侧流分析条带和使用该条带的分子诊断方法

摘要

公开了侧流分析条带及使用该条带的分子诊断方法。侧流分析条带可包括：样品垫(100)，包含用标签标记的扩增子和用标签标记的扩增子前体中的至少一种的样品将被引入其中；缀合物垫(200)，所述缀合物垫(200)包含缀合物(C1)，所述缀合物(C1)具有指示剂和结合至指示剂表面的检测剂，并且缀合物(C1)非固定地吸附至所述缀合物垫(200)；测试垫(300)，所述测试垫(300)包含测试线(310)，第一捕获剂固定至所述测试线(310)；对照垫(400)，所述对照垫(400)包含对照线(410)，第二捕获剂固定至所述对照线(410)；以及吸收垫(500)。本发明的侧流分析条带可检测扩增子(例如核酸)并且可直接用肉眼确定结果，所述扩增子使用标记有一种类型的标签的扩增子前体(例如引物或dNTP)进行扩增。此外，通过使用具有强结合力的标签、结合至标签的捕获剂、检测剂和结合至检测剂的捕获剂，侧流分析条带有利地具有高灵敏度。进一步地，通过使用具有一定结合力的标签、结合至标签的捕获剂、检测剂和结合至检测剂的捕获剂，侧流分析条带具有可重现且稳定的效果。

说明书

技术领域

本公开涉及侧流测定条带和使用该条带的分子诊断方法。更具体而言，本公开涉及能够检测扩增子并能够进行诊断的侧流测定条带以及使用该侧流测定条带的分子诊断方法，所述扩增子使用标记有一种类型的标签的扩增子前体进行扩增。

背景技术

作为检测和诊断病毒或核酸的常规方法，主要使用血清学方法或使用电子显微镜的方法。虽然使用电子显微镜的方法可确认病毒的存在，但几乎不可能通过其形态特征来识别物种。在血清学方法中，酶联免疫吸附测定(ELISA)最为常见，但它具有比聚合酶链式反应(PCR)诊断方法低约1,000倍的检测灵敏度，并且经常由于预料不到的非特异性反应而无法进行准确诊断。

近来，具有高检测灵敏度和便利性的PCR方法已被用于检测病毒或核酸并进行诊断。然而，基于PCR的诊断的问题在于，它需要开发特定的引物，并且涉及通过电泳和进行DNA测序来确认经扩增的反应产物的一系列步骤。此外，该方法还需要专门的装置(例如聚合酶链式反应设备(热循环仪))和能够操作该设备的专业技术人员。确认最终扩增产物的DNA测序是需要大量资金和高端技术的过程。此外，执行上述一系列步骤需要长的时间，并且不能用肉眼确认诊断结果。因此，存在难以在缺乏特定分析装置的环境中使用该方法的问题。

因此，为了在短时间内有效地检测病毒或基因，需要开发能够在没有配备专门装置的现场实时检测病毒或基因的诊断装置和方法。

发明内容

技术问题

因此，考虑到相关技术中出现的上述问题而做出了本公开，并且本公开的目的是提供能够检测扩增子(例如核酸)并能立即用肉眼确认结果的侧流测定条带，所述扩增子使用标记有一种类型的标签的前体(例如引物或dNTP)进行扩增。

本公开的另一个目的是提供如下的侧流测定条带以及使用该条带的分子诊断方法，所述侧流测定条带具有高灵敏度，并使用至少一个标签、结合至标签的捕获分子、检测剂和结合至检测剂的捕获分子。

本公开的进一步目的是提供可再现且稳定的侧流测定条带以及使用该条带的分子诊断方法，所述侧流测定条带使用具有恒定结合力的至少一个标签、结合至标签的捕获分子、检测剂和结合至检测剂的捕获分子。

