾病或状况，刺激或抑制炎症反应和/或免疫反应可能是可取的。例如，抑制炎症反应和/或免疫反应可用于预防和/或治疗炎症或自身免疫疾病或紊乱，而刺激免疫反应可用于预防和/或治疗感染和/或癌症。因此，本发明提供了用于治疗疾病和紊乱的ABCF1拮抗剂和激动剂。

在某些实施方案中，提供了一种通过抑制ABCF1的表达和/或活性来刺激炎症反应和/或免疫反应的方法。抑制诸如ABCF1的目标多肽的表达和/或活性的方法的非限制性示例包括施用拮抗剂，包括但不限于小分子，针对目标多肽和核酸(如反义寡核苷酸或siRNA，其靶向编码ABCF1的核酸)的抗体。

在某些实施方案中，通过抑制ABCF1来刺激免疫反应可用于治疗癌症和/或治疗对病原体免疫反应的刺激。病原体包括但不限于病毒和细菌。

在某些实施方案中，提供了一种通过上调ABCF1的表达和/或活性来抑制炎症反应和/或免疫反应的方法。增强目标多肽(例如ABCF1)的表达和/或活性的方法的非限制性示例包括施用目标多肽，施用编码所述目标多肽的核酸或载体，或施用增强所述目标多肽表达的一个或多个分子。本领域已知的合适载体，包括但不限于腺病毒载体。艾司西酞普兰(Escitalopram)是已知的ABCF1通路增强子。

在某些实施方案中，提供了一种通过刺激ABCF1的表达和/或活性来预防和/或治疗脓毒症的方法。在某些实施方案中，提供了一种通过刺激ABCF1的表达和/或活性来治疗炎症或自身免疫疾病的方法。这些疾病包括但不限于炎症性肠病(包括但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎)、关节炎(包括但不限于自身免疫性关节炎如类风湿性关节炎)、多发性硬化、胰腺炎和糖尿病。

此前，已经确定ABCF1对吞噬功能具有外在调节作用。因此，在某些实施方案中，ABCF1的可溶性形式用于调节吞噬作用。在某些实施方案中，可溶性ABCF1是吞噬配体。在某些实施方案中，可溶性ABCF1促进凋亡细胞的吞噬作用。

在某些实施方案中，提供了可溶性ABCF1。可溶性ABCF1可用于治疗疾病。在某些实施方案中，可溶性ABCF1用于调节炎症反应和/或免疫反应。在某些实施方案中，可溶性ABCF1充当激动剂。在ABCF1作为激动剂的此类实施方案中，可溶性ABCF1可用于治疗需要抑制炎症反应和/或免疫反应的疾病。例如，此类疾病包括脓毒症和自身免疫性疾病。在某些实施方案中，可溶性ABCF1充当拮抗剂。在ABCF1作为拮抗剂的此类实施方案中，可溶性ABCF1可用于治疗需要刺激炎症反应和/或免疫反应的疾病。

ABCF1可用作生物标志物。本领域已知ABCF1蛋白和核酸序列(基因组和cDNA)。例如，参见GenBank登录号AQY76226.1、AQY76225.1、KY500135.1和KY500134.1。本领域已知测定包括mRNA的基因表达和蛋白表达的方法。在某些实施方案中，ABCF1的表达降低对炎症反应和/或免疫反应有指示作用。在某些实施方案中，ABCF1的表达增加表明炎症反应和/或免疫反应降低。因此，ABCF1表达可作为与炎症反应和/或免疫反应增加或减少相关的疾病或紊乱的生物标志物。ABCF1表达可用于确定与炎症反应和/或免疫反应增加或减少相关的疾病和/或紊乱的临床结局。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种通过测定包括Abcf1的一个或多个基因的表达来确定与炎症反应和/或免疫反应增加或减少相关疾病和/或紊乱的临床结局的方法。

ABCF1可作为与感染、自身免疫性疾病、炎症性疾病和/或癌症相关的炎症反应和/或免疫反应的生物标志物。ABCF1也可用作癌症的生物标志物。具体而言，本领域已知，通过直接靶向ABCF1，microRNA-23a表达升高增强了具有微卫星不稳定性的结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的化学耐药性(Li等人，Current Protein and Peptide Science 16(4):301-309)。众所周知，ABC转运蛋白基因在前列腺癌中表达下调(Demidenko等人，BMCCancer.2015；15:683)。

在某些实施方案中，ABCF1用作脓毒症期间炎症的生物标志物以及任选地用作细胞存活的生物标志物。在某些实施方案中，ABCF1为可溶性ABCF1。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种通过测定包括Abcf1的一个或多个基因的表达来确定脓毒症患者临床结局的方法。

在某些实施方案中，ABCF1用作生物标志物以确定炎症性肠病(包括但不限于克罗恩病和溃疡性结肠炎)的临床结局。

在某些实施方案中，提供了利用ABCF1的生物测定筛选来鉴别新药。例如，筛选可用于识别调节免疫反应(包括抗病原体或抗癌免疫反应)、减轻炎症、治疗自身免疫性疾病的药物。

在某些实施方案中，提供了测定ABCF1表达的方法。此类方法可用于鉴定调节ABCF1表达的药物，因此可用于鉴定药物。在某些实施方案中，将报告基因置于ABCF1启动子的控制下，并测定报告基因产物(定性或定量)。包含ABCF1启动子报告基因产物的细胞，包括但不限于巨噬细胞，如RAW 264.7细胞系，可用于分析以鉴定调节ABCF1表达的试剂。

为了更好地理解本文描述的本发明，给出了以下实施例。应当理解，这些实施例旨在描述本发明的说明性实施方案，而不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：一种新型泛素E2结合酶ABCF1在脓毒症期间反向调节TLR4内吞作用和细胞因子风暴

ABCF1通过TLR2和TLR9对炎症进行反向调节。它与OAS1结合，调节dsRNA病毒切割并控制病毒感染。LPS刺激后，ABCF1调节FcyR II A中的ITAM磷酸化，并调节BMDM中的大肠杆菌吞噬作用。

材料和方法

小鼠和细胞：从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓细胞，并按所述使其成熟为巨噬细胞(Trouplin等人，2016)。如前所述制备Abcf1+/-小鼠(Het)(Wilcox等人，2017)，C57BL/6J(Jackson Laboratories；000664)小鼠用作体内实验的野生型(WT)对照。

转染：细胞中的所有基因敲低均用脂质体

细胞因子分析：制备细胞培养上清液或血清，并将其培养在含有双份打印的不同抗细胞因子抗体的硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜随小鼠细胞因子蛋白组分析芯片试剂盒A板(Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit，Panel A)(R&DSystems；ARY006)提供。如下所述，细胞因子水平用热图表示。

免疫共沉淀：用新制备的20mM Tris-HCI pH 8.0、137mM NaCl、1％Nonidet P-40、2mM EDTA、1X Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(cocktail)(ThermoFisher Scientific；78440)和20mM N-乙基马来酰亚胺(Santa Cruz Biotechnology；sc-202719)裂解2×10

蛋白印迹：如上所述制备细胞裂解物。除非另有说明，否则制备所有免疫共沉淀样品时，样品缓冲液中不含DTT。所有其他蛋白印记样品均在样品缓冲液中用DTT制备。裂解物进行电泳，并用指示抗体进行免疫印迹。

抗体和化学品

用于蛋白印迹和免疫沉淀的抗体、用于蛋白印迹的抗ABCF1抗体(ThermoFisherScientific；PA5-29955)、用于免疫共沉淀的抗ABCF1抗体(Proteintech；13950-1-AP)、抗I-KB抗体(abcam；ab32518)、磷酸化I-KB抗体(abcam；ab12135)、抗NF-KB p65(abcam；ab16502)、抗磷酸化NF-KB p65(abcam；ab86299)、抗切割CASP1抗体(Santa Cruz Biotech；sc-514)、抗切割CASP1抗体(abcam；ab108362)、抗切割CASP3(Cell SignalingTechnology；9661)、抗CASP3抗体(abcam；ab13847)、抗NLRP3抗体(R&D Systems；MAB7578)、抗ASC抗体(Santa Cruz Biotech；sc-514414)、抗TAK1抗体(abcam；ab109526)抗磷酸化TAK1抗体(abcam；ab192443)、抗TBK1抗体(abcam；ab40676)、抗磷酸化TBK1抗体(abcam；ab109272)、抗IRF3抗体(Santa Cruz Biotech；sc-15991)、抗磷酸化IRF3(Cell SignalingTechnology；4947)、抗SYK抗体(Santa Cruz Biotech；sc-1240)、抗磷酸化SYK抗体(abcam；ab58575)、抗PLCγ2抗体(Santa Cruz Biotech；sc-5283)、抗磷酸-PLCγ2抗体(CellSignaling Technology；3871)、抗A20抗体(Santa Cruz Biotech；sc-69980)、抗K48抗体(Cell Signaling Technology；4289)、抗K63抗体(Cell Signaling Technology；5621)、抗TRAF6抗体(Santa Cruz Biotech；sc-8409)、抗cIAP抗体(Santa Cruz Biotech；sc-1869)、抗TRIF抗体(abcam；ab13810)、抗TRAF3抗体(Santa Cruz Biotech；sc-6933)、抗UB抗体(Santa Cruz Biotech；sc-8017)、抗GAPDH抗体(abcam；ab181602)、抗组蛋白H3抗体(abcam；ab8580)、抗GFP抗体(abcam；ab290)、抗MYC抗体(abcam；ab9132)、抗mCherry抗体(ThermoFisher Scientifisher；PA5-34974)抗HA抗体(Santa Cruz Biotech；sc-7392)。用于荧光激活细胞分选术(FACS)抗体：CD86(BioLegend；105011)、CD206(BioLegend；1417097)、MHC-II(BioLegend；141607)、TLR4(BioLegend；145406)、CD1 b(BioLegend；101223)。所用化学品：NP-40(abcam；ab142227)、Smac模拟物(Tocris；5141)、发动蛋白抑制剂I dynosore(Santa Cruz Biotech；sc-202592)、脂多糖(Santa Cruz Biotech；sc-221855)、N-乙基马来酰亚胺(Santa Cruz Biotech；sc-202719)、PMSF溶液(Santa CruzBiotech；sc-482875)和抑肽酶(Santa Cruz Biotech；sc-3595)。

磷酸激酶分析：如上所述制备细胞裂解物。裂解物在包含双份打印抗体的硝酸纤维素膜上孵育，硝酸纤维素膜随人磷酸激酶蛋白组分析芯片试剂盒(R&DSystems；ARY003B)提供。所述试剂盒也可用于小鼠样品，此前已由(O'Hara等人，2016；Chen等人，2010)进行了测试。磷酸激酶水平用热图表示，如下所述。

IRF3二聚化分析：细胞在含有50mM Tris、pH 8.0、1％NP40、150mM NaCl、1mM PMSF和20μg/ml抑肽酶的缓冲液中裂解，并补充天然聚丙烯酰胺样品缓冲液(125MTris、pH6.8和30％甘油)。样品用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，进行免疫印迹分析。

细胞质和细胞核的分级分离：使用上述处理刺激骨髓巨噬细胞，并根据制造商的说明使用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂(Thermo Scientific；78833)进行细胞质和细胞核分离。

体外泛素化测定：如上所述，Abcf1WT和Abcf1C647S表达质粒在巨噬细胞中过表达。在过表达Abcf1C647S表达质粒之前，如上所述，用Abcf1 siRNA处理细胞以消除内源性Abcf1。用冷PBS洗涤Abcf1 siRNA处理的细胞两次，然后过表达Abcf1C647S表达质粒。制备细胞裂解物并与抗ABCF1抗体进行免疫共沉淀。蛋白印记检测过表达和免疫共沉淀的程度。根据制造商的说明，使用泛素化分析试剂盒(abcam；ab139467)对免疫沉淀样品进行泛素化分析。在凝胶上跑样，并用抗ABCF1和抗UB抗体进行印迹。

体内内毒素耐受性：所有的体内实验都得到批准，并按照不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的规定进行。8-10周龄的雌性WT和Abcf1+/-小鼠用0.5mg/kg LPS腹腔注射或无菌生理盐水预处理。24小时后，所有小鼠腹腔注射20mg/kg LPS。前一组有两次注射LPS，称为内毒素处理组(ETT)，后一组有一次注射PBS，一次注射LPS，称为非内毒素处理组(NETT)。第二次注射后3小时，对小鼠实施安乐死(用含3％异氟醚的氧气，然后吸入二氧化碳)，以获取血液和器官，或者每8小时监测一次，持续4天，以确保存活。从血液中分离血清并测定细胞因子。

存活研究：首次注射LPS或PBS后，每天对WT和Abcf1+/-小鼠进行一次监测。第二次注射LPS后，每8小时对小鼠进行一次监测，并根据行为和活动的严重程度、外观、理毛和姿势、呼吸频率、努力程度和模式、直肠温度、疼痛和体重对小鼠进行评分(0-3)。3分被认为是人道终点(被安乐死)，包括：骶髂区无明显脂肪，肌肉质量严重减少，椎骨和髂骨嵴突出。不动，轻推或捡起时不移动；如果把动物放在一边，它就不能直立。毛发竖起(>身体的75％)，外观凌乱，蓬头垢面，伴有其他严重的疾病症状。坐姿和行走时持续严重驼背，对处理无反应。在笼子内或称重时喘息或张口呼吸；呼吸困难，无法走动；大声呼吸(用力呼吸时发出吱吱声)，间隔一小时连续三次测量<33℃，尽管给予镇痛处理但还是有干扰正常功能的持续/连续疼痛迹象，动物无反应，摸起来很冷，皮肤严重损伤(severe skin tent)(>10秒)。

组织学分析：首先通过腹腔注射给予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(高达150mg/kg体重的氯胺酮和15mg/kg体重的甲苯噻嗪)来麻醉小鼠，然后以5ml/min的流速灌注无菌PBS 5分钟，并在第二次LPS注射后3小时处死小鼠。肾、脑和心脏组织在4％多聚甲醛中固定24小时，在PBS中洗涤，并包埋在石蜡中。切下5μm厚的切片，并用苏木精和伊红(HE)染色。使用配备40倍物镜的Olympus BX51显微镜拍摄组织学快照。使用附加的Olympus DP73摄像机和高性能Olympus cellSens软件生成图像。

统计学分析：数据用平均值±标准差表示。通过成对或独立Student t检验对平均值进行比较。P值<0.05被认为是显著的。热图由GraphPad prism软件(GraphPad prism软件，加利福尼亚州圣地亚哥)生成。存活率以Kaplan-Meier曲线表示，差异通过GraphPadprism软件中的时序(log-rank)检验进行评估。图例中提供了每个实验的样本量。

