用于制备GalNAc亚磷酰胺差向异构体的方法

摘要

本发明包括一种用于制备式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体、其对应的对映异构体和/或旋光异构体的方法，其中R1为羟基保护基，n为0至10的整数，且m为0至20的整数，以及该方法用于制备GalNAc‑簇寡核苷酸缀合物的用途。

说明书

本发明涉及用于制备差向异构纯的式I的GalNAc亚磷酰胺(phosphoramidite)差向异构体、其对应的对映异构体和/或旋光异构体的新型方法，

其中R

式I的GalNAc亚磷酰胺携带GalNAc部分，该GalNAc部分是包含GalNAc部分的缀合物的靶向部分。GalNAc部分，由于其与位于肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体的亲和力，能够将寡核苷酸缀合物功能性递送到肝细胞。此类GalNAc簇缀合物具有充当药代动力学调节剂的潜力，且因此是有治疗性价值的化合物，如例如在PCT出版物WO 2017/084987中描述。

由于GalNAc部分和亚磷酰胺的独特组合，式I的GalNAc亚磷酰胺可以在固相寡核苷酸合成中直接作为结构单元连同核苷结构单元一起引入。因此，可以避免引入GalNAc部分的单独的缀合步骤。

根据PCT出版物WO 2017/084987中所述的当前方法，式I的GalNAc亚磷酰胺，可以通过以下步骤制备：

a)式A的GalNAc酸衍生物

其中R

与式IV的胺的反应

其中R

其中R

b)除去羟基保护基R

其中R

c)将式D的GalNAc酰胺与亚磷酰胺化剂(phosphoroamidating agent)反应以形成式I的GalNAc亚磷酰胺衍生物。

发现该方法在偶联步骤a)中导致指定的手性中心(在下式I中的箭头)处的外消旋作用。

因此，本发明的目的是提供一种新型方法，以生产呈差向异构纯形式的结构单元。

可以通过用于制备差向异构纯的式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体的新型方法实现该目的，该方法包含

a)偶联式II化合物，

其中R

与式III的GalNAc部分

其中R

其中R

b)除去羟基保护基R

c)将式IV的GalNAc酰胺的游离醇与亚磷酰胺化剂反应以形成式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体。

阐述以下定义以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。

当化学结构中存在手性碳时，意指与该手性碳相关联的所有立体异构体都涵盖于作为纯立体异构体以及其混合物的结构中。

术语差向异构体表示一对立体异构体中的一种，其中异构体在仅在一个立体中心处的构型不同，并且其中分子中的所有其他立体中心是相同的。

术语“C

“C

术语“酰基”表示与烷基连接的羰基。该术语特别地代表C

术语“羟基保护基”表示旨在保护羟基的基团，并且包括酯形成基团和醚形成基团，特别是四氢吡喃基、酰基(例如苯甲酰基、乙酰基、氨基甲酰基)、苄基和甲硅烷基醚(例如TBS、TBDPS)基团。这些基团的其他实例可以见于T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”，第2版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，1991，第2-3章；E.Haslam，“Protective Groups in Organic Chemistry”，J.G.W.McOmie，编辑，Plenum Press，New York，NY，1973，第5章，和T.W.Greene，“Protective Groups inOrganic Synthesis”，John Wiley and Sons，New York，NY，1981。

术语“氨基保护基”表示旨在保护氨基的基团，并且包括苯甲酰基、苄氧基羰基、羰基苄氧基(CBZ或Z)、9-芴基甲氧羰基(FMOC)、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(BOC)和三氟乙酰基。这些基团的其他实例可以见于T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第2版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，1991，第7章；E.Haslam，“Protective Groups in Organic Chemistry”，J.G.W.McOmie，编辑，Plenum Press，New York，NY，1973，第5章，和T.W.Greene，“Protective Groups inOrganic Synthesis”，John Wiley and Sons，New York，NY，1981。