技术方案

根据本公开的一方面，侧流测定条带10包括：样品垫100，所述样品垫100被配置为接收包含标记有至少一个标签的扩增子和标记有标签的扩增子前体中的至少一种的样品；缀合物垫200，所述缀合物垫200包含具有指示剂和结合至该指示剂的检测剂的第一缀合物C1，其中第一缀合物C1以可流动的方式附着；测试垫300，所述测试垫300包括固定有第一捕获分子的测试线310；对照垫400，所述对照垫400包括固定有第二捕获分子的对照线410；以及吸收垫500。

此外，检测剂可为与第一捕获分子相同的类型。

此外，检测剂和第一捕获分子各自可包括选自于由亲和素和抗生物素抗体所组成的组中的一种。

此外，所述指示剂可包括选自于由以下所组成的组中的一种：金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、钯(Pd)、钌(Ru)、钛(Ti)、锆(Zr)、铪(Hf)、钒(V)、铌(Nb)、钽(Ta)、铬(Cr)、钼(Mo)、钨(W)、锇(Os)、铁(Fe)、镍(Ni)、钴(Co)、氧化镁(MgO)、二氧化钛(TiO

此外，标记在扩增子上的至少一个标签和标记在扩增子前体上的标签各自可为与第二捕获分子相同的类型。

此外，标签和第二捕获分子各自可包括生物素。

此外，标记有标签的扩增子可标记有两个以上的标签。

此外，样品可包括标记有至少一个标签的扩增子。样品垫100可被配置为接收样品并将样品释放至缀合物垫200中。缀合物垫200可被配置为将标记在扩增子上的至少一个标签结合至第一缀合物C1的一部分，使得第一缀合物C1和结合至标记在扩增子上的至少一个标签的第二缀合物C2被释放至测试垫300中。测试垫300可被配置为将从缀合物垫200释放的第二缀合物C2结合至测试线310上的第一捕获分子以捕获第二缀合物C2，并且可被配置为将第一缀合物C1释放至对照垫400中，第二缀合物C2结合至标记在扩增子上的至少一个标签。对照垫400可被配置为将从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线410上的第二捕获分子以捕获第一缀合物C1。

此外，样品包括标记有标签的扩增子前体，样品垫100可被配置为接收样品并且将样品释放到缀合物垫200；缀合物垫200可被配置为将标记在扩增子上的至少一个标签结合至第一缀合物C1的一部分，以将第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至测试垫300；测试垫300可被配置为将从缀合物垫200释放的第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至对照垫400；对照垫400可被配置为将从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线410上的第二捕获分子以捕获第一缀合物C1，并且被配置为将结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至吸收垫500；并且吸收垫500可被配置为吸收结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3。

此外，所述扩增子前体可包括选自于由以下所组成的组中的至少一种：dNTP、dUTP、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、反向环引物(LB)和正向环引物(LF)。

此外，标记有至少一个标签的扩增子可通过环介导等温扩增(LAMP)进行扩增。

此外，侧流测定条带可用于诊断选自以下中的至少一种：细菌性肺炎、结核病和淋病，以及通过选自于由流感病毒、AIDS病毒(HIV)、天花病毒、口蹄疫病毒、埃博拉病毒、登革病毒、寨卡病毒、冠状病毒、HPV病毒所组成的组中的至少一种病毒引起的疾病。

此外，标签和第一捕获分子之间的缔合的解离常数(Kd)以及检测剂和第二捕获分子之间的缔合的解离常数(Kd)可各自独立地为10

此外，样品垫100、缀合物垫200、对照垫400和吸收垫500各自可在水平方向上以此顺序布置，并且测试垫300可布置在缀合物垫200和对照垫400之间、或可布置在对照垫400和吸收垫500之间。