结果

ABCF1在TLR2和TLR9信号中负调节促炎细胞因子，在TLR5信号中正调节抗炎细胞因子：PAMP与TLR结合，导致大量细胞因子和趋化因子的产生。在损伤后，下游效应物反应有助于调节免疫反应并调节多种信号。为了研究ABCF1是否通过调节细胞因子水平来调节TLR信号，通过RNAi将BMDM中的ABCF1敲低，并分析促炎细胞因子和抗炎细胞因子的水平。在用TLR2激动剂肽聚糖刺激Abcf1 siRNA处理的BMDM时，促炎细胞因子如IL-6和TNFα的水平分别显著升高15倍和80倍(图1A)。发现IFNβ水平也被上调了70倍。然而，抗炎细胞因子如IL-2、IL-4、IL-10的水平分别显著下调30倍、20倍和50倍(图1A)。当用TLR9激动剂CpG-DNA刺激Abcf1 siRNA处理的BMDM时，观察到了细胞因子水平的相同趋势。刺激后，IL-6和TNFα分别显著升高30倍和50倍，IL-2、IL-4和IL-10下调50～60倍(图1B)。另一方面，在用TLR5激动剂鞭毛蛋白刺激Abcf1 siRNA处理的BMDM时，IL-6和TNFα水平分别下调10倍和60倍，抗炎细胞因子如IL-4轻微上调5倍，IL-10上调2倍(图1C)。这表明ABCF1通过TLR2和TLR9信号负调节炎症，通过TLR5信号正调节炎症。

在TLR3激动剂聚肌胞苷酸刺激后，ABCF1对于IFN-Ⅰ特异性趋化因子和细胞因子的产生是必需的：I型干扰素(IFN-I)对于宿主防御病毒至关重要。一旦细胞被病毒感染，就会产生大量IFN-I特异性基因，帮助消除病毒感染。为了确定ABCF1是否是这种机制所必需的，我们通过RNAi在BMDM中敲低ABCF1，并研究了各种IFN-I蛋白和转录因子的水平。当用Abcf1siRNA和dsRNA激动剂聚肌胞苷酸处理时，IFN-I蛋白如CCL2、CXCL10、IFNβ的水平下调5至10倍(图2A)。当ABCF1在BMDM中过表达时，这种趋势完全逆转。在ABCF1过表达和聚肌胞苷酸刺激后，这些蛋白上调20至40倍(图2A)。

另一方面，促炎细胞因子如IL-1β、IL-6和TNFα在Abcf1 siRNA处理后略微升高，但在Abcf1过表达和聚肌胞苷酸刺激后，其水平显著上调15至25倍(图2A)。当用Abcf1 siRNA和聚肌胞苷酸处理时，抗炎细胞因子如IL-4的表达显著下调27倍，但在过表达后，下调幅度仅为6倍。另一方面，当用Abcf1 siRNA和聚肌胞苷酸处理时，IL-10轻微下调，但当ABCF1过表达时，IL-10显著升高(图2A)。ABCF1还正向调节聚肌胞苷酸刺激后的TGFβ水平(图2A)。

因此，ABCF1对细胞因子和趋化因子的调节表明，ABCF1对于通过产生IFN-I来消除病毒感染所必需的。在聚肌胞苷酸刺激后，ABCF1正向调节TGFβ和IL-10水平，并且这些细胞因子在存在ABCF1的情况下正向调节病毒的清除(图14)。

ABCF1通过JAK-STAT途径和IRF3的产生对抗病毒感染：细胞可以通过激活磷酸激酶R(PRK)抑制翻译，或者通过激活OAS蛋白通过RNaseL降解mRNA(Gantier和Williams，2007)。这两种途径都会导致IRF3的激活和二聚化，从而产生ISG((Chakrabarti等人，2011，Sen等人，2011)为了研究ABCF1是否调节这种信号传导，我们分析了经Abcf1 siRNA处理的以及经dsRNA激动剂聚肌胞苷酸刺激的BMDM中ISG特异性STAT蛋白STAT2、STAT3和STAT6的磷酸化水平。当仅经Abcf1 siRNA处理时，观察到这些蛋白的磷酸化水平显著降低。单独用聚肌胞苷酸刺激后，水平升高了30～40倍，但用Abcf1 siRNA和聚肌胞苷酸处理后仅增加5至10倍(图12B)。还可以看到MAPK途径略微增加，p38、ERK、JNK和转录因子c-JUN的磷酸化水平增加5至7倍(图12B)。在Abcf1 siRNA处理的BMDM中观察到IRF3二聚化减少。当用聚肌胞苷酸刺激时，IRF3磷酸化和二聚化显著增加，但当用Abcf1 siRNA和聚肌胞苷酸处理时，IRF3水平再次下降(图12C，图12D)这表明ABCF1对于通过STAT蛋白的dsRNA介导的信号传导是必需的，并导致IRF3二聚化和ISG的产生(图14)。

聚肌胞苷酸刺激后ABCF1对于OAS1a和RNaseL活性是必需的：抗病毒OAS1-RNaseL途径已被证明对病毒RNA切割和IFN-I的产生至关重要(Meng等人，2012)。为了研究ABCF1是否调节OAS1a信号，用抗ABCF1抗体对聚肌胞苷酸刺激的BMDM进行免疫沉淀，数据显示ABCF1和OAS1a之间存在关联(图3A、图3B)。然后在存在和不存在聚肌胞苷酸的情况下用Abcf1siRNA处理BMDM，并分析OAS1a蛋白水平。蛋白印记分析显示，当单独使用Abcf1 siRNA处理时，OAS1a水平降低，而当使用聚肌胞苷酸刺激时，OAS1a水平没有明显增加(图3C)。

为了检验ABCF1是否也是OAS1抗病毒活性所必需的，对2'5'a形成副产物产生的焦磷酸盐(PPi)的量进行了定量。当用OAS1刺激时，经Abcf1siRNA处理和聚肌胞苷酸刺激的BMDM显示PPi生成没有增加。另一方面，对照组PPi水平升高2倍(图3D)。

由于下游OAS信号导致RNaseL激活和病毒降解，因此研究了ABCF1是否调节RNaseL水平。在Abcf1 siRNA处理和聚肌胞苷酸刺激的BMDM中测定RNaseL蛋白水平。免疫印迹分析显示，在BMDM聚肌胞苷酸刺激的中ABCF1正向调节RNaseL水平(图3C)。

蛋白印记分析表明，在存在和不存在聚肌胞苷酸的情况下，ABCF1对经Abcf1siRNA处理的BMDM中ABCE1水平具有负调节作用(图3C)。这证实了ABCF1通过负调节ABCE1，正向调节RNaseL的病毒降解(图4)。

LPS刺激后，ABCF1是产生抗炎细胞因子所必需的：

为了研究ABCF1是否调节LPS信号传导，在存在和不存在LPS的情况下，用Abcf1siRNA和ABCF1过表达载体处理BMDM，并测定促炎细胞因子和抗炎细胞因子的水平。当仅用Abcf1 siRNA处理细胞时，观察到促炎细胞因子如IL-6、TNFα、IL-1β、IL-12p70、CXCL10、CXCL1(图5A)增加20～30倍，用LPS刺激细胞时观察到进一步增加，IL-6和TNFα显示出超过60倍的升高。另一方面，抗炎细胞因子如IL-1 Rα、IL-4、IL-10和ISG样IFNβ在单独使用Abcf1 siRNA处理时表现出30倍的下调，即使在LPS刺激后，这种上调也不明显(图5A)。

另一方面，当ABCF1过表达时，观察到IL-6、TNFα、IL-1β略有增加，但IL-12p70、CXCL10和CXCL1显著下调。当用LPS刺激细胞时，这种趋势更加完全(图15A)。观察到单独在BMDM中过表达ABCF1时，抗炎细胞因子如IL-1Rα、IL-4、IL-10和ISG样IFNβ水平升高，当用LPS刺激BMDM时，这种增加更为明显(图15A)。

ABCF1对于FcyR II A介导的BMDM吞噬作用是必需的：通过存在和不存在LPS的情况下，将Abcf1 siRNA处理的BMDM与荧光标记的乳胶IgG包被珠培养来研究ABCF1在调节吞噬作用中的作用。流式细胞术分析后，在LPS刺激下，Abcf1 siRNA处理的BMDM中观察到荧光强度降低6倍。这证实了在LPS刺激后，Abcf1对于乳胶IgG包被珠的吞噬作用至关重要(图6A)。

在Abcf1 siRNA处理的BMDM中也检查了荧光标记的大肠杆菌颗粒的吞噬作用。测定大肠杆菌与BMDM孵育前后的吸光度值，并测定吞噬水平。大肠杆菌培养后，经Abcf1siRNA处理的BMDM的吞噬作用水平降低了4倍，从而证实ABCF1对大肠杆菌的吞噬作用也是必需的(图6A)。

为了研究ABCF1是否通过FcγR来介导吞噬作用，通过流式细胞术分析FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的水平。CD64和CD16的表面水平均未随ABCF1的缺失而改变(数据未显示)而不受BMDM被LPS刺激的影响。另一方面，在LPS刺激后，CD32水平似乎受到ABCF1的正向调节(图6B)。为了分析ABCF1如何通过CD32介导吞噬作用，后者通过ABCF1过表达与LPS刺激的BMDM进行免疫沉淀。当免疫沉淀物用抗CD32抗体免疫印迹时，观察到强蛋白条带(图6C)。当用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹时，免疫沉淀物也显示出强的蛋白条带，表明在存在ABCF1情况下的CD32ITAM磷酸化，从而激活吞噬作用(图6C，图17)。

ABCF1在吞噬过程中正向调节SFK和STAT3的激活，负向调节MAPK：据报道，SFK类似于Src、Fyn、Lyn和Fgr，深度参与吞噬作用。为了证实ABCF1是否控制这一机制，在LPS存在和不存在的情况下用Abcf1 siRNA处理BMDM，并分析各种SFK的磷酸化水平。当细胞仅用Abcf1siRNA处理时，所有SFK的磷酸化均以不同的水平显著下调(图6D)。除SRC和FYN外，几乎所有SFK的水平均显著升高，LPS刺激后，SRC和FYN的水平升高了3至4倍(图6D)。

BMDM中蛋白磷酸化的分析还表明，当用Abcf1 siRNA处理时，MAPK样p38、ERK和JNK的水平升高40至50倍，而当用LPS刺激细胞时，这些水平显著降低(图6D)。MAPK特异性转录因子c-Jun也显示出相同的趋势(图6D)。另一方面，STAT转录因子表现出异常响应。STAT5a、STAT 2和STAT 3的磷酸化水平通过Abcf1 siRNA下调，并且在LPS刺激后水平似乎略微增加(图6D)，而STAT 5b的磷酸化通过ABCF1水平负调控。因此，证实ABCF1在LPS处理的BMDM中正向调节SFK和STAT转录因子，这有助于吞噬作用(图7)。

讨论

哺乳动物的免疫系统已经进化到通过细胞表面或细胞内的PRR识别和对抗许多不同形式的PAMP。这种复杂的机制受到许多蛋白的监视，这些蛋白形成了一个庞大的信号级联网络，最终控制细胞对入侵者的反应。ABCF1通过TLR2、3、4、5和9控制免疫信号，包括革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌和病毒感染。已发现ABCF1在TLR2、3、4和9信号传导中负调节促炎细胞因子(如IL-6和TNFα的产生)，并在TLR5途径中正调节促炎细胞因子。ABCF1在TLR2途径中负向调节II型干扰素，而在TLR5和TLR9信号中正向调节它们。

在BMDM病毒感染后，发现ABCF1对产生ISG特异性蛋白如IFNβ和CXCL10至关重要(图2A)。通过聚肌胞苷酸刺激后的TLR3信号传导，ABCF1对STAT2、3、5和6磷酸化是必需的，并负调节MAPK磷酸化(图2B)。Abcf1 siRNA处理的BMDM中的蛋白分析显示，在核内聚肌胞苷酸刺激后，NF-KB p65磷酸化增加(图2C)，证实MAPK通路激活。在经Abcf1 siRNA处理和聚肌胞苷酸刺激的BMDM中观察到IRF3磷酸化和二聚化水平降低，从而证实ABCF1正调节STAT蛋白活性(图1B)。

之前的研究表明，细胞通过Oas1-RNaseL介导的病毒降解对抗dsRNA感染(Kerr等人，1978，Kuhn等人，2005，Chakrabarti等人，2011)。我们还发现，ABCF1通过与OAS1a相互作用并控制其2'5'a活性来调节所述信号通路。免疫沉淀实验表明，在聚肌胞苷酸刺激下，OAS1a通过ABCF1进行免疫沉淀(图3)。蛋白分析还表明，在经Abcf1 siRNA处理和聚肌胞苷酸刺激的BMDM中，ABCF1正调节OAS1a水平(图13)。还发现ABCF1负调节RNaseL抑制剂ABCE1的蛋白水平，从而正调节RNaseL水平(图3)。

实施例2：ABCF1通过其E2结合活性控制TLR4的内吞作用

在此，ABCF1被描述为E2泛素结合酶，是ABC转运基因中的一种新活性，通过泛素化参与调节和控制细胞因子分泌的关键元件，调节TLR4内吞作用并控制脓毒症介导的ET期。

结果

ABCF1将巨噬细胞极化转变为M2b表型：为了研究ABCF1是否调节巨噬细胞极化的转变，用流式细胞术分析经LPS刺激的Abcf1 siRNA处理和过表达的BMDM中M1和M2特异性细胞表面标志物的水平。在Abcf1 siRNA处理的细胞中，M1特异性标志物如CD86和MHC-II的水平最高，其次是ABCF1过表达的细胞(图8A)。另一方面，经Abcf1 siRNA处理和ABCF1过表达的细胞中M2a特异性CD206水平与各自的对照组相同或略低。

不同转录因子的激活也被证明可以调节和区分M1和M2特定的细胞类型。在含和不含LPS的Abcf1 siRNA处理细胞的核提取物中观察到M1特异性NF-KB p65的磷酸化水平升高(图9A)，而在含和不含LPS的Abcf1 siRNA处理细胞中观察到M2特异性IRF3磷酸化和二聚化降低(图8C，图9A)。

此外，当仅使用Abcf1 siRNA处理BMDM时，观察到M1特异性促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12p70、TNFα)升高20至40倍(图8B)。促炎细胞因子的这种上调在接受Abcf1 siRNA和LPS处理的细胞中并不明显。相反，在Abcf1 siRNA处理的BMDM中，M2特异性抗炎细胞因子(IL-1-Rα、IL-4、IL-10、TGFβ)在有和没有LPS的情况下下调20到30倍。