式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体优选为以下的那些：其中R

在更优选的实施例中，式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体包括式Ib至式Ie的化合物。

甚至更优选的是式Ib和式Ic的差向异构体。

步骤a)的特征在于偶联式II的化合物或其盐与式III的GalNAc部分以形成式IV的GalNAc酰胺。

式II的化合物或其盐可以通过以下步骤制备：

a1)偶联式V的赖氨酸化合物

其中R

其中R

以形成式VII的羧酰胺；

其中R

b1)除去氨基保护基R

其中R

c1)偶联式VIII的胺与氨基受保护的赖氨酸以形成式IX的二肽

其中R

d1)除去氨基保护基R

在优选的实施例中，偶联步骤a1)和c1)在肽偶联剂、胺碱和有机溶剂的存在下进行。

偶联可以遵循本领域技术人员已知的经典方法，使用碳二亚胺偶联剂，如DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)或EDC(N-(N',N”-二甲基氨基丙基-N'-乙基碳二亚胺)，有或没有添加剂如HOBt(1-羟基苯并三唑)或HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)、TBTU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸盐)、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)或HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)及其常见组合(诸如TBTU/HOBt或HBTU/HOAt)。

在优选的实施例中，将正丙基膦酸酐(T3P)选择为偶联剂连同叔胺作为胺碱，如三乙胺、N-甲基吗啉或N-二异丙基乙基胺，但优选连同N-二异丙基乙基胺。

偶联反应通常发生于在20℃和70℃的范围内、优选在20℃和40℃的范围内的反应温度下在极性非质子溶剂如乙腈、乙酸乙酯或四氢呋喃或其混合物中。

来自偶联步骤a1)和c1)的产物可以从反应混合物的有机层应用本领域技术人员已知的方法例如通过洗涤有机相并随后通过蒸发除去溶剂而获得。

氨基保护基R

氨基保护基R

因此，除去氨基保护基R

在优选的实施例中，应用了甲磺酸。

酸性处理形成与相应的酸的式IX的二肽的三铵盐，针对优选实施例为与甲磺酸的式IX的二肽的三铵盐。

式IX的二肽的三铵盐可以通过应用本领域技术人员已知的方法(诸如结晶)分离或者直接应用于步骤b)中与式III的GalNAc部分的偶联。

式III的GalNAc部分可以根据PCT国际出版物WO 2017/084987中的公开内容、特别是根据其实例7来制备。

式II的化合物或其盐的最终偶联，诸如式IX的二肽的三铵盐与式III的GalNAc部分的最终偶联可以在上述偶联条件下进行。此外，上述优选的反应条件可应用于该偶联反应。

式IV的GalNAc酰胺可以通过反相色谱法进一步纯化，并可以将含有产物的级分例如冻干以获得纯化的式IV的GalNAc酰胺。

步骤b)需要除去羟基保护基R

重要的是，羟基保护基R

合适的羟基保护基R

在优选的实施例中，R

用于除去苄基的合适的氢化催化剂是钯碳(palladium on carbon，在碳上的钯)(Pd/C)。

该反应通常在0℃与40℃之间(优选10℃与30℃之间)的反应温度下，以及在10bar至100bar(优选30bar至80bar)的氢压力下，在极性质子溶剂如脂族醇诸如2-丙醇或极性非质子溶剂诸如THF或乙酸乙酯的存在下进行。

通过滤除催化剂和通过在真空中蒸发进行的滤液的浓缩，可以获得式IV的GalNAc酰胺的游离醇。

步骤c)需要将式IV的GalNAc酸酰胺的游离醇与亚磷酰胺化剂反应以形成式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体。

亚磷酰胺化剂可以选自2-氰基乙基-N,N-二-(2-丙基)氯亚磷酰胺或选自2-氰基乙基-N,N,N',N'-四(2-丙基)亚磷二酰胺。

在优选的实施例中，亚磷酰胺化剂是2-氰基乙基-N,N,N',N'-四(2-丙基)亚磷二酰胺与活化剂联合。

活化剂可以选自仲胺的酸性铵盐，优选仲脂族胺如二异丙胺的酸性铵盐，优选二异丙基铵盐四氮唑。可替代地，可以使用其他四唑类型活化剂，如四唑、5-(乙基硫基)-1H-四唑、5-(苄基硫基)-1H-四唑或4,5-二氰基咪唑。