根据本公开的另一方面，提供了使用侧流测定条带10的分子诊断方法，该侧流测定条带10包括样品垫100、缀合物垫200、测试垫300、对照垫400和吸收垫500。该方法包括以下步骤：(a)将包含标记有至少一个标签的扩增子的样品引入样品垫100中；(b)通过样品垫100，将样品释放至缀合物垫200中；(c)通过缀合物垫200，将标记在扩增子上的至少一个标签结合至第一缀合物C1的一部分，随后将第一缀合物C1和结合至标记在扩增子上的至少一个标签的第二缀合物C2释放入测试垫300中，其中缀合物垫200包含具有指示剂和结合至指示剂表面的检测剂的第一缀合物C1，第一缀合物C1以可流动的方式附着；(d)通过测试垫300，将从缀合物垫200释放的第二缀合物C2结合至测试线310上的第一捕获分子，以捕获第二缀合物C2并将未被第一捕获分子捕获的第一缀合物C1释放至对照垫400，其中测试垫300包含固定有第一捕获分子的测试线310，第二缀合物C2结合至标记在扩增子上的至少一个标签；以及(e)通过对照垫400，将从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线410上的第二捕获分子，并捕获第一缀合物C1，其中对照垫400包含固定有第二捕获分子的对照线410。

此外，使用侧流测定条带10的分子诊断方法可在步骤(a)之前进一步包括对含有核酸、标记有标签的扩增子前体和未标记任何标签的扩增子前体的混合物进行扩增的步骤，以制备标记有标签或多个标签的扩增子(步骤a')，其中扩增子前体可包括选自于由以下所组成的组中的至少一个：dNTP、dUTP、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、反向环引物(LB)和正向环引物(LF)。

此外，步骤(a')中使用的混合物中标记有标签的扩增子前体的浓度C2与未标记任何标签的扩增子前体的浓度C1的比率C2/C1为0.01至0.5。

此外，扩增可通过环介导等温扩增(LAMP)进行，并且环介导等温扩增可通过选自于由热包(hot pack)、暖手器、便携式保温杯(portable tumbler)和便携式加热设备所组成的组中的至少一种维持预定温度来进行。

此外，扩增可在60℃至70℃的温度下进行。

此外，标记有至少一个标签的扩增子可标记有两个以上的标签。

此外，使用侧流测定条带10的分子诊断方法可在步骤(e)之后进一步包括：确认测试线310和对照线410各自是否产生着色带，随后进行诊断的步骤(步骤f)。

根据本公开的另一方面，提供了使用侧流测定条带10的分子诊断方法，所述侧流测定条带10包括样品垫100、缀合物垫200、测试垫300、对照垫400和吸收垫500。该方法包括以下步骤：将含有标记有标签的扩增子前体的样品引入样品垫100中(步骤1)；通过样品垫100，将样品释放至缀合物垫200(步骤2)；通过缀合物垫200，将标记在扩增子前体上的标签与第一缀合物C1的一部分结合，随后将第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至测试垫300，其中缀合物垫200包含具有指示剂和结合至指示剂表面的检测剂的第一缀合物C1，第一缀合物C1以可流动的方式结合(步骤3)；通过测试垫300，将从缀合物垫200释放的第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至对照垫400中，其中测试垫300包含固定有第一捕获分子的测试线310(步骤4)；通过对照垫400，将从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线310上的第二捕获分子上以捕获第一缀合物C1，并且将结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至吸收垫500，其中对照垫400包含固定有第二捕获分子的对照线410(步骤5)；以及通过吸收垫500，吸收结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3(步骤6)。

此外，使用侧流测定条带10的分子诊断方法可在步骤1之前进一步包括对含有标记有标签的扩增子前体和未标记任何标签的扩增子前体的混合物进行扩增的步骤(步骤1')，其中没有得到扩增结果。

此外，使用侧流测定条带10的分子诊断方法可在步骤6之后进一步包括：对测试线310不产生着色带和对照线410产生着色带分别进行确认，随后进行诊断的步骤(步骤7)。

有益效果

如上所述，本公开的侧流测定条带具有能够检测扩增子(例如核酸)并立即用肉眼确认结果的效果，所述扩增子使用标记有一种类型的标签的扩增子前体(例如dNTP或引物)进行扩增。