在ABCF1过表达BMDM的上清液中观察到更温和的趋势。M1特异性促炎细胞因子仅在ABCF1过表达时表现出5到7倍的上调，并且在LPS刺激下进一步增加，但其水平从来没有Abcf1 siRNA处理的上清液中的水平高。而M2特异性抗炎细胞因子(如IL-1Rα、IL-4和TGFβ)在单独ABCF1过表达的情况下表现出5至10倍的显著降低，并且在LPS刺激后继续降低。然而，无论考不考虑LPS，IL-10和IFNβ的水平都很高，并且在LPS处理时水平变得更高(图18B)。

M2a特异性巨噬细胞的促炎细胞因子含量通常较低，而抗炎细胞因子含量较高，MHC-II水平较低。但在这里，这种趋势更倾向于M2b表型。M2b特异性细胞已被证明能产生相当高的IL-1β、IL-6和TNFα，并具有较高的MHC-II和CD86。它们产生较少的IL-4，这是M2a细胞的特征性细胞因子，但产生较多的IL-10和IFNβ。这意味着ABCF1将巨噬细胞转变为M2b表型，其缺失使巨噬细胞恢复为M1。

ABCF1是一种新型的IV类E2结合酶：使用CLUSTALW服务器对小鼠ABCF1和其他已知小鼠E2酶的蛋白序列进行序列比对。发现ABCF1蛋白序列中E2-UBC结构域内高度保守的区域，特别是活性位点以及对泛素化活性至关重要的其他残基内的区域。在ABCF1序列647位中发现一个半胱氨酸残基，所述残基与所有其他E2活性位点中的半胱氨酸残基完全一致(图11A)。由于ABCF1的二级结构在X射线或核磁共振研究中都没有实验报道，因此使用YASPIN和APSSP服务器工具通过同源建模技术预测了ABCF1的二级结构。

尽管在整个UBC结构域中保留了E2的核心拓扑结构，所有E2都有关键的催化性半胱氨酸，但在一些成员中观察到了许多结构变化，这些成员改变了E2活性位点的既定结构。ABCF1在其UBC结构域中显示出特征性的β曲折(meander)，随后是C端活性位点——β-发夹状瓣结构(此处称为“瓣”)(图21A)(Burroughs等人，2007)。ABCF1在瓣的C端区域也显示了一个高度保守的半胱氨酸残基；UBC13和ATG10E2酶也是如此，其结构已在较早时被确定(Wu等人，2003)。根据先前的研究，在瓣区观察到一种保守的天冬酰胺(图21A)(此处称为“瓣状天冬酰胺”)，通常发现与保守的半胱氨酸(如UBE2W)非常接近(7～15个残基)，ABCF1也显示了瓣状天冬酰胺，但其保守性不如其他E2。在E2活性部位也观察到在瓣状天冬酰胺上游存在保守的瓣状组氨酸。已知这些极性残基和半胱氨酸接触并有助于泛素(Ub)结合(Burroughs等人，2007)。然而，在ABCF1中，活性部位的其他极性残基(精氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺)和瓣区上游的组氨酸的存在可能有助于Ub结合。另一方面，自噬特异性ATG10缺乏天冬酰胺和组氨酸(图11A)(Burroughs等人，2007)。研究表明，瓣状天冬酰胺和组氨酸都仅在少数家族中保守，这种保守性差可能是不同E2识别靶肽差异的结果(Burroughs等人，2007，Yunus和Lima2006)。

E2瓣区疏水残基的存在有助于降低活性部位的pKa，并介导E2-E3结合(Capili等人，2007)。发现ABCF1含有所有E2中最多数量的疏水残基(图21A)，这将降低pKa并允许目标赖氨酸脱质子。ABCF1还显示了一个十分保守的脯氨酸残基，它位于瓣区的上游，将瓣固定在β曲折处，并有助于稳定整个结构(Burroughs等人，2007)。

为了证实这一发现，通过体外泛素化试验研究了辅助因子Mg

为了证实ABCF1序列中647位的保守半胱氨酸是否是介导E2功能的催化性半胱氨酸，用Abcf1 WT和Abcf1 C647S(其中半胱氨酸突变为丝氨酸)蛋白结构进行体外泛素化分析。在Mg

早期的研究已经描述，E2酶根据UBC结构域的N和/或C端的存在分为4类。由于ABCF1的保守半胱氨酸位于647位，基于生物信息学研究，ABCF1的UBC结构域在647位之后很快终止，并且ABCF1蛋白长840个氨基酸，因此它具有相当大的N端和C端延伸，这是IV类E2的特征。因此，ACF1是一种在647位具有保守的催化性半胱氨酸的新型IV类E2结合酶。

ABCF1泛素化对TLR4内吞是必需的：为了研究ABCF1是否对TLR内吞是必需的，我们分析了不同LPS浓度和时间点下BMDM表面TLR4水平的缺失(TLR4内吞的读数)。表面TLR4的流式细胞术分析表明，内吞首先发生在低至LPS 10ng/ml浓度时，最早发生在30分钟时(图12A，B)。当用Abcf1 siRNA和LPS处理细胞时，表面TLR4水平升高(图12C)。当Abcf1 WT质粒过表达时，表面TLR4水平显著降低(或更多TLR4内吞)，但当Abcf1 C647S突变质粒过表达时，这种现象发生逆转，表明ABCF1泛素化在TLR4内吞中的潜在作用。在小鼠体内实验中也证实了这一现象。在WT和Het小鼠的CD11b+脾巨噬细胞上分析TLR4水平。在所有时间点，与WT相比，ABCF+/-小鼠表现出更多的TLR4表面染色(图12D)，支持了ABCF1与TLR4内吞作用有关的假设。

ABCF1调节从MyD88到TRIF依赖性信号的转变：为了研究ABCF1的泛素化活性是否进一步调节两个下游通路之间的转变，在Abcf1 siRNA处理和LPS刺激的BMDM中分析了参与这些通路的各种蛋白的磷酸化水平。在仅用Abcf1 siRNA处理的细胞中，TAK1的磷酸化水平显著上调，并且当用LPS刺激时，这些水平似乎在几分钟内降低(图9B)。虽然已知LPS刺激会增加TAK1的磷酸化，ABCF1的缺失本也会对其起到补充作用，但在这种情况下，在LPS刺激后，TLR4内吞到内体，从而触发TAK1独立的替代TRIF途径(图8B，图9B)。当观察到仅用LPS处理的对照组中p-TBK1水平升高，同时用Abcf1 siRNA和LPS处理的细胞中p-TBK1水平降低时，这一点得到进一步证实(图9B)。与Abcf1 siRNA处理的细胞(有和没有LPS)相比，仅用LPS刺激的对照组NF-KB途径的负调节因子A20水平升高。几种激酶和MAPK激酶特异性转录因子的磷酸化水平与p-TAK1和干扰素刺激基因特异性转录因子(STAT-2、-3和-6)的趋势相同，与A20的趋势相同(图10A)，从而进一步证实了所述假设。在LPS存在和不存在的情况下，ABCF1的过表达也证实了这一趋势，其中p-TAK1、A20、p-TBK1和p-IRF3的水平与TRIF依赖性信号相关(图9C)。

泛素化ABCF1通过其K63多聚泛素化活性调节TLR4内吞和TRIF信号传导：数据显示ABCF1将TLR4通路转移至TRIF-IFN-I信号传导。研究显示当在5分钟、10分钟和20分钟的时间点用LPS-10ng/ml刺激BMDM时，ABCF1的K48多聚泛素化水平升高，而在刺激30分钟后，在LPS-10ng/ml、LPS-100ng/ml和LPS-1μg/ml时，ABCF1的K63多聚泛素化发生变化(图13A，图13B)。这表明ABCF1是泛素化的靶点，与K48连接且被未知蛋白多聚泛素化，在早期和后期时间点调节MAPK和NF-KB介导的促炎症的ABCFT负调节，调节ABCFT在TLR4内吞中的作用。

为了研究TRAF6和cIAP1/2参与所述信号传导的可能性，在LPS存在和不存在的情况下，用小分子Smac模拟物(SM)处理BMDM，所述模拟物可触发cIAP1/2降解(Petersen等人，2007)和发动蛋白抑制剂Dynasore(Dy)，所述抑制剂可抑制TLR4内吞作用(Macia等人，2006)。免疫印迹分析显示，当单独用LPS处理BMDM时，ABCF1是K63多聚泛素化的靶点，当LPS存在时，BMDM用SM处理时，K63多聚泛素化水平增加，表明TLR4内吞介导的TRIF信号开始出现。发现ABCF1的K63多聚泛素化具有内吞依赖性，因为使用Dynasore处理后未观察到K63多聚泛素化(图23C)。当Dynasore处理BMDM时，ABCF1靶向K48多聚泛素化，表明MyD88信号激活，并且在LPS存在下，SM和Dynasore处理BMDM时，未观察到ABCF1的K48多聚泛素化。这表明在LPS存在的情况下，cIAP1/2以HECTE3结构域样方式靶向ABCF1进行K48多聚泛素化，并且所述步骤发生在内吞之前。

当BMDM使用cIAP1/2 siRNA和LPS处理时，观察到ABCF1蛋白水平升高，相反，p-TAK1水平降低(图14A)，证实cIAP1/2对TAK1介导的MAPK、NF-KB信号传导至关重要，并负调节ABCF1水平。

为了进一步研究TRAF6和ABCF1之间的泛素化联系，TRAF6与LPS刺激的BMDM中的ABCF1免疫共沉淀，证实TRAF6在ABCF1介导的信号传导中的潜在作用(图14B)。用Traf6、泛素和Abcf1WT质粒转染，然后用抗GFP进行免疫沉淀，用抗HA抗体IB，无论考不考虑LPS刺激，HA-K48转染均显示非常微弱的蛋白条带(图14D)，而在LPS刺激后转染Flag-Traf6和HA-K63质粒时，观察到非常强的蛋白条带。这表明，在LPS刺激下，ABCF1是TRAF6以HECTE3结构域样方式进行K63多聚泛素化的靶点，并且这种泛素化以内吞依赖的方式在缺乏cIAP1/2的情况下发生(图13C)。

在BMDM中，还发现SYK与ABCF1免疫共沉淀，并且在LPS刺激的BMDM中，这一点大大增强(图14B)。BMDM中SYK的过表达也增加了ABCF1的数量，ABCF1可与抗SYK抗体免疫共沉淀(图24C)。未观察到ABCF1与PLCγ2直接相关(数据未示出)。研究发现，在LPS刺激的BMDM中，ABCF1的缺失对p-SYK和p-PLCγ2水平具有负调节作用(图14E)，这是TLR4内吞的关键步骤。为了进一步研究ABCF1-SYK和TLR4内吞作用之间的泛素化联系，在LPS存在和不存在的情况下，将携带Abcf1、泛素和Syk结构的质粒转染BMDM，并对裂解物进行免疫沉淀。无论是否存在LPS，HA-K48质粒均观察到微弱至无蛋白条带，或在不存在LPS的情况下HA-K63质粒观察到微弱至无蛋白条带，但当存在LPS的情况下与Abcf1WT、Syk和HA-K63质粒共转染时，观察到强蛋白条带(图15A)。当Syk和泛素化质粒与Abcf1 C647S突变质粒共转染时，所述蛋白条带完全消失，表明保守的半胱氨酸是泛素转移所必需的，也是泛素化靶蛋白的关键。

数据显示，TRAF6和SYK在内吞过程中与ABCF1结合，进而暗示TRAF6-ABCF1-SYK复合物的形成。这表明，在LPS刺激后，TRAF6与靶蛋白SYK和E2结合酶ABCF1结合，起到支撑的作用，并以环状结构域的方式帮助ABCF1对SYK进行K63多聚泛素化(图16)。

ABCF1靶向TRAF3进行K63多聚泛素化并调节IFN-I的产生：迄今为止的数据表明，ABCF1对TLR4的内吞、活化、TBK1和IRF3的磷酸化以及IFN-I的产生至关重要。还观察到ABCF1与TRAF3相关，当用LPS刺激BMDM时，TRAF3与抗ABCF1抗体免疫共沉淀，当TRAF3在BMDM中过表达时，ABCF1与抗TRAF3抗体进行免疫共沉淀(图14B，图14D)。为了检测ABCF1是否以TRAF3为靶点进行泛素化并调节下游信号传导，在BMDM中转染了Abcf1、Traf3和泛素结构。无论是否存在LPS，HA-K48质粒均观察到微弱至无蛋白条带，或在不存在LPS的情况下HA-K63质粒观察到微弱至无蛋白条带，但在存在LPS的情况下与Abcf1 WT、myc-Traf3和HA-K63共转染时，观察到强蛋白条带(图15B)。

这意味着在LPS刺激下，ABCF1以环状结构域样方式靶向TRAF3进行K63多聚泛素化。当质粒与Abcf1C647S突变质粒共转染时，所述蛋白条带完全消失。在TRAF3和TRAF6之间没有发现结合(数据未示出)，E3连接酶在环结构域介导的转移中的作用尚不清楚。

先前的研究表明TRAF3泛素化依赖于TRIF(Hacker等人，2011，Tseng等人，2010)。为了检测ABCF1是否参与所述复合物，在LPS存在和不存在的情况下用Trif siRNA处理BMDM，用ABCF1抗体进行免疫共沉淀，并用抗TRAF3抗体进行免疫印迹。LPS刺激后，观察到ABCF1和TRAF3的强结合，但在错义和Trif siRNA之间未观察到任何变化(图15C)。在WCL上，Trif siRNA导致p-TBK1水平降低，证实Trif依赖的TRAF3泛素化对下游通路很重要。因此，得出结论，TRIF对ABCF1和TRAF3结合不是必需的，但可能ABCF1首先与TRAF3结合，然后所述复合物通过TRAF3与TRIF结合，因此随后启动ABCF1介导的TRAF3 K63多聚泛素化(图16)。

讨论

内毒素脂多糖是脓毒症发病机制中最有效的损伤。脓毒症是一种双期炎症性疾病，其各期之间的转变机制仍不清楚。LPS-TLR4信号控制脓毒症期间的细胞因子风暴。

ABCF1通过其K63多聚泛素化活性控制TLR4的内吞作用，从而调节IFN-I反应和巨噬细胞极化。人类ABCF1也与其他已知的人类E2序列完全一致，并且在655位有一个保守的半胱氨酸。