该反应可以在极性非质子溶剂如二氯甲烷、四氢呋喃或乙腈中在-20℃与50℃之间、优选10℃与30℃之间的反应温度下进行。

可以通过蒸发进行产物从反应混合物的分离。然而，通常将产物留在溶液中并通过制备色谱法进一步纯化。

可替代地，上述亚磷酰胺化反应的反应混合物可以在没有色谱纯化的情况下直接用于固相寡核苷酸合成。

在优选的实施例中，将色谱纯化的式I的产物GalNAc亚磷酰胺差向异构体溶解在极性非质子溶剂诸如二氯甲烷或乙腈或其混合物中，并直接施加用于制备GalNAc-簇寡核苷酸缀合物。可替代地，可以用干燥剂诸如分子筛(

GalNAc-簇寡核苷酸缀合物的制备包含

a)式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体的制备；

b)在固相寡核苷酸合成中使用式I的GalNAc亚磷酰胺差向异构体连同所需序列的所需核苷结构单元，以形成与固体支持物结合的所需的GalNAc-簇寡核苷酸缀合物，以及最后

c)从固相支持物断裂GalNAc-簇寡核苷酸缀合物并且完全脱保护和纯化。

如本文所用，术语寡核苷酸定义为如技术人员通常理解的包含两个或更多个共价联接的核苷的分子。对于用作有治疗性价值的寡核苷酸，通常合成寡核苷酸的长度为7-30个核苷酸。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，是化学合成的，通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸是反义寡核苷酸。

寡核苷酸可以由DNA、RNA、修饰的RNA或LNA核苷单体或其组合组成。LNA核苷单体是经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖环的C2'与C4'之间包含连接基基团(称为双基或桥)。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。

在非限制性实施例中，GalNAc-簇寡核苷酸缀合物可以选自由以下项组成的组：

5’-(S,S)-GalNAc-C6-caG

5’-(S,S)-GalNAc-C6-caG

5’-(R,S)-GalNAc-C6-caG

5’-(S,S)-GalNAc-C6-ca

5’-(R,S)-GalNAc-C6-ca

5’-(S,S)-GalNAc-C6-caT

5’-(R,S)-GalNAc-C6-caT

5’-(S,S)-GalNAc-C6

5’-(R,S)-GalNAc-C6

其中大写字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标Me表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元，并且C6表示6-氨基己基-1-磷酸酯键。

在固相合成之后，GalNAc-簇寡核苷酸缀合物仍然结合在固体支持物上，并且仍然携带如羟基保护基R

从支持物的断裂和脱保护可以使用本领域技术人员已知的方法发生并在文献中描述，诸如在Wincott等人；Nucl.Acids Res.(1995)23(14):2677-2684中。通常，GalNAc-簇寡核苷酸缀合物以合适的盐的形式诸如铵盐或碱金属盐如钠盐或钾盐获得。

本文公开的化合物具有选自由SEQ ID NO 1、2、3和4组成的组的核碱基序列。

SEQ ID NO 1:cagcgtaaagagagg

SEQ ID NO 2:cacctatttaacatcagac

SEQ ID NO 3:catcaactttcacttcag

SEQ ID NO 4:aatgctacaaaaccca

缩写：

DIPEA 二异丙基乙基胺

DMAP 4-(二甲基氨基)-吡啶

ESI 电子喷雾离子化

EtOAc 乙酸乙酯

EtOH 乙醇

HRMS 高分辨率质谱法

HSQC-NMR 异核单量子相干-核磁共振

MeOH 甲醇

MS 分子筛

MsOH 甲磺酸

rt 室温(20-25℃)

SPOS 固相寡核苷酸合成

T3P 正丙基膦酸酐

THF 四氢呋喃

TBME 甲基叔丁基醚

方法方案：

(2S)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸

在20-25℃历时30s向Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(54g，115mmol)、6-苄氧基己基-1-氨基盐酸盐(根据WO2017084987A1制备)(29.5g，121mmol)和N-乙基二异丙基胺(78.4ml，461mmol)的THF(540ml)溶液中加入正丙基膦酸酐(在EtOAc中的环状三聚体50％，122mL，207mmol)。在20-25℃将pH 7-8的所得浅黄色溶液搅拌1小时。向反应混合物中依次加入水(540mL)、TBME(135mL)和正庚烷(540mL)并且萃取双相混合物。浓缩有机层并真空浓缩，以得到目标(S)-酰胺(79g)，其无需进一步纯化即使用。HRMS(ESI)：C