此外，本公开的侧流测定条带具有通过使用具有强结合力的至少一个标签、结合至标签的捕获分子、检测剂和结合至检测剂的捕获分子而提供高灵敏度的效果。

此外，本公开通过使用具有恒定结合力的至少一个标签、结合至标签的捕获分子、检测剂和结合至检测剂的捕获分子而具有提供可再现且稳定的侧流测定条带的效果。

附图说明

图1为示出本公开的侧流测定条带的结构的示意图；

图2为示出当向本公开的侧流测定条带中引入含有标记有至少一个标签的扩增子的样品时的检测路径的示意图；

图3为示出当向本公开的侧流测定条带中引入含有标记有标签的扩增子前体的样品时的检测路径的示意图；

图4为示出存在待诊断核酸时的扩增反应的示意图；

图5为示出不存在待诊断核酸时的扩增反应的示意图；

图6为标记有6个生物素的合成寡聚物和标记有1个生物素的合成寡聚物的LFA测试结果；

图7为实施例2-2、实施例2-4、实施例2-5、实施例3-2中的扩增结果的图片；

图8是示出实施例2-2、实施例2-4、实施例2-5、实施例3-2中的扩增结果的电泳图；

图9为通过将实施例2-1至实施例2-3、实施例3-1至实施例3-3中扩增的产物引入实施例1制备的LFA条带中的侧流测定结果；以及

图10是通过将实施例2-2、实施例2-4、实施例2-5和实施例3-2中扩增的产物引入实施例1制备的LFA条带中的侧流测定结果。

具体实施方式

在下文中，将参考附图详细描述本公开的实施方式，使得本公开所属领域的普通技术人员能够容易地实施本公开的实施方式。

然而，以下描述并非旨在将本公开内容限制为具体的实施方式，并且当确定相关已知技术的详细描述可能在描述本公开时使本公开的要旨难以理解时，其详细描述将被省略。

本文使用的术语仅用于描述具体实施方式，并不旨在对本公开进行限制。除非上下文另有明确指示，否则单数表述包括复数表述。在本申请中，诸如“包括”或“具有”的术语旨在指明存在申请文件中描述的特征、数量、步骤、操作、要素或它们的组合。应当理解的是，这并不排除一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、要素或它们的组合的存在或添加可能性。

图1为示出本公开的侧流测定条带10的结构的示意图。在下文中，将参考图1对本公开的侧流测定条带10进行描述。

本公开的侧流测定条带10可包括样品垫100，所述样品垫100被配置为接收样品，所述样品含有标记有至少一个标签的扩增子和标记有标签的扩增子前体中的至少一种。

标记有至少一个标签的扩增子可标记有两个以上的标签。

扩增子前体可包括选自于由以下所组成的组中的至少一种：dNTP、dUTP、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、反向环引物(LB)和正向环引物(LF)。

标记有至少一个标签的扩增子可通过环介导等温扩增(LAMP)进行扩增。

本公开的侧流测定条带10可包括具有指示剂和结合至指示剂表面的检测剂的第一缀合物(C1)，以及具有以可流动的方式附着的第一缀合物(C1)的缀合物垫200。

指示剂可包括选自于由以下所组成的组中的一种，并且可优选地包括金(Au)：金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、钯(Pd)、钌(Ru)、钛(Ti)、锆(Zr)、铪(Hf)、钒(V)、铌(Nb)、钽(Ta)、铬(Cr)、钼(Mo)、钨(W)、锇(Os)、铁(Fe)、镍(Ni)、钴(Co)、氧化镁(MgO)、二氧化钛(TiO