在巨噬细胞中，MyD88依赖的TLR4信号的早期阶段导致UBC13靶向TRAF6进行K63多聚泛素化，进而靶向cIAP1/2进行K63多聚泛素化(Hacker等人，2011)。然后，cIAP1/2增强了K48介导的ABCF1(图13C)和TRAF3的蛋白酶体降解(Tseng等人，2010)。在缺乏ABCF1的情况下，TAK1被磷酸化，这导致MAPK和NF-KB途径的激活以及促炎细胞因子如TNFα、IL-1β、IL-6的产生增加，从而使巨噬细胞极化为M1表型。

cIAP1/2的自身K48蛋白酶体降解触发晚期TLR4信号的开始。cIAP1/2的降解导致TRAF6以HECT结构域样方式激活ABCF1并使其发生K63连接的多聚泛素化(图13C、图13D)。活化的ABCF1随后与TRAF6和SYK结合并形成复合物(图14B、图14C、图14D)，并以环状结构域的方式靶向SYK进行K63多聚泛素化(图15A)。这导致SYK和随后的PLCγ2磷酸化(图22、24E)。由于ABCF1对SYK的磷酸化和泛素化对TLR4的内吞作用都很重要，因此还需要进一步研究来了解这些过程是同时作用还是依次作用。SYK和PLCγ2的磷酸化调节TLR4内吞进入内体，然后启动TRIF依赖的TLR4信号(图12、图13)。这导致IRF3的磷酸化和二聚化以及IFN-I的产生。还发现ABCF1通过与TRAF3和TRIF形成复合物并以TRIF依赖的方式靶向TRAF3进行K63连接的多聚泛素化来调节下游TRIF信号(图15B、图15C)。这触发了TBK1的磷酸化，导致IRF3的磷酸化和最终二聚化(图8、图15B、图15C)，并产生IFN-I刺激的基因，包括IFNβ(图9A、图16)。

这种由ABCF1的泛素化活性调节的转变不仅调节TLR4的内吞作用，而且还控制巨噬细胞极化。我们还发现，ABCF1对于增加IL-10的产生、减少TNFα、IL-1β、IL-6(图8、9A)和CD86、MHC-II表面标志物的产生以及降低CD206和IL-4水平是必要的，从而通过TRIF依赖性信号将巨噬细胞极化为M2b表型(图16)。

实施例3：ABCF1调节脓毒症期间从SIRS到ET期的转变：

脓毒症是一种双期疾病，其特征是最初的高炎症期，也称为全身炎症反应综合征(SIRS)，随后是免疫受损期，称为内毒素耐受(ET)期。SIRS期显示促炎细胞因子如IL1β、TNFα、IL-6的大量产生，以及抗炎细胞因子如IL-10、IL-4、IL-1Rα的下调，而ET期则完全相反。在SIRS中，剧烈的炎症损伤通常会导致收缩力受损，心脏指数和射血分数降低，从而导致循环衰竭。持续性循环衰竭导致微循环和血管系统破裂，从而导致多器官功能障碍综合征(MODS)，这是脓毒症死亡率的主要决定因素。过渡到ET期会抑制整体炎症反应，所述期死亡可能是由于未能控制原发感染或继发感染所致。

结果

ABCF1靶向TRAF3进行K63多聚泛素化，并控制脓毒症期间向ET期的转变：研究脓毒症期间向ET期的转变WT和Abcf1+/-(Het)小鼠均按照方法中所述用内毒素LPS处理，并测定血清细胞因子。

ETT-WT小鼠遵循完全相同的ET期趋势，IL-1β、IL-6、TNFα、CXCL11和CXCL10显著降低25至35倍。然而，与ETT-WT小鼠相比，ETT-Het小鼠的IL-6水平增加了30倍，IL-1和TNFα水平升高了50至60倍(图17A)，因此表现出细胞因子风暴的表型。甚至ETT-WT小鼠中的抗炎细胞因子也遵循正常的ET趋势，而ETT-Het小鼠的IL-1Rα、IL-4、TGFβ和IFNβ水平下调20至30倍，IL-10水平进一步下调40至50倍。

存活分析表明，只有55％的ETT-Het小鼠存活到第二次注射后的8小时，16小时后没有存活。另一方面，ETT-WT在96小时结束时显示90％的存活率(图17B)。这些小鼠BMDM中的蛋白表达表明，ETT-Het小鼠的p-TAK1水平升高，A20水平降低，伴随这低p-IRF3水平，这是SIRS期MyD88依赖性信号的特征。另一方面，ETT-WT小鼠的BMDM显示p-TAK1降低，A20和p-IRF3水平升高，这是ET期TRIF依赖性信号的特征(图17C)。

为了了解这种转变发生的机制，BMDM的免疫印迹分析显示ETT-Het小鼠中TRAF3的K48多聚泛素化增加，表明K48介导TRAF3的蛋白酶体降解，从而激活MyD88-SIRS途径。在ETT-WT小鼠中观察到TRAF3的K63多聚泛素化增加，表明TRIF-IFNI-ET通路激活(图17D)。在ETT-WT BMDM中也观察到二聚IRF3水平升高，但在ETT-Het中未观察到IRF3二聚化(图17E)。ETT-Het小鼠的MAPK水平升高70至100倍，证实了ABCF1和TRAF3通过MAPK途径对炎症进行反向调节(图18A)。

ETTHet小鼠的BMDM经历了大量的细胞焦亡：ET期免疫细胞中通过半胱天冬酶3的凋亡是脓毒症期间获得继发感染的主要原因，而大量的细胞焦亡导致脓毒症期间SIRS介导的死亡(Jorgensen和Miao，2015)。细胞焦亡是一种半胱天冬酶1依赖的细胞死亡途径，由细胞内病原体信号触发。NOD样受体NLRP3与衔接蛋白ASC结合，并与半胱天冬酶1形成炎症体复合物，导致半胱天冬酶裂解，从而形成活性复合物，导致IL-1β、HMGB1、TNFα的产生以及细胞焦亡介导的细胞死亡(Guo等人，2015)

ETT-Het小鼠的血清细胞因子表现为细胞因子风暴表型，IL-1β、HMGB1、IL-6和TNFα显著升高(图17A)。与ETT-WT小鼠相比，从ETT-Het小鼠分离的BMDM也显示出NLRP3、ASC和活化型半胱天冬酶蛋白水平升高，活化型半胱天冬酶3水平降低，表明细胞焦亡介导的细胞死亡而非凋亡(图17C)。ETT-Het小鼠BMDM中凋亡特异性激酶如AKT的磷酸化水平降低(图18B)进一步证实了这一假设。有趣的是，Abcf1 siRNA处理和LPS刺激的BMDM也观察到类似的趋势(图18C)。

ABCF1单倍剂量不足小鼠在SIRS期出现肾循环衰竭：内毒素感染后，Het小鼠恢复到SIRS期，并显示促炎细胞因子上调50至60倍(图17A)。这些小鼠的组织学证实肾脏小血管广泛扩张和充血(图19)。此外，这些图像清楚地显示了扩张/充血血管中红细胞(黑色箭头所示)被压缩在一起的淤积效应(sludging effect)。这种形式的系统性脉管扩张导致血压严重下降，造成血液和氧气不足，无法到达包括大脑和心脏在内的重要中枢器官。与ETT-WT小鼠相比，ETT-Het小鼠的淤血和血管扩张显著增加，表明血管充血加剧，导致严重低血压和死亡率增加。

讨论

脓毒症期间，ABCF1也被发现负向调节细胞因子风暴期。观察到ABCF1在脓毒症期间以TRAF3为靶点进行K63连接的多聚泛素化，从而触发IRF3磷酸化、二聚化以及抗炎细胞因子和IFN-I基因的产生(图17)。这调节了脓毒症期间从MyD88依赖性SIRS期向TRIF依赖性ET期的转变。在Abcf1单倍剂量不足ETT-Het小鼠中，这种转变受到抑制，从而导致细胞因子风暴的SIRS依赖性表型，而ETT-WT小鼠表现出向ET期的完美转变，并表现出抗炎细胞因子和IFN-I基因的显著升高(图17A)。

小鼠存活率检查显示，第二次注射LPS 16小时后，ETT-Het小鼠存活率为0％，而ETT-WT小鼠即使在96小时后仍有90％的存活率(图17B)。ETT-Het小鼠BMDM的蛋白表达显示p-TAK1和MAPK水平显著升高，A20、STAT3和STAT6(图17C，图18A)蛋白水平降低，从而证实了SIRS期的激活。

发现细胞损伤和宿主死亡主要通过细胞焦亡的下游效应发生。在ETT-Het小鼠中可以检测到大量的免疫细胞焦亡，其中观察到HMGB1、NLRP3、ASC和活化型半胱天冬酶1裂解水平升高，活化型半胱天冬酶3和AKT1磷酸化水平降低(图17、图18)。这证实在脓毒症ET期ABCF1也是调节导致细胞凋亡而非细胞焦亡的通路开关所必需的。

此外，内毒素感染后的组织学分析显示肾脏微循环发生了改变。在ETT-Het小鼠中，大量的红细胞聚集在血管内，称为淤血。这种淤血是由微循环和血流动力学的改变触发的，而微循环和血流动力学的改变受脓毒症SIRS期促炎细胞因子升高的调节(Ramseyer和Garvin，2013)。这主要导致三个主要器官的灌注不足：心脏、大脑和肾脏(Vincent等人，2006)。ETT-Het小鼠肾脏的低灌注显著增加(图19)，这与促炎细胞因子和MAPK的SIRS期特征(图17A、图18A)的上调有关，但心脏和大脑的低灌注无明显增加(数据未显示)。ABCF1启动子活性显示肾脏中ABCF1启动子活性超过60％，而心脏中仅为10％，大脑中约为30％(Wilcox等人，2017)，目前的数据与Abcf1Het小鼠相比心脏和大脑的肾脏微循环发生明显变化的情况一致。

因此，基于分子和组织学分析，可以得出结论，ABCF1控制促炎细胞因子的产生，调节肾脏微循环、血管系统并靶向TRAF3进行K63连接的多聚泛素化，因此是脓毒症从SIRS期转变到ET期的必要条件，从而调节脓毒症死亡率。

总之，发现了一种新的泛素E2结合酶ABCF1，它通过K63多聚泛素化TRAF3并引起IRF3核易位和二聚化，控制TLR4内吞作用从MyD88向TRIF依赖信号的转变，从而使巨噬细胞极化为M2b表型，并使SIRS向ET转变。在脓毒症期间，ABCF1控制肾脏微循环和血管系统，并调节SIRS介导的死亡率。

实施例4：ATP结合盒式基因ABCF1作为E2泛素结合酶发挥作用，控制巨噬细胞极化以抑制致死性脓毒性休克

ABCF1的泛素化将炎症特征从早期MyD88依赖性信号通路转变为晚期TRIF依赖性信号通路，从而调节TLR4内吞作用并调节巨噬细胞从M1期到M2期的极化。生理学上，ABCF1调节从脓毒症炎症期到内毒素耐受期的转变，并通过免疫治疗中介体SIRT1调节细胞因子风暴和干扰素β(IFNβ)依赖性的产生。因此，ABCF1通过抑制低血压引起的肾循环功能障碍来控制脓毒症引起的死亡率。

小鼠和细胞

从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓细胞，并如所述使其成熟为巨噬细胞(Trouplin等人，2013)。简单地说，用添加10％热灭活胎牛血清(FBS)的罗斯韦尔公园纪念研究所培养基(RPMI)冲洗C57BL/6小鼠的胫骨和股骨，获得小鼠骨髓。骨髓细胞在添加有10％FBS、谷氨酰胺和30％含有巨噬细胞集落刺激因子的L929细胞上清液的10mL RPMI中培养，初始密度为10

如前所述(Wilcox等人，2017)制备Abcf1

转染

细胞中的所有基因沉默均用脂质体

所有基因的过表达都是用脂质体

小鼠基因质粒：小鼠Abcf1WT表达载体购自GenScript(Clone Id:OMu73202)。TopGene Technologies(加拿大蒙特利尔)在Abcf1 WT和Abcf1 C647S中克隆了Abcf1 C647S突变和GFP标签。FLAG-Traf6是John Kyriakis(Addgene质粒#21624)赠送的。pMSCV mCherrySyk是Hidde Ploegh(Addgene质粒#50045)赠送的。小鼠Traf3表达载体购自Origene(MR225761)。

泛素质粒：pRK5-HA泛素WT(Addgene质粒#17608)包含所有赖氨酸完整的野生型泛素，pRK5-HA-泛素-K48(Addgene质粒#17605)和pRK5-HA-泛素-K63(Addgene质粒#17606)购自Ted Dawson，与小鼠泛素C基因具有100％的相似性。Ub-K48和Ub-K63质粒仅含有K48和K63赖氨酸；所有其他赖氨酸都突变为精氨酸。

细胞因子分析

制备2×10

共免疫沉淀

用新制备的20mM Tris-HCl pH 8.0、137mM NaCl、1％Nonidet P-40、2mM EDTA、1×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(ThermoFisher Scientific；78440)和20mM N-乙基马来酰亚胺(Santa Cruz Biotechnology；sc-202719)裂解2×10

免疫印迹

如上所述制备细胞裂解物。除非另有说明，否则制备所有免疫共沉淀样品时，样品缓冲液中不含DTT。所有其他蛋白印记样品均在样品缓冲液中用DTT制备。裂解物进行电泳，并用指示抗体进行免疫印迹。

抗体和化学品

用于蛋白印迹和免疫沉淀的抗体：蛋白印迹的抗ABCF1抗体(ThermoFisherScientific；PA5-29955)、免疫共沉淀的抗ABCF1抗体(Proteintech；13950-1-AP)、抗I-KB抗体(abcam；ab32518)、磷酸化I-KB抗体(abcam；ab12135)、抗NF-KB p65(abcam；ab16502)、抗磷酸化NF-KBp65(abcam；ab86299)、抗切割CASP1抗体(Santa Cruz Biotech；sc-514)、抗切割CASP1抗体(abcam；ab108362)、抗切割CASP3(Cell Signaling Technology；9661)、抗CASP3抗体(abcam；ab13847)、抗NLRP3抗体(R&D Systems；MAB7578)、抗ASC抗体(SantaCruz Biotech；sc-514414)、抗TAK1抗体(abcam；ab109526)抗磷酸化TAK1抗体(abcam；ab192443)、抗TBK1抗体(abcam；ab40676)、抗磷酸化TBK1抗体(abcam；ab109272)、抗IRF3抗体(Santa Cruz Biotech；sc-15991)、抗磷酸化IRF3(Cell Signaling Technology；4947)、抗SYK抗体(Santa Cruz Biotech；sc-1240)、抗磷酸化SYK抗体(abcam；ab58575)、抗PLCγ2抗体(Santa Cruz Biotech；sc-5283)、抗磷酸-PLCγ2抗体(Cell Signaling Technology；3871)、抗A20抗体(Santa Cruz Biotech；sc-69980)、抗K48抗体(Cell SignalingTechnology；4289)、抗K63抗体(Cell Signaling Technology；5621)、抗TRAF6抗体(SantaCruz Biotech；sc-8409)、抗cIAP抗体(Santa Cruz Biotech；sc-1869)、抗TRIF抗体(abcam；ab13810)、抗TRAF3抗体(Santa Cruz Biotech；sc-6933)、抗UB抗体(Santa CruzBiotech；sc-8017)、抗GAPDH抗体(abcam；ab181602)、抗组蛋白H3抗体(abcam；ab8580)、抗GFP抗体(abcam；ab290)、抗MYC抗体(abcam；ab9132)、抗mCherry抗体(ThermoFisherScientifisher；PA5-34974)抗HA抗体(Santa Cruz Biotech；sc-7392)。