(2R)-6-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸

以与实例1a相同的方式，得到粗制(R)-酰胺为白色固体，并且无需进一步纯化即使用。HRMS(ESI)：C

叔丁基N-[(5S)-5-氨基-6-(6-苄氧基己基氨基)-6-氧代-己基]氨基甲酸酯

向上述粗制酰胺(79g，120mmol)的THF(237mL)溶液中加入二乙胺(251ml，2.4mol)，并将无色溶液在20-25℃搅拌1.5小时。然后浓缩反应混合物并真空干燥，以得到浅黄色油状物，其在TBME(521mL)和水(521mL)中重新溶解。将甲磺酸(7.02mL，108mmol)加入至pH 4，并且分离各层。用TBME(521mL)再萃取水层，并且然后用氢氧化钠(32％水溶液，12.9mL，139mmol)碱化至pH 14。用TBME(521mL)萃取水相，分离有机层，用硫酸钠干燥、过滤，浓缩并真空干燥，以得到(S)-B为无色油状物(48.5g，历经2步97％产率)。HRMS(ESI)：C

叔丁基N-[(5R)-5-氨基-6-(6-苄氧基己基氨基)-6-氧代-己基]氨基甲酸酯

以与实例2a相同的方式，得到(R)-B为浅黄色油状物(923mg，历经两步85％)。HRMS(ESI)：C

叔丁基N-[(5S)-6-(6-苄氧基己基氨基)-6-氧代-5-[[(2S)-2,6-双(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]己基]氨基甲酸酯

在20-25℃历时30s向(S)-B(48g，110mmol)、DIPEA(75mL，441mmol)和Boc-L-Lys(Boc)-OH(45.8g，132mmol)的THF(480mL)溶液中加入T3P(50％在乙酸乙酯中，97.4mL，165mmol)，并将无色溶液搅拌45分钟。然后加入水(480mL)并将双相混合物搅拌5分钟。加入正庚烷(480mL)，并且分离各层。将有机层用0.5M HCl水(230mL)、0.5M NaOH(230mL)洗涤，用硫酸钠干燥、过滤并浓缩。将粗制产物溶解于EtOH(45mL)中，并且加入正庚烷(428mL)。将所得白色悬浮液在20-25℃搅拌16小时。将悬浮液过滤，用EtOH/正庚烷(0.5/9.5，50ml)洗涤滤饼，并且真空干燥白色固体，以得到(S,S)-C(63.3g，75％产率)为白色结晶固体。HRMS(ESI)：C

叔丁基N-[(5R)-6-(6-苄氧基己基氨基)-6-氧代-5-[[(2S)-2,6-双(叔丁氧基羰基氨基)己酰基]氨基]己基]氨基甲酸酯

以与实例3a相同的方式，得到(R,S)-C为白色固体(16.4g，71％)。HRMS(ESI)：C

(2S)-2,6-双[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-N-[(1S)-1-(6-苄氧基己基氨基甲酰基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]戊基]己酰胺

将(S,S)-C(36.1g，47.3mmol)悬浮在乙腈(366mL)中，并且加入甲磺酸(15.4mL，237mmol)。将所得淡黄色、混浊的溶液加热至55-60℃。20分钟后，加入额外的乙腈(366mL)以能够搅拌。2小时后，除去油浴，并且使用白色浆体用于偶联。将DIPEA(137mL，804mmol)和F溶液(其已经根据WO2017084987A进行制备(7.6％w/w，1.35kg，191mmol)加入到上述反应混合物，并将浅黄色溶液温热至40-45℃。然后，历时5min添加T3P(50％在乙酸乙酯中，139ml，237mmol)，并将该无色溶液在40-45℃搅拌。在30分钟后，将反应混合物冷却至20-25℃并真空浓缩至大约500g。将该粗制溶液溶解于1M碳酸氢钠(236mL，236mmol)中，并通过反相色谱法以4部分纯化(Redisep R

再乙酰化：

将上述得到的(S,S)-G(77.1g)溶于乙腈(231mL)中，并在20-25℃用DMAP(465mg，3.81mmol)、DIPEA(4.86mL，28.6mmol)和乙酸酐(2.51ml，26.7mmol)处理1小时。用水(1.0L)稀释后，溶液通过反相色谱法以5部分再次纯化(Redisep R

(2S)-2,6-双[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1-(6-苄氧基己基氨基甲酰基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]戊基]己酰胺