本公开的侧流测定条带10可包括测试垫300，所述测试垫300包含固定有第一捕获分子的测试线310。

本公开的侧流测定条带10可包括对照垫400，所述对照垫400包含固定有第二捕获分子的对照线410。

本公开的侧流测定条带10可包括吸收垫500。

检测剂可为第一捕获分子的相同类型。

检测剂和第一捕获分子各自可包括选自于由亲和素和抗生物素抗体所组成的组中的一个，并且优选可包括亲和素。

标记在扩增子上的至少一个标签和标记在扩增子前体上的标签各自为第二捕获分子的相同类型。

标签和第二捕获分子各自可包括生物素。

根据本公开的实施方式，样品包括标记有至少一个标签的扩增子，样品垫100可被配置为接收样品并将样品释放至缀合物垫200；缀合物垫200可被配置为将标记在扩增子上的至少一个标签结合至第一缀合物C1的一部分，使得第一缀合物C1和结合至标记在扩增子上的至少一个标签的第二缀合物C2释放至测试垫300中；测试垫300可被配置为将从缀合物垫200释放的第二缀合物C2结合至测试线310上的第一捕获分子以捕获第二缀合物C2，并被配置为将第一缀合物C1释放至对照垫400，第二缀合物C2结合至标记在扩增子上的至少一个标签；并且对照垫400可被配置为将从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线410上的第二捕获分子以捕获第一缀合物C1。

此外，根据本公开的另一实施方式，样品垫100可被配置为接收样品并将样品释放至缀合物垫200；缀合物垫200可被配置为将标记在扩增子上的至少一个标签结合至第一缀合物C1的一部分以将第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至测试垫300；测试垫300可被配置为将从缀合物垫200释放的第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至对照垫400；对照垫400可被配置为将从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线410上的第二捕获分子以捕获第一缀合物C1，并且可被配置为将结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至吸收垫500；并且吸收垫500可被配置为吸收结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3。

侧流测定条带可用于诊断选自以下中的至少一种：细菌性肺炎、结核病和淋病，以及通过选自于由流感病毒、AIDS病毒(HIV)、天花病毒、口蹄疫病毒、埃博拉病毒、登革病毒、寨卡病毒、冠状病毒、HPV病毒所组成的组中的至少一种病毒引起的疾病。

标签和第一捕获分子之间的缔合的解离常数(Kd)以及检测剂和第二捕获分子之间的缔合的解离常数(Kd)可各自独立地为10

样品垫100、缀合物垫200、对照垫400和吸收垫500各自可在水平方向上以此顺序布置，并且测试垫300可布置在缀合物垫200和对照垫400之间，或者可布置在对照垫400和吸收垫500之间，并且也可使它们彼此结合并以该顺序布置。

样品垫100、缀合物垫200、测试垫300、对照垫400和吸收垫500可为多孔的和亲水的。因此，当样品被引入样品垫100时，样品可通过样品垫100、缀合物垫200、测试垫300、对照垫400移动至吸收垫500中。在这种情况下，一些样品组合物可结合至存在于至少一个垫中的捕获分子，并然后被捕获在至少一个垫的表面上。

图2为示出当向本公开的侧流测定条带10中引入含有标记有至少一个标签的扩增子的样品时的检测路径的示意图。

在下文中，将参考图2对根据本公开的实施方式的使用侧流测定条带10的分子诊断方法进行描述。

首先，将含有标记有至少一个标签的扩增子的样品引入样品垫100中(步骤a)。

本方法可在步骤a之前进一步包括对含有核酸、标记有标签的扩增子前体和未标记任何标签的扩增子前体的混合物进行扩增的步骤，以制备标记有标签或多个标签的扩增子(步骤a')，其中扩增子前体可包括选自于由以下所组成的组中的至少一种：dNTP、dUTP、正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、反向环引物(LB)和正向环引物(LF)。图4示出了步骤(a')的扩增反应。

在步骤(a')的混合物中，混合物中标记有标签的扩增子前体的浓度C2与未标记任何标签的扩增子前体的浓度C1的比率C2/C1可为0.01至0.5，优选可为0.03至0.3，且更优选可为0.07。

步骤(a')中未标记任何标签的扩增子前体的浓度可为0.1mM至1.5mM，优选可为0.2mM至0.5mM，且更优选可为0.3mM。当未标记任何标签的扩增子前体的浓度小于0.1mM时，测试线的信号强度降低，因此不优选。当未标记任何标签的扩增子前体的浓度大于1.5mM时，添加的扩增子前体的效果不显著，因此不优选。