用于荧光激活细胞分选术(FACS)抗体：CD86(BioLegend；105011)、CD206(BioLegend；1417097)、MHC-II(BioLegend；141607)、TLR4(BioLegend；145406)、CD1b(BioLegend；101223)。

所用化学品：NP-40(abcam；ab142227)、Smac模拟物(Tocris；5141)、发动蛋白抑制剂I dynosore(Santa Cruz Biotech；sc-202592)、脂多糖(Santa Cruz Biotech；sc-221855)、N-乙基马来酰亚胺(Santa Cruz Biotech；sc-202719)、PMSF溶液(Santa CruzBiotech；sc-482875)和抑肽酶(Santa Cruz Biotech；sc-3595)。

磷酸激酶分析：

如上所述制备2×10

IRF3二聚化分析

2×10

细胞质和细胞核的分级分离：

使用上述处理刺激骨髓巨噬细胞，并根据制造商的说明使用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂(Thermo Scientific；78833)进行细胞质和细胞核分离。

体外泛素化分析

Abcf1WT和Abcf1 C647S表达质粒如上所述在巨噬细胞中进行过表达。在过表达Abcf1 C647S表达质粒之前，如上所述，用Abcf1 siRNA处理细胞以消除内源性Abcf1。用冷PBS洗涤Abcf1 siRNA处理的细胞两次，然后过表达Abcf1 C647S表达质粒。制备细胞裂解物并与抗ABCF1抗体进行免疫共沉淀。蛋白印记检测过表达和免疫共沉淀的程度。根据制造商的说明，使用泛素化分析试剂盒(abcam；ab139467)对免疫沉淀样品进行泛素化分析。在凝胶上跑样，并用抗ABCF1和抗UB抗体进行印迹。

骨髓重建

受体小鼠接受亚致死性照射(800-1000Rads)，然后用已用异氟烷和二氧化碳吸入安乐死的供体小鼠骨髓重建。在照射的同一天进行重建，使用静脉尾静脉注射。骨髓如前所述被冲洗，供体小鼠的2×10

WT和Abcf1

体内内毒素耐受性

所有的体内实验都得到批准，并按照不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的规定进行。8-10周龄的雌性WT和Abcf1

存活研究

首次注射LPS或PBS后，每天对WT和Abcf1 Het小鼠进行一次监测。第二次注射LPS后，每8小时对小鼠进行一次监测，并根据行为和活动的严重程度、外观、理毛和姿势、呼吸频率、努力程度和模式、直肠温度、疼痛和体重对小鼠进行评分(0-3)。3分被认为是人道终点(被安乐死)，包括：骶髂区无明显脂肪，肌肉质量严重减少，椎骨和髂骨嵴突出。不动，轻推或捡起时不移动；如果把动物放在一边，它就不能直立。毛发竖起(>身体的75％)，外观凌乱，蓬头垢面，伴有其他严重的疾病症状。坐姿和行走时持续严重驼背，对处理无反应。在笼子内或称重时喘息或张口呼吸；呼吸困难，无法走动；大声呼吸(用力呼吸时发出吱吱声)，间隔一小时连续三次测量<33℃，尽管给予镇痛但还是有干扰正常功能的持续/连续疼痛迹象，动物无反应，摸起来很冷，皮肤严重损伤(severe skin tent)(>10秒)。

组织学分析

首先通过腹腔注射给予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(高达150mg/kg体重的氯胺酮和15mg/kg体重的甲苯噻嗪)来麻醉小鼠，然后以5ml/min的流速灌注无菌PBS 5分钟，并在第二次LPS注射后3小时处死小鼠。肾、脑和心脏组织在4％多聚甲醛中固定24小时，在PBS中洗涤，并包埋在石蜡中。切下5μm厚的切片，并用苏木精和伊红(HE)染色。使用配备40倍物镜的Olympus BX51显微镜拍摄组织学快照。使用附加的Olympus DP73摄像机和高性能OlympuscellSens软件生成图像。

热图和柱状图生成和倍数变化计算

热图和柱状图在GraphPad prism软件(GraphPad prism Software，加利福尼亚州圣地亚哥)中生成。如图所示，颜色强度表示蛋白的上调或下调，并示出p值。

Abcf1 siRNA处理的BMDM(经PAMP处理或未经PAMP处理)中细胞因子和磷酸激酶表达的倍数变化通过归一化经错义siRNA处理的BMDM(经PAMP处理或未经PAMP处理)的平均像素密度来计算。通过归一化错义siRNA和非PAMP处理的BMDM的平均像素密度，计算错义siRNA和PAMP处理的BMDM中细胞因子和磷酸激酶表达的倍数变化。

通过使经NETT处理的WT小鼠的平均像素密度归一化，计算经NETT处理的Het小鼠和经ETT处理的WT小鼠中细胞因子和磷酸激酶表达的倍数变化。通过使ETT处理的WT小鼠的平均像素密度归一化，计算ETT处理的Het小鼠中细胞因子和磷酸激酶表达的倍数变化。

统计学分析

数据用平均值±标准差表示。通过成对或独立Student t检验对平均值进行比较。P值<0.05被认为是显著的，*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001.。热图由GraphPadprism软件(GraphPad prism软件，加利福尼亚州圣地亚哥)生成。存活率以Kaplan-Meier曲线表示，差异通过GraphPad prism软件中的时序检验进行评估。图例中提供了每个实验的样本量。

在LPS刺激后，ABCF1介导巨噬细胞极化至M2表型：

ABCF1在激活BMDM中的TLR2(肽聚糖)和TLR9(CpG DNA)信号时负调节MyD88依赖性促炎细胞因子的产生，并在激活TLR3(聚l:C)信号时正调节TRIF依赖性抗炎细胞因子和IFNβ的产生(图27A)。因此，为了研究ABCF1是否也在早期和晚期TLR4信号和巨噬细胞极化中发挥作用，我们评估了M1和M2相关细胞表面标志物的表达。LPS和Abcf1 siRNA处理的细胞与各自的对照组相比，M1标志物如CD86和MHC-II的表达增加(图20A)。同时，与各自的对照组相比，在LPS和Abcf1 siRNA处理的细胞中，M2特异性标志物CD206的表达略微减少。

接下来，研究了BMDM中ABCF1表达的siRNA沉默是否会改变转录因子NF-KB(MyD88依赖的)和IRF3(TRIF依赖的)的激活状态。与各自的对照组相比，在存在和不存在LPS的情况下，在Abcf1 siRNA处理的细胞的核提取物中观察到p-NF-KB p65的表达升高(图27B)。相比之下，观察到IRF3二聚化(图20C)和磷酸化(图27B)减少，与LPS刺激无关。

由于巨噬细胞极化与各种细胞因子的差异表达密切相关，因此评估了ABCF1的siRNA沉默对BMDM中细胞因子分泌的影响。单独使用Abcf1 siRNA处理BMDM后，观察到M1相关促炎细胞因子的分泌增加20至40倍(图20B、28)，这意味着ABCF1的缺失表型模拟(phenocopies)了MyD88依赖的促炎信号。LPS刺激30分钟后，Abcf1 siRNA处理的BMDM分泌的促炎细胞因子是LPS处理的对照组的30～40倍。然而，无论是否有LPS刺激，在Abcf1siRNA处理的BMDM中观察到M2相关抗炎细胞因子的表达降低(图20B、28)。

缺氧诱导后，在BMDM中观察到ABCF1减少和HIF-1A表达增加(图20D)，表明ABCF1的缺失受MyD88依赖性缺氧的调节。相反，免疫印迹分析也显示，当BMDM用TNFα和IL-1β处理时，ABCF1表达降低，而当BMDM用IL-10和IFNβ处理时，ABCF1表达增加(图27E)。在肽聚糖、CpG DNA、聚肌胞苷酸和LPS刺激后，ABCF1表达与细胞因子产生相关(图20B、27A)。这共同表明，ABCF1表达通过将巨噬细胞极化为M2表型正向调节TRIF依赖性抗炎细胞因子和IFNβ的产生，而ABCF1缺失表型模拟MyD88信号，并通过将巨噬细胞极化为M1表型导致促炎细胞因子的产生。

ABCF1是一种IV类E2泛素结合酶：经Abcf1 siRNA处理和LPS刺激的BMDM的筛选确定了RING三联基序(RING tripartite motif)(TRIM)E3连接酶的调节(图20E)。先前的研究表明某些TRIM E3参与TLR4信号传导(Kawai和Akira，2011)，并通过E2泛素结合酶调节和操纵这些E3连接酶(Ye和Rape，2009)。有人假设ABCF1可能是E2Ub结合酶，尽管到目前为止，在ABC蛋白家族中还没有报道E2泛素结合活性。

用CLUSTALW服务器将小鼠ABCF1的蛋白序列与已知的小鼠E2酶序列进行比对。从此分析中，确定了ABCF1中E2s的Ub共轭催化(UBC)结构域内的高度保守区域，以及对其泛素化活性至关重要的区域。位于647位的半胱氨酸残基，其活性部位能与所有其他已知E2活性部位完全比对上(图21A)。由于ABCF1的二级结构尚未通过实验确定，因此使用同源建模工具YASPIN和APSSP服务器预测了ABCF1的计算机模拟二级结构。

尽管在整个UBC结构域保留了E2的核心拓扑结构，所有E2都有关键的催化性半胱氨酸为，但在一些成员中观察到许多结构变化，这些成员改变了E2活性位点的既定结构，这在E2酶中并不少见。与其他E2一致，同源建模表明ABCF1在其UBC结构域中包含特征性β曲折，随后是C端活性位点——β-发夹瓣状结构(以下称为“瓣(flap)”)(图21A)(Burroughs等人，2008)。ABCF1还具有一个高度保守的半胱氨酸残基，嵌入瓣的C端区域；UBC13和ATG10E2酶也是如此(Wu等人，2003)。和先前的研究一致，观察到了瓣区(图21A)(此处称为“瓣状天冬酰胺”)中存在一种保守的天冬酰胺，所述天冬酰胺与保守的半胱氨酸非常接近(7～15个残基)，而保守的半胱氨酸此前被证明与稳定酶活性部位的氧阴离子孔有关(Burroughs等人，2008)。像UBE2W一样，ABCF1也含有瓣状天冬酰胺，但这种天冬酰胺在其他E2中不太保守。在E2活性部位也存在一个位于天冬酰胺瓣上游的保守瓣状组氨酸，已知这些极性残基与催化性半胱氨酸接触并促进Ub结合(Burroughs等人，2008)。然而，在ABCF1中，活性部位的其他极性残基(精氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺)和瓣区上游的组氨酸的存在可能有助于Ub结合。或者，研究表明，标记天冬酰胺和组氨酸残基仅在少数家族中保守，这可能是因为目标E3蛋白识别的差异(Burroughs等人，2008)。这似乎是ATG10的情况，它缺乏天冬酰胺和组氨酸残基(图21A)(Burroughs等人，2008)。

E2瓣区疏水残基的存在被认为会降低活性部位的pKa并介导E2-E3结合(Capili和Lima，2007)。在图21A所示的所有E2中，发现ABCF1含有最多数量的疏水残基(共10个)。理论上，这将降低活性位点pKa并促进目标赖氨酸脱质子。ABCF1还含有高度保守的脯氨酸残基，它位于瓣区的上游，将瓣固定在β曲折处，并有助于稳定整个结构(Burroughs等人，2008)。

为了在实验上验证计算机模拟的分析，在存在和不存在E1Ub激活酶(UBA1)和辅助因子(Mg

为了证实ABCF1序列中647位保守的半胱氨酸是介导E2功能的催化性半胱氨酸，使用Abcf1 WT和Abcf1 C647S蛋白构建物(constructs)进行体外泛素化分析。同样，当在分析中使用Abcf1 WT构建物时，观察到ABCF1的表观分子量发生变化。重要的是，在Abcf1 C647S构建物中未观察到这种变化，表明这种保守的半胱氨酸在泛素化反应中起着关键作用(图21C)。

Abcf1 WT+E1+Ub泳道显示ABCF1和泛素融合并显示黄色，表示ABCF1和泛素蛋白结合，从而产生第二条更高强度的蛋白条带(图21D)。早期的研究表明，基于UBC结构域的N和/或C端延伸的存在，E2酶可分为4类(van Wijk和Timmers，2010)。ABCFT保守的半胱氨酸位于647位，根据生物信息学分析，其UBC结构域在647位之后很快终止。考虑到ABCF1长840个氨基酸，它必须包含很多N和C端延伸，这是IV类E2s的特征。综上所述，这些数据强烈暗示ABCF1是一种IV类E2泛素结合酶，在647位具有保守的催化性半胱氨酸。

ABCF1对于TLR4的内吞作用是必需的：一旦激活，TLR4就会内化到内体中，从而降低其在细胞表面的表达(Kagan等人，2008)。这种现象激活TRIF介导的信号传导，从而导致IRF3的二聚化和核易位，并随后产生IFN-I(图20)(Kagan等人，2008)。随着时间的变化，在不同浓度LPS刺激的BMDM中监测到TLR4的表面表达(即TLR4内吞作用的读数)缺失(Zanoniet al.，2011)。细胞表面TLR4的流式细胞术分析表明，在刺激后30分钟内，LPS浓度低至10ng/ml时，可观察到内吞作用(图28A、图28B)。在有或没有LPS刺激的情况下，使用siRNA沉默BMDM中的ABCF1，导致细胞表面TLR4明显增加(图28C、图28D)。在这种情况下，与未经LPS刺激的细胞相比，LPS刺激的细胞表面TLR4显著减少。LPS刺激后，内体中TLR4趋向内吞，但ABCF1的缺失有利于其在细胞表面表达(图28D)。因此，与各自的对照组相比，经Abcf1siRNA处理和LPS刺激的BMDM确实显示出细胞表面TLR4的增加，但与未经LPS处理的对应物相比，其表达显著降低(图28D)。