以与实例4a相同的方式但没有再乙酰化过程，得到(R,S)-G为白色泡沫(29.1g，66％)。HRMS(EI)：C

(2S)-2,6-双[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-N-[(1S)-1-(6-羟基己基氨基甲酰基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]戊基]己酰胺

将(S,S)-G(67.0g，33.1mmol)溶于2-丙醇(670ml)中，并且加入钯碳10％(3.8g，3.57mmol)。将混合物在20℃在60bar的H

(2S)-2,6-双[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1-(6-羟基己基氨基甲酰基)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]-乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]戊基]己酰胺

以与实例5a相同的方式，得到粗制(R,S)-H为白色泡沫(29.1g，定量)。LC-MS(ESI)：C

(2S)-2,6-双[[2-[2-[2-[2-[rac-(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-N-[(1S)-1-[6-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基己基氨基甲酰基]-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-氨基]戊基]己酰胺

向(S,S)-H(3.4g，1.76mmol)的无水二氯甲烷(20ml)溶液中加入3-((双(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(902mg，2.99mmol)和二异丙基-铵盐四氮唑(151mg，0.88mmol)。将浅黄色溶液在20-25℃搅拌1小时。将反应混合物用TBME稀释，并通过制备型色谱法直接纯化(Redisep R

(2S)-2,6-双[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-N-[(1R)-1-[6-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦基]氧基己基氨基甲酰基]-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3-乙酰胺基-6-乙基-4,5-二甲基-四氢吡喃-2-基]氧基乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-氨基]戊基]己酰胺

向(R,S)-H(2.5g，1.29mmol)的乙腈(20ml，用CaH

对于固相寡核苷酸合成(SPOS)，将(S,S)-I和(R,S)-I溶于无水MeCN或CH

固相寡核苷酸合成

使用AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare,Freiburg,德国)，通过标准亚磷酰胺化学(参见WO2017084987A1和WO2018215391A1)在BioAutomation Mermade 12上在固相上以1或20μmol规模或以0.2、0.95或1.9mmol规模产生GalNAc-簇修饰的LNA/DNA。使用的固体支持物包括Primer Support 5G Unylinker 200(GE Healthcare，Freiburg，德国)、PrimerSupport 5G Unylinker 350(GE Healthcare，Freiburg，德国)或Kinovate NittoPhase HLUnylinker 400。采用相应的亚磷酰胺，生成含有2-OCH2-4桥接核苷酸的寡核苷酸(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，德国)和DNA(Sigma-Aldrich，SAFC，Hamburg，德国)。采用1.5-4.0当量的亚磷酰胺、30/70-40/60的亚磷酰胺与活化剂的比率和10-30分钟的偶联时间，将以上制备的GalNAc-簇亚磷酰胺(S,S)-I和(R,S)-I的MeCN或CH

(大写字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标Me表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元，并且AM-C6表示6-氨基己基-l-磷酸酯键)。

5’-(S,S)-GalNAc-C6-caG

根据使用(S,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以1.9mmol规模合成标题产物。通过反相HPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(S,S)-GalNAc-C6-caG

根据使用(R,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以1.9mmol规模合成标题产物。通过反相HPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(R,S)-GalNAc-C6-caG

根据使用(S,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以0.2mmol规模合成标题产物。通过IEX-MPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(S,S)-GalNAc-C6-ca

根据使用(R,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以0.2mmol规模产生合成制备标题产物。通过IEX-MPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(R,S)-GalNAc-C6-ca

根据使用(S,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以2*1.9mmol规模合成标题产物。通过IEX-MPLC之后进行反相HPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(S,S)-GalNAc-C6-caT

根据使用(R,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以1.9mmol规模产生合成制备标题产物。通过反相HPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(R,S)-GalNAc-C6-caT

根据使用(S,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以0.95mmol规模合成标题产物。通过反相HPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(S,S)-GalNAc-C6

根据使用(R,S)-I的上述标准SPOS条件，在AKTA Oligopilot 100(GEHealthcare，Freiburg，德国)上以0.95mmol规模产生合成制备标题产物。通过反相HPLC纯化作为铵盐的脱保护和浓缩的粗制寡核苷酸，并且在超滤/渗滤和冻干后，得到5’-(R,S)-GalNAc-C6