在没有LPS的情况下，细胞表面TLR4的这种差异引起Abcf1 siRNA处理的BMDM中促炎细胞因子、NF-KB和MAPK表达的明显升高，与错义对照组和LPS处理的对应组相比。此外，与乱序和LPS处理的BMDM相比，Abcf1 siRNA和LPS刺激的BMDM确实显示出促炎细胞因子、NF-KB和MAPK表达增加，但程度较低，这是由于这些细胞上的细胞表面TLR4比其非LPS刺激的对应物相对减少(图20、图27)。相反，在过表达WT ABCF1的BMDM中检测到的细胞表面TLR4显著减少。当BMDM被修饰以过表达ABCF1的C647S突变形式，这种现象被逆转，这表明了ABCF1介导的泛素化在TLR4内吞中的潜在作用(图28C、图28D)。

这些结果在注射LPS的Het小鼠体内得到证实。在所检查的每个时间点，CD1b

ABCF1调节从MyD88依赖的信号到TRIF依赖的信号的转变：TLR4内吞过程中从MyD88信号到TRIF信号转变的调节仍然是免疫学中的一个开放问题。ABCF1的siRNA沉默导致LPS刺激的BMDM中p-TAK1(MyD88信号相关激酶)适度增加(图27C)。相反，TRIF信号相关激酶TBK1的磷酸化显著减弱(图27C)。在有和没有LPS刺激的Abcf1 siRNA处理的BMDM中，观察到A20(MyD88信号的负调节因子)的表达减少。此外，一些MyD88信号相关激酶如MAPK激酶和MAPK特异性转录因子遵循与p-TAK1相同的磷酸化趋势，而干扰素刺激基因(ISG)特异性转录因子的TRIF依赖性产物遵循与A20相同的表达趋势(图22A，图22B)。BMDM中ABCF1的过表达证实了这些结果，显示了指示TRIF依赖信号的p-TAK1、A20、p-TBK1和p-IRF3表达的变化(图27D)。这些结果支持了ABCF1似乎对巨噬细胞响应LPS的MyD88依赖信号传导起负调节作用，而对TRIF依赖信号的传导起正调节作用这一假设。

cIAP1/2和TRAF6靶向ABCF1进行K48和K63多聚泛素化：到目前为止，数据表明ABCF1介导TLR4内吞并促进向TRIF-IFN-I信号轴的转移。由于已知TLR4信号的调节涉及关键效应物(包括TRAF3、TRAF6和cIAP1/2)的多聚泛素化(Kawai和Akira，2011，Tseng等人，2010)，因此假设ABCF1本身可能受多聚泛素化的调节。当用LPS(10ng/ml)刺激BMDM 5、10和20分钟时，我们观察到K48多聚泛素化ABCF1的表达增加(图22C)，这表明ABCF1与降解有关。还观察到，在LPS刺激30分钟后，ABCF1的多聚泛素化转移到K63连接(图22C，图22D)。这表明ABCF1似乎是被其他蛋白K48和K63多聚泛素化的靶点。LPS刺激后K48连接和K63连接的时间分别与通过MAPK和NF-KB途径的MyD88依赖信号的时间点以及30分钟时ABCF1对TLR4内吞和晚期TRIF依赖性信号的正调控相一致(图20、图27、图28)。

对ABCF1的多聚泛素化调节以及从K48连接切换到K63连接的机制寻求了更好的理解。cIAP1/2是一种E3泛素连接酶，在早期TLR4信号传导过程中介导TRAF3上K48连接的形成，所述过程抑制向晚期TRIF信号传导的过渡(Hacker等人，2011，Tseng等人，2010)。因此，假设cIAP1/2也可能以类似方式针对ABCF1进行降解。用LPS刺激BMDM 30分钟后，发现ABCF1的多聚泛素化形式主要是K63连接(图22C、D、4A)。当细胞被Smac模拟物(SM)处理时，这些联系更为普遍。Smac模拟物是一种小分子，在LPS存在30分钟的情况下迅速触发cIAP1/2降解(图23A)。在LPS刺激30分钟后，用发动蛋白抑制剂Dynasore抑制TLR4内吞，大大降低了K63连接的发生率，并广泛上调了K48连接。在LPS处理10分钟时，ABCF1连接被K48多聚泛素化(图23C、D、24A)，但SM处理导致ABCF1的K63多聚泛素化(图23A)。然而，在LPS处理30分钟时，cIAP1/2发生自降解(Tseng等人，2010)(图23A)，SM处理进一步增强ABCF1的K63多聚泛素化(图23A)。此外，单独使用Dynasore处理也导致ABCF1的K48多聚泛素化。然而，同时用SM和Dynasore处理完全消除了ABCF1的K48和K63多聚泛素化(图23A)(Tseng等人，2010)。这些结果共同表明，cIAP1/2在LPS-TLR4结合时以ABCF1为靶点进行K48多聚泛素化，这一步骤发生在TLR4内吞之前。

与此一致，观察到cIAP1/2的siRNA沉默增加了LPS刺激30分钟后BMDM中ABCF1的表达，并降低了p-TAK1(图29A)。观察到的p-TAK1的减少与之前的研究(cIAP1/2对TAK1介导的MAPK和NF-KB信号传导至关重要(Tseng等人，2010))以及数据(ABCF1对TAK1介导的MAPK和NF-KB信号传导负调控(图20、图27))一致。

TRAF6是一种E3连接酶，介导cIAP1/2和TRIF的K63多聚泛素化(Sasai等人，2010)。那么TRAF6是否也可能是晚期(TRIF依赖性)TLR4信号中观察到的ABCF1上K63多聚泛素链形成所必需的。在LPS刺激的BMDM中，发现TRAF6与ABCF1免疫共沉淀30分钟，表明TRAF6在ABCF1介导的信号传导中可能发挥作用(图29B)。接下来，进行体外泛素化试验，将各种构建物共转染到BMDM中。LPS刺激30分钟后，TRAF6的过表达能够强烈诱导ABCF1的K63多聚泛素化，而从未检测到K48连接(图23B)。这些发现表明，早期TLR4信号以ABCF1为靶点进行cIAP1/2介导的K48多聚泛素化，而ABCF1在晚期信号传导中被TRAF6K63多聚泛素化。

ABCF1参与并介导SYK和TRAF3的K63多聚泛素化：

ABCF1是E2-Ub结合酶的研究促使我们探索这种活性是否在ABCF1对TRIF依赖性信号的正调控中发挥作用。LPS刺激的BMDM免疫共沉淀研究显示，虽然ABCF1与SYK相关(图29B，C)，但未观察到与PLCγ2的相互作用(数据未示出)。进一步发现，在LPS刺激的BMDM中，ABCF1的siRNA沉默可降低p-SYK和p-PLCγ2的表达(图29E)。这表明了ABCF1沉默时先前观察到的TLR4内吞失效机制。

为了研究ABCF1的E2活性是否调节SYK，我们分析了与不同构建物共转染的BMDM中SYK多聚泛素化物的形成。在没有LPS刺激的情况下，从未检测到SYK的多聚泛素化(图23C)。LPS刺激30分钟后，在过表达Abcf1 WT、Ub-K63和Syk质粒的BMDMs中检测到SYK的K63多聚泛素化，而未观察到K48多聚泛素链。值得注意的是，当Abcf1 C647S突变质粒替换Abcf1 WT时，这些K63连接的形成受到抑制，这表明保守的半胱氨酸是泛素转移所必需的，对ABCF1的E2活性至关重要。

先前的研究表明，SYK与TRAF6相关(Lin等人，2013)，数据表明，在TLR4内吞过程中，TRAF6和SYK与ABCF1相关(图29B，图29C)，这可能意味着TRAF6-ABCF1-SYK复合物的形成。这表明，在TLR4信号传导的后期，TRAF6与靶蛋白SYK和E2酶ABCF1结合，并可能像支架一样通过ABCF1以E3-环结构域的方式帮助SYK K63多聚泛素化。

众所周知，TRAF3的多聚泛素化是TLR4-TRIF途径中的一个重要检查点，TRAF3的非经典自身多聚泛素化被认为是这一调控的关键驱动因素(Hacker等人，2011，Tseng等人，2010)。在共免疫共沉淀研究中，观察到了ABCF1和TRAF3之间的相互作用(图29B、D)。这种相互作用可能表明了E2泛素结合酶(ABCF1)与未知E3连接酶相互作用以促进其泛素部分转移到目标底物(TRAF3)的情况。

为了检测ABCF1是否以TRAF3为靶点进行多聚泛素化，将Abcf1、Traf3和泛素表达构建物共转染BMDM。只有当BMDM在LPS存在下过表达Abcf1 WT、Ub-K63和Traf3质粒时，才能观察到TRAF3的稳定K63多聚泛素化(图24A)。这种多聚泛素化反应需要K63连接，因为在所有其他测试条件下检测到的K48连接数量可以忽略不计。重要的是，当Abcf1 WT质粒被C647S突变质粒取代时，TRAF3的K63多聚泛素化被完全消除，这表明保守的催化性半胱氨酸在所述反应中起着关键作用(图24A)。这些结果表明，在LPS刺激下，ABCF1以E3环结构域样方式靶向TRAF3进行K63多聚泛素化。由于未观察到TRAF3和TRAF6之间的相互作用(数据未示出)，因此协助环结构域介导转移的E3连接酶的特性仍然未知。

先前的研究表明，TRAF3多聚泛素化依赖于其与TRIF的相互作用(Hacker等人，2011，Tseng等人，2010)。为了检测ABCF1和TRAF3之间的相互作用是否依赖于TRIF，在LPS存在或不存在的情况下，用Trif siRNA处理BMDM并免疫沉淀ABCF1。LPS刺激后，观察到ABCF1和TRAF3之间存在强烈的相互作用，TRIF的siRNA沉默并不影响这种关联(图24B)。用TrifsiRNA和LPS处理BMDM导致p-TBK1降低，证实TRIF依赖的TRAF3泛素化对下游信号传导很重要(图24B)(Hacker等人，2011，Tseng等人，2010)。因此，尽管TRIF对ABCF1和TRAF3的结合不是必需的，但可能ABCF1首先与TRAF3相互作用，然后这个复合物吸收TRIF(图29)，以TRIF依赖的方式促进ABCF1介导的TRAF3 K63多聚泛素化。

ABCF1靶向TRAF3进行K63多聚泛素化，并控制IFNβ-SIRT1依赖性脓毒症免疫治疗，从而防止脓毒症引起的死亡率：脓毒症期间，从SIRS期到ET期的转变尚不能理解。巨噬细胞被认为是这两个阶段炎性细胞因子的主要产生者(Schmauder Chock等人，1994，Ge等人，1997)，其可塑性已被证明介导疾病向TRIF依赖性ET阶段的转变(Biswas等人，2007，Biswas和Lopez Collazo，2009)。由于ABCFI控制从MyD88到TRIF信号的转变，因此假设Het小鼠中ABCF1表达的降低会削弱其在革兰氏阴性脓毒症期间经历这种转变的能力。

作为脓毒症模型，给WT和Het小鼠注射内毒素(LPS)。用内毒素(ETT-WT)预处理WT小鼠可诱导内毒素耐受，并产生指示脓毒症ET期的血清细胞因子谱。具体而言，观察到促炎细胞因子的表达减少30～50倍，吸引T细胞趋化因子(CXCL9和CXCL10)的表达减少10～20倍，T细胞增殖性细胞因子(IL-1α)的表达减少60倍。ETT-WT小鼠同时也表现出抗炎细胞因子和IFNβ的表达增加，再次重现了脓毒症的ET期。与此相反，与ETT-WT小鼠相比，ETT-Het小鼠的促炎细胞因子水平升高了40～60倍(图25A)，抗炎细胞因子的表达水平降低了20～30倍。非内毒素处理(NETT)-Het小鼠也表现出促炎症反应，但程度低于ETT-Het小鼠。ETT-Het小鼠的血清细胞因子谱表明，这些小鼠无法过渡到脓毒症的ET期，并永久处于所述疾病的高度炎症SIRS期，因此表现出细胞因子风暴的表型。

ETT-WT和ETT-Het小鼠的极化血清细胞因子谱表现为这些小鼠的存活率不同。第二次(高剂量LPS)注射后，只有55％的ETT Het小鼠存活了8小时，16小时后没有存活小鼠(图25B)。然而，到96小时研究结束时，ETT-WT小鼠的存活率为90％。相比之下，NETT-WT小鼠的存活率为60％，而在96小时结束时，只有10％的NETT-Het小鼠存活(图25B)。

为了更详细地研究先天免疫信号通路，如前所述，对这些小鼠脓毒症后体外培养的脾巨噬细胞中关键激酶和转录因子信号的表达进行了分析(den Haan和Kraal，2012，Deng等人，2004)。与ETT-WT相比，ETT-Het小鼠的脾巨噬细胞显示p-TAK1表达增加，A20和p-IRF3表达减少(图30A)。与SPDM一样，脓毒症后体外培养的BMDM也被证明是通过骨髓造血依赖性变化调节脓毒症免疫治疗的(Muthu等人，2008)。骨髓是造血的中心，它产生循环的(Sunderkotter等人，2004)和组织驻留的巨噬细胞(Davies等人，2013)。骨髓祖细胞转化为巨噬细胞需要2～5天才能进入循环。一旦进入循环，在第2～3天及以后，外周血巨噬细胞引发的免疫反应很可能是骨髓单核细胞早期出现变化的反映(Muthu等人，2008，Sunderkotter等人，2004)。与ETT-WT小鼠相比，ETT-Het小鼠在第二次LPS注射后16小时内死亡，ETT-WT小鼠在96小时后仍有90％的存活率(图25B)，这表明在这些小鼠中发现的异常是由于骨髓的变化，可能是ABCF1依赖性的。因此，决定研究BMDM和骨髓移植在脓毒症引起的炎症和死亡中的作用。与脾脏巨噬细胞一样，与ETT-WT小鼠相比，ETT-Het小鼠的BMDM也显示p-TAK1增加，A20表达减少(图25C)。ETT-Het BMDM中MyD88依赖性信号和ETT-WT BMDM中TRIF依赖性信号的主导分别模拟了脓毒症SIRS和ET期这些信号通路的活动。

先前的研究也显示了SIRS期脓毒症的调节以及骨髓移植引起的脓毒症死亡(Lorigados等人，2018，Huang等人，2017)。据推测，骨髓来源的造血细胞中ABCF1缺乏是导致脓毒症易感性增加的原因。因此，进行了骨髓移植(BMT)实验，其中Het骨髓向WT动物和WT骨髓向Het动物相互转移，并对脓毒症诱导的发病机制进行了评估。按照上述进行BMT，检查骨髓的重新填充(图31A)，并监测细胞因子谱和死亡率。即使没有任何内毒素处理，Het小鼠产生的促炎细胞因子的产生也比同窝野生型小鼠增加(图31B)。内毒素处理后，接受Het骨髓(BMT-ETT-Het)的WT小鼠显示出与ETT-Het小鼠相同的细胞因子风暴表型(图31B)。这些小鼠比普通野生型小鼠更容易受到内毒素感染，并在第二次(高剂量LPS)注射后14小时内死亡(图31C)。这一时间线与ETT-Het小鼠相似，后者在16小时时死亡(图25B)。而接受WT骨髓(BMT-ETT-WT)的Het小鼠表现出与ETT-WT小鼠相同的内毒素耐受表型，并且即使在96小时结束后也显示出100％的存活率(图31C)。这些数据支持造血系中ABCF1基因缺陷转移了内毒素诱导脓毒症易感性的结论，表明ABCF1是脓毒症发病机制的关键负调节因子。

早期数据表明，ABCF1对于从MyD88依赖性信号向TRIF依赖性信号的转变以及TRAF3介导的IRF3依赖性IFN-I的产生至关重要(图24)。因此，为了研究IFNβ在脓毒症期间的免疫治疗效果是否取决于ABCF1的活性，研究了ABCF1在脓毒症期间靶向TRAF3进行泛素化的可能性。ETT Het BMDM的IB分析显示TRAF3的K48多聚泛素化增加，表明这些蛋白注定要进行蛋白酶体降解，进而激活SIRS的MyD88通路特征(图25D)。相反，在ETT-WT BMDM中观察到TRAF3的K63多聚泛素化增加，表明ET期特征性TRIF-IFN-I通路激活(图25D)。在ETT-WTBMDM中也观察到p-IRF3(图25C)、IRF3二聚体(图25E)和IFNβ(图25A)表达升高，而在ETT-Het BMDM中未观察到IRF3二聚体，IFNβ减少30～40倍。这些结果支持这样的假设，即ABCF1似乎是TRAF3激活(K63多聚泛素化)和随后的IRF3磷酸化和二聚化所必需的，最终导致产生LPS诱导的脓毒症中一种至关重要的保护性细胞因子IFNβ。

IFNβ在脓毒症期间的保护作用被认为取决于其对JAK-STAT通路的正向调节，从而产生SIRT1(Yoo等人，2014)。我们观察到p-STAT转录因子的表达减少了50～70倍(图26B)，ETT Het BMDM中缺少SIRT1(图25C)。此外，在ETT-Het小鼠的BMDM中观察到p-NF-KB p65增加(图7A)，表明即使是ABCF1的单个等位基因也不足以维持SIRT1表达，进而通过NF-KB p65调节炎症。因此，ABCF1似乎在脓毒症的SIRS到ET转变期间控制从MyD88依赖性信号到TRIF依赖性信号的转变，促进IFNβ依赖性SIRT1的产生。

生理学上，脓毒症诱导的小鼠骨髓基质细胞中ABCF1的表达与其死亡率相关。高剂量LPS注射后8小时和16小时死亡的ETT Het小鼠的BMDM表达了可忽略不计的ABCF1和p-IRF3(图30B)。与未经处理的WT小鼠相比，在高剂量LPS注射后32和40小时，NETT Het小鼠BMDM表现为ABCF1的表达和p-IRF3的表达分别减少90倍和85倍。此外，NETT-WT小鼠的死亡率也与ABCF1和p-IRF3表达降低相关(图30B)。ETT-WT组在96小时研究结束时的存活率增加了90倍，组中只有一只小鼠死亡(72小时)。与未经处理的WT BMDM相比，所述小鼠BMDM的ABCF1增加35倍，p-IRF3增加65倍，但由于体重减轻超过20％，因此必须实施安乐死(UBC-CCAC，Star法)。相比之下，与未经处理的WT组相比，观察到在96小时研究中存活的ETT-WT小鼠BMDM中ABCF1升高47倍，p-IRF3升高72倍(图30B)。因此，在大剂量LPS注射后，ABCF1表达与p-IRF3和小鼠存活率相关，并使小鼠免于SIRS介导的死亡。

ETT Het小鼠的BMDM经历了大量的细胞焦亡：虽然半胱天冬酶3介导的免疫细胞凋亡是脓毒症ET期继发感染的主要原因(Hotchkiss等人，2003)，但半胱天冬酶1依赖性细胞焦亡是脓毒症SIRS期免疫细胞死亡的主要原因(Jorgensen和Miao，2015)。ETT Het小鼠的血清细胞因子表现出与细胞因子风暴一致的表型，IL-1β、HMGB1、IL-6和TNFα的表达升高(图25A)。与ETT-WT BMDM相比，ETT-Het小鼠的BMDM也显示NLRP3、ASC和活化型半胱天冬酶-1的表达升高，以及活化型半胱天冬酶3的表达降低(图25C)。此外，还观察到ETT Het小鼠的BMDM中凋亡相关激酶(如AKT)的磷酸化降低(图30C)。在用Abcf1特异性siRNA处理的LPS刺激的BMDM中也观察到类似的细胞焦亡趋势(图30D)。这些结果表明，ABCF1在脓毒症期间BMDM从细胞焦亡向凋亡细胞死亡途径的转变中起着重要作用。

ABCF1单倍剂量不足小鼠在SIRS期出现肾循环衰竭：

在持续性循环衰竭的背景下，循环促炎细胞因子的表达增加与多器官衰竭相关(Varpula等人，2005)。在SIRS期间，内毒素血症导致TNFα上调，从而改变肾脏微循环和血流动力学，并导致急性肾损伤(Ramseyer和Garvin，2013，Doi，2016)，最终导致死亡(Harty，2014)。

注射高剂量LPS的ETT Het小鼠无法离开SIRS期，并显示促炎细胞因子上调50至60倍(图25A)。通过测定血清降钙素原的表达也证实了这一点。与WT小鼠相比，ETT Het小鼠的血清降钙素原表达显著增加(图26C)。对这些小鼠进行的组织学分析显示，它们肾脏中的小血管广泛扩张和充血(图30E)。此外，这些图像清楚地描绘了红细胞(黑色箭头所示)在扩张或充血的血管中聚集在一起的“淤积”效应。这种形式的系统性脉管扩张和充血造成血压严重下降，导致血液和氧气不足，无法到达关键的中枢器官，包括大脑和心脏。与ETT-WT小鼠相比，ETT-Het小鼠的肾脏表现出更大的淤血和血管扩张，表明血管充血增加，从而导致严重低血压。ETT Het小鼠的血清L-乳酸表达和血清肌酐水平也有所增加(图26D，E)。这表明ETT-Het小鼠因降钙素原或细胞因子水平升高导致的高血压性肾损伤而死亡。此外，骨髓移植小鼠也表现出相同的表型，其中与野生型小鼠相比，BMT-ETT-Het小鼠的血清降钙素原、L-乳酸和肌酐显著增加(图31D、E、F)。总的来说，这些数据支持SIRS期生存率依赖ABCF1的结论。

讨论

脓毒症是一种双期炎症性疾病，其免疫调节及SIRS和ET期之间的转变分子机制仍在确立之中。我们试图确定LPS-TLR4信号的天然免疫调节因子，并发现ABCF1作为一种分子开关，在革兰氏阴性脓毒症期间介导从MyD88相关细胞因子风暴表型(SIRS)到TRIF相关内毒素耐受表型(ET)的转变。

此处，发现了一种控制巨噬细胞这种转变的E2泛素结合酶ABCF1。ABCF1缺陷型巨噬细胞在TLR4内吞作用上存在缺陷，并且不能在LPS刺激下从MyD88依赖性信号转变为TRIF依赖性信号。因此，它们主要产生NF-KB特异性和MAPK特异性促炎细胞因子，导致M1样表型。此外，在内毒素诱导的脓毒症期间，Het小鼠无法从SIRS期过渡到ET期，表现出血清中MyD88相关促炎细胞因子的过度表达，细胞焦亡途径的激活，最终表现出肾循环衰竭，导致过早死亡。这些数据支持以下结论：在生理学上，ABCF1的表达通过将巨噬细胞极化为M2表型，增强TRIF依赖性抗炎细胞因子和IFND的产生。相反，ABCF1的缺失表型模拟MyD88信号，并通过将巨噬细胞极化为M1表型导致促炎细胞因子的产生。

在TLR4信号传导过程中，ABCF1能够以SYK为靶点进行K63多聚泛素化，并正向调节SYK和PLCγ2磷酸化，随后介导TLR4内吞作用。需要进行进一步研究以确定SYK的这种多聚泛素化是否对其磷酸化(反之亦然)和随后的TLR4内吞介导很重要。这一观察结果提出了ABCF1还可能调节SYK介导的其他受体(树突状细胞相关C型凝集素1(Dectin-1)，FcγRs)的内吞作用的可能性。由于已知IFN-I在某些病毒感染期间具有保护作用，并可对抗癌症进展，ABCF1-IFN-I信号轴可能是治疗干预的一个有吸引力的靶点。

LPS内毒素是革兰氏阴性脓毒症的有效触发因素。通过在相互骨髓移植后对WT和Het小鼠进行内毒素处理，确定了脓毒症的易感性取决于造血室的基因型，对脓毒症的抵抗力增加取决于造血室中ABCF1的表达。因此，ABCF1通常起到对致命性感染性休克的抑制作用。

先前的研究已经将ABCF1定位为类风湿性关节炎和自身免疫性胰腺炎的风险因子基因(Ota等人，2007，Richard等人，1998)。此外，最近的全基因组关联研究也将ABCF1与痛风风险(Dong等人，2017)和克罗恩病(Hindorff等人，2009)联系起来。先天性免疫反应的失调被认为是这些免疫疾病预后的一个关键因素，目前的研究重点是调节巨噬细胞分泌细胞因子。鉴于ABCF1负向调节MyD88依赖性TLR2和TLR9信号，正向调节TRIF依赖性TLR3信号，并在TLR4信号传导过程中对MyD88到TRIF的转变至关重要，ABCF1可能调节这些自身免疫性疾病中的固有免疫反应、巨噬细胞极化和细胞因子的产生。需要进一步的工作来理解ABCF1在这些疾病调控中的确切作用。

实施例5：

用已建立的小鼠模型，ABCF1水平降低对克罗恩病(CD)发展的影响：先前已经描述了一种CD小鼠模型，其中已知鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)SL1344在小鼠中引起系统性伤寒样疾病。已经在小鼠中建立了一个模型，其中持续位于肠道内皮细胞的减毒aroA突变体(SL1344ΔaroA)用来引起类似CD的局部炎症状态。用抗生素破坏局部菌群可使鼠伤寒沙门菌定植于局部肠道内皮细胞，从而在野生型(WT)C57BI/6J动物(被认为是ABCF+/+)中建立慢性感染模型。此前，发现MyD88-/-小鼠的肝脏和脾脏中的系统性细菌数量高于WT小鼠，而结肠中的细菌数量似乎与WT小鼠中的细菌数量相似，这意味着MyD88-/-小鼠无法控制细菌感染。有趣的是，在WT小鼠中观察到的组织损伤量更为显著，杯状细胞耗竭率更高(结肠上皮完整性受损)，纤维化程度更大。在ABCF1+/-模型中，预计系统中ABCF1数量的减少将导致对细菌感染的高度免疫反应。在ABCF1+/-小鼠中，由于强烈的炎症反应，预计会出现更显著的促炎细胞因子产生和疾病严重程度，同时看到总体细菌负荷减少。

使用已建立的小鼠感染模型研究ABCF1水平升高对CD发展的影响：在先前对LPS刺激的ABCF1+/-小鼠的研究中，发现ABCF1缺乏导致细胞因子风暴性炎症。预计鼠伤寒沙门氏菌感染后也会出现类似的结果，因此，将ABCF1添加回感染部位是否是改善这种状况的潜在方法将有待测试。表达ABCF1基因的腺病毒载体将用于感染小鼠模型中的局部肠道上皮和一些浸润性免疫细胞，并且这些细胞中的ABCF1表达将增强。人们期望它能缓和炎症环境，减少组织病理变化。

ABCF1对鼠伤寒沙门氏菌感染的反应的细胞途径：先前的研究表明，经LPS处理的ABCF1+/-小鼠的血清细胞因子表现为细胞因子风暴表型，IL-1βHMGB1、IL-6和TNFα水平急剧升高。

与LPS处理的WT小鼠相比，从这些小鼠分离的骨髓源性巨噬细胞(BMDM)也显示出NLRP3、ASC和活化型半胱天冬酶1蛋白水平升高，活化型半胱天冬酶3水平降低，表明了细胞焦亡介导的细胞死亡而非凋亡。细胞焦亡(一种程序性细胞死亡的高度炎症形式)，可由LPS以外的其他病原体相关分子模式(PAMP)引起。这与CD有关，因为过度的细胞焦亡可能会将系统推向慢性炎症状态。分离先前感染过鼠伤寒沙门氏菌(如上所述)的WT和ABCF1+/-小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞。如前所述，骨髓成熟为巨噬细胞，并研究骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)对细菌感染的反应。检查M1和M2特异性标志物以及细胞因子谱。

药物艾司西酞普兰在对抗CD期间的明显炎症方面的潜在益处：用艾司西酞普兰处理鼠伤寒感染ABCF1+/-小鼠，以增加ABCF1的表达，并检查从加剧的MyD88炎症信号向TRIF依赖性信号的转变。

最近的发现表明，ABCF1作为一种分子开关，通过促进导致炎症状态缓解的TRIF依赖性抗炎信号通路，负调节MyD88依赖性促炎信号通路。这些途径位于炎症性肠病发病机制的中心地位。通过增加已知的ABCF1增强子的表达(即艾司西酞普兰)，可能提供新的方法来解决炎症性疾病，进而影响克罗恩病患者的健康。

实施例6：

ABCF1在通过ABCF1异质小鼠构建的脓毒性休克模型中的保护作用已经被明确。然而，与野生型小鼠的60％相比，只有10％的ABCF1(+/-)小鼠在高剂量LPS攻毒后存活96小时。ABCF1(+/-)小鼠无法从炎症期转变到内毒素耐受期，因此出现了过度的促炎症反应，最终导致肾循环衰竭和过早死亡。评估了ABCF1在鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠CD发育中的作用，而没有在单独注射LPS的情况下评估。此外，先前的研究表明，经LPS处理的ABCF1(+/-)小鼠的血清细胞因子表现为细胞因子风暴表型，IL-1βHMGB1、IL-6和TNFα水平急剧升高。与LPS处理的WT小鼠相比，从这些LPS处理的ABCF1(+/-)小鼠分离的巨噬细胞也显示出NLRP3、ASC和活化型半胱天冬酶1蛋白水平升高，活化型半胱天冬酶3水平降低，表明了细胞焦亡介导的细胞死亡而不是凋亡。除LPS外，其他病原体相关分子模式(PAMP)也可引发细胞焦亡(程序性细胞死亡的高度炎症形式)。这与CD有关，因为过度的细胞焦亡可能会将系统推向慢性炎症状态。最后，以前的研究表明，ABCF1(+/-)小鼠骨髓来源的巨噬细胞极化为促炎M1表型，而LPS处理使这种极化加剧。测试ABCF1、艾司西酞普兰和NLRP3炎性体抑制剂MCC950在感染不同剂量减毒革兰氏阴性活菌后对巨噬细胞或小胶质细胞的细胞因子产生、存活和极化的影响(与LPS处理相比)。

实验：

细菌生长：在CD模型中，用抗生素预处理小鼠，然后通过口服灌胃感染鼠伤寒沙门菌菌株SL1344ΔaroA培养物(3×10

疾病严重程度：在感染期间，每天对小鼠进行监测，并记录至少7天的疾病迹象(如体重减轻、体温过低、粪便松软或松散、没有梳理行为)。如果疾病变得太严重，则按照动物护理指南对小鼠实施安乐死。

细胞因子分析：在第3天和第7天从上述小鼠的血液中分离血清，并用小鼠炎症流式微珠芯片试剂盒测定C反应蛋白(Creactive protein)和细胞因子水平。使用Quantikine小鼠IL-1β/IL-1F2 ELISA试剂盒分析血清IL-1β的产生。

细菌计数和组织学：在感染后第3天和第7天对感染小鼠实施安乐死，并采集组织(结肠、肝脏、大脑、脾脏)进行鼠伤寒沙门氏菌载量量化和组织学收集。

细菌载量：将收集的组织(结肠、肝脏、大脑、脾脏)称重并放入冰上的无菌PBS中，并进行机械均质。将连续稀释的匀浆置于LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。24小时后计数菌落。

炎症组织学：对肠道环境中发生的炎症进行分析，并比较ABCF1(+/-)和WT小鼠。从感染SL1344DaroA前后的小鼠中提取切除的结肠样本，将组织固定在10％福尔马林中过夜，然后石蜡包埋，并在切割成5μM切片之前储存在70％乙醇中。组织将使用苏木精-伊红染色切片对以下参数进行评分：多形核白细胞浸润；杯状细胞数量；上皮完整性；粘膜下水肿。

e.免疫细胞分析：

i)外周血免疫细胞：

对血液中免疫细胞的分析使我们能够追踪ABCF1(+/-)小鼠与WT小鼠中细胞的总数和比率(例如CD4/CD8 T细胞)以及激活状态。从感染SL1344DaroA前后的小鼠中采集外周血样本，并使用流式细胞术分析整体细胞组成。使用流式细胞术评估PBMC(包括从ABCF1(+/-)和WT同窝对照获得的淋巴细胞、NK细胞和单核细胞)的活化标志物(例如CD69、IAb)、记忆标志物(例如CD62-L、CD44、CD127)和耗竭标志物(例如PD-1、CTLA-4)的表达。我们将通过特定标志物染色确定免疫细胞群的总数：B细胞(例如CD19、B220、IgM、IgD、CD20、CD40、CD138和IAb)；CD4+T细胞(如CD4、CD25、CD44和CD62L)；CD8+T细胞(如CD8、CD25、CD44、CD62L、PD-1和CD127)；单核细胞(如CD11b、F4/80)；和NK细胞(如CD335、CD69)。使用流式细胞术检查巨噬细胞和小胶质细胞M1到M2的偏移。检查促炎和抗炎细胞因子的产生。

ii)炎症组织学：结肠、肝、肺、脑和脾脏组织也将进行染色，以确定是否存在浸润性免疫细胞和细胞因子生成。组织切片将嵌入干冰上的Tisson Tek O.C.T.培养基(Sakura)中，并立即在-80℃下储存，直至切片。将在徕卡低温恒温器上收集10微米(10μm)厚的切片，并将其固定在冷丙酮或丙酮：甲醇中。在Tris缓冲盐水(TBS，pH7.4)中洗涤后，将载玻片与蛋白块一起培养，随后与特异性抗体一起培养过夜(例如T细胞：CD4、CD8、FoxP3；B细胞：CD19、CD45R、B220；粒细胞：Ly-6G；单核细胞：CD1B、Mac-1；NK细胞：CD335；细胞因子IL-6、IL-1β、TNFα、INFγ、INFβ和IL-10)。适当的辣根过氧化物酶(HRP)结合的二级抗体用于检测一级抗体，并用DAB显色剂显色。玻片用苏木精和伊红(H&E)复染，并在乙醇和二甲苯中脱水。吉姆萨染色将用于检测嗜酸性粒细胞。幻灯片将使用放大20倍至40倍的光学扫描镜成像。

研究ABCF1(+/-)小鼠克罗恩病期间ABCF1在MyD88依赖性介导的免疫信号中的作用：SL1344DaroA处理的WT和ABCF1(+/-)小鼠以及LPS处理的对照WT和ABCF1(+/-)小鼠的巨噬细胞和小胶质细胞在存在和不存在艾司西酞普兰或MCC950的情况下培养，并使用抗IKB抗体进行蛋白印迹评估这些细胞释放到细胞核中的NF-KB水平。上述小鼠的巨噬细胞也将用于分析各种MAPK和c-Jun转录因子的水平。MAPK和NF-KB及c-Jun转录因子水平的增加将有助于确定ABCF1对CD中MyD88依赖性信号传导的调控。

克罗恩病期间ABCF1在巨噬细胞极化中的作用：先天性免疫调节剂引起的肠粘膜上皮炎症通常由M1巨噬细胞控制。为了研究ABCF1是否控制这种机制，通过流式细胞术检测小鼠巨噬细胞和小胶质细胞中M1特异性标志物(如CD80、CD86、HCII)和M2特异性标志物(如CD206)的水平。SL1344DaroA处理的ABCF1(+/-)小鼠巨噬细胞中M1特异性标志物水平升高，M2特异性标志物水平降低。

ABCF1在克罗恩病NLRP3炎性体调节中的作用：已有研究表明，在脓毒症模型中，ABCF1对LPS的响应是负调节巨噬细胞中的NLRP3炎性体、ASC和半胱天冬酶1。为了研究ABCF1在CD期间如何调节NLRP3，分离鼠伤寒沙门氏菌SL1344DaroA处理的WT和ABCF1(+/-)小鼠的巨噬细胞和小胶质细胞，并通过蛋白印记评估NLRP3炎症体、ASC和半胱天冬酶1的水平。

细胞焦亡：细菌感染可导致不同类型的细胞死亡，正如先前报道的那样，在脓毒症的内毒素耐受期，半胱天冬酶3介导的免疫细胞凋亡很普遍，但是半胱天冬酶1依赖性细胞焦亡是感染细胞内细菌时免疫细胞死亡的主要原因。因此，通过免疫印迹分析上述巨噬细胞和小胶质细胞的凋亡相关蛋白(CASP-3)和细胞焦亡(CASP-1、NLRP3、ASC)相关蛋白的表达。这些实验将为ABCF1是否能对抗过度的细胞焦亡提供证据，而细胞焦亡会加重CD的慢性炎症状态。

实施例7：ABCF1水平降低对类风湿性关节炎(RA)疾病发展的影响。

据预测，与对照野生型(WT)小鼠相比，当使用RA实验模型诱导这些小鼠时，ABCF1+/-小鼠模型中ABCF1的缺失将导致更严重的炎症状态。

实验：

ABCF1研究模型：为了研究ABCF1在发育和疾病中的表达和功能，使用了前面描述的ABCF1基因敲除小鼠模型。

RA的诱导和疾病严重程度：ABCF1+/-小鼠和野生型(WT)小鼠群(cohorts)用II型鸡或牛胶原蛋白(CM)进行免疫，然后通过肉眼检查监测胶原诱导的关节炎(CIA)的进展。雄性和雌性小鼠(年轻：3个月以下，年老：8个月以上)将在以下实验中进行研究。

在用100μg二型胶原蛋白(CII)和100μg热灭活结核分枝杆菌免疫小鼠后的第10至25天，通过评估行走能力、筛选踝关节、腕关节和小指间关节部位的皮肤红肿来评估所述疾病，以获得关节炎指数。使用所述指数，每个爪子受累的严重程度可以从0分到4分。对疾病发展的额外监测涉及小鼠体重测量和关节组织的组织学检查。用水置换测量后爪体积的增加，并通过使用测厚卡尺测量厚度量化后爪的膨胀。根据动物护理指南，如果疾病变得太严重，老鼠将被安乐死。ABCF 1+/-小鼠CIA的发生和进展能证实ABCF1参与RA。

细胞因子分析：在接种后第10天和第25天从上述小鼠中分离血清(50μl)和踝关节提取物(10μl)，并使用小鼠炎症流式微珠芯片试剂盒(流式微珠芯片)测定细胞因子水平(包括：IL-6、IL-10、MCP-1、TNFα、IFNγ和IL-12)。使用Quantikine小鼠IL-1β/IL-1F2ELISA试剂盒(Quantikine ELISA)分析血清IL-1β的产生。与野生型小鼠相比，ABCF1+/-中的细胞因子产生预计会增加，这表明ABCF1对细胞因子产生负调节。

CII处理小鼠踝关节浸润巨噬细胞的组织学检查。为了测定CII处理小鼠踝关节中巨噬细胞浸润的水平，如上所述用CII免疫ABCF1+/-小鼠及其WT对照。在接种后第10天和第25天，处死小鼠，将踝关节石蜡包埋、切片并用抗体(包括靶标：CD11b和F4/80)染色。在1000倍放大镜下，在油浸没下，对六个代表性血管翳和滑膜区域的阳性细胞(巨噬细胞)数量进行计数。比较ABCF1+/-小鼠和WT对照组踝关节中巨噬细胞的相对数量，这些数据可能暗示ABCF1在抑制先天免疫反应和炎症诱导的浸润中的作用。

外周血免疫细胞：通过分析血液中的免疫细胞，我们可以追踪ABCF1+/-小鼠和WT小鼠中细胞的总数、比率(即CD4/CD8 T细胞)和激活状态。将从RA前、RA后的小鼠中采集外周血样本，并使用流式细胞仪分析整体细胞组成。从ABCF1+/-和WT同窝对照获得的外周血单个核细胞(PBMC，包括淋巴细胞、NK细胞和单核细胞)将使用流式细胞术评估活化标志物(例如CD69、l-Ab)、记忆标志物(例如CD62-l、CD44、CD127)和耗竭标志物(例如PD-1、CTLA-4)的表达。将通过使用谱系标志物染色来确定细胞群的组成：B细胞(例如CD19、B220、IgM、IgD、CD20、CD40、CD138和MHC-II)；CD4+T细胞(如CD4、CD25、CD44和CD62L)；CD8+T细胞(如CD8、CD25、CD44、CD62L、PD-1和CD127)；单核细胞(如CD1b、F4/80)；和NK细胞(CD335、CD69)。

T细胞和B细胞反应的检查：在CII免疫小鼠后，测量B细胞和T细胞反应。与大多数抗原系统一样，T细胞对CII的反应在第10至12天左右达到峰值，并在免疫后第25天进行监测。血清抗体水平达到峰值的时间在与关节炎严重程度峰值时间一致，抗体水平与RA的存在或不存在密切相关。为了检测B细胞反应，将使用标准间接ELISA测定CII特异性抗体浓度，其中CII被吸收到平板上。通过增殖试验和使用固相ELISA产生IFN-β来评估T细胞对CII的反应。用从对照组或C处理组(用全长CII或CII肽作为抗原免疫，氚标记胸苷)小鼠获得的引流淋巴结细胞或脾细胞，通过标准微量滴度试验测定T细胞对CII的增殖反应。此外，通过测定IFN-γ的产生来评估T细胞的刺激。一些商业ELISA试剂盒也可用于测定小鼠IFN-γ水平。通过监测ABCF1+/-小鼠中的抗体水平、T细胞增殖和IFN-γ产生来检查T和B细胞反应，可以进一步证明ABCF1异质性的缺失有助于CIA的发生和进展。

IFNβ-1b药物在对抗RA期间明显炎症方面的潜在益处：

众所周知，TNFα诱导后，ABCF1基因在人滑膜细胞中显著上调。IFNβ-1b是一种具有广泛生物活性的细胞因子，用于丙型肝炎和黑色素瘤的治疗。它调节许多参与抗病毒和抗增殖活动的基因。它通过JAK-TYK2途径激活STAT1转录因子发挥作用，并通过IRF3和IRF9产生IFN-I。这种转录因子随后转移到细胞核，在那里它将转录参与细胞周期控制、细胞分化、凋亡和免疫反应的几个基因。在ABCF1+/-小鼠中用IFNβ-1b治疗RA可能使产生的免疫表型从MyD88介导的高度炎症反应转变为保护性TRIF介导的抗炎反应。在CIA诱导前或胶原接种后一天给WT和ABCF1+/-小鼠皮下注射不同浓度的IFNβ-1b(每只小鼠0.5、1、2、4、5μg，与用于治疗肝炎的浓度相似)。如上所述分析由此产生的疾病严重程度、细胞因子产生和炎症。

在ABCF1+/-模型中，预期小鼠中ABCF1表达水平的降低将导致对RA的高免疫反应。在ABCF1+/-小鼠中，由于强烈的炎症反应，预计会出现更显著的促炎细胞因子产生和疾病严重程度，同时看到总体细菌负荷减少。IFNβ-1b处理可通过将小鼠体内的炎症反应途径从MyD88依赖性炎症信号向TRIF依赖性信号(干扰素-l产生)转变来减轻炎症反应。在接种CII前用IFNβ-1b处理可用于检测预防性刺激ABCF1表达是否可作为治疗策略，而接种后处理可用于检测感染后的治疗效果。其他ABC转运蛋白可以通过药物治疗进行修饰的事实进一步表明，ABCF1可能是用于改变炎症过程结果一个特别有用的靶点。

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