步骤(a')中标记有标签的扩增子前体的浓度可为0.01mM至0.1mM，优选可为0.01mM至0.03mM，且更优选可为0.02mM。当标记有标签的扩增子前体的浓度小于0.01mM时，未标记任何标签的扩增子前体的浓度对于标记有标签的扩增子前体的浓度相对高，引起测试线的信号强度降低，因此不优选。当标记有标签的扩增子前体的浓度大于0.1mM时，信号强度降低，因此不优选。

扩增通过环介导等温扩增(LAMP)进行，并且环介导等温扩增可通过选自于由热包、暖手器、便携式保温杯和便携式加热设备所组成的组中的至少一种维持预定温度来进行。

等温扩增可在60℃至70℃的温度下进行，在该温度下所使用的酶的活性基本上不被抑制，优选地可在65℃的温度下进行。当温度低于60℃或高于70℃时，Bst聚合酶的活性急剧下降，因此不优选。具体而言，可使用能够维持预定温度的便携式设备，因为LAMP的反应在等温条件下进行。具体而言，还可使用便携式保温杯、便携式加热设备、便携式电加热设备，也可使用将钢容纳在密闭空间中并通过钢的氧化产生热量的便携式加热源。具体而言，也可使用可商购的热包和暖手器，其可保持60℃至70℃的温度，在该温度下可进行等温扩增反应。未来，可使用便携式设备的LAMP可作为简单的诊断手段应用于一线临床诊断实验室或临床现场，而无需昂贵的专用装置。

标记有至少一个标签的扩增子可标记有两个以上的标签。

接下来，通过样品垫100将样品释放至缀合物垫200(步骤b)。

接下来，标记在扩增子上的至少一个标签结合至第一缀合物C1的一部分，并且然后通过缀合物垫200将第一缀合物Cl和结合至标记在扩增子上的至少一个标签的第二缀合物C2释放至测试垫300(步骤c)。

接下来，从缀合物垫200释放的第二缀合物C2结合至测试线310上的第一捕获分子以捕获第二缀合物C2，所述第二缀合物C2结合至标记在扩增子上的至少一个标签，并且未被第一捕获分子捕获的第一缀合物C1通过测试垫300被释放至对照垫400(步骤d)。

最后，从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线410上的第二捕获分子并被对照垫400捕获在其上(步骤e)。

本公开的方法可在步骤(e)后进一步包括确认测试线310和对照线410各自产生着色带以进行诊断的步骤(步骤f)。

图3为示出向本公开的侧流测定条带中引入含有标记有标签的扩增子前体的样品时的检测路径的示意图。

在下文中，将参照图3描述根据本公开的另一实施方式的使用侧流测定条带10的分子诊断方法。

首先，将含有标记有标签的扩增子前体的样品引入样品垫100中(步骤1)。

使用侧流测定条带10的本方法可在步骤1前进一步包括对包含标记有标签的扩增子前体和未标记任何标签的扩增子前体的混合物进行扩增的步骤(步骤1')，其中未获得扩增结果。图5示出了步骤1'的扩增反应。

接下来，通过样品垫100将样品释放至缀合物垫200(步骤2)。

接下来，标记在扩增子前体上的标签结合至第一缀合物C1的一部分，并且然后第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3通过缀合物垫200被释放至测试垫300(步骤3)。

接下来，从缀合物垫200释放的第一缀合物C1和结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3通过测试垫300被释放至对照垫400(步骤4)。

接下来，从测试垫300释放的第一缀合物C1结合至对照线310上的第二捕获分子以捕获第一缀合物C1，并且通过对照垫400将结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3释放至吸收垫500(步骤5)。

最后，吸收垫500吸收结合至标记在扩增子前体上的标签的第三缀合物C3(步骤6)。

本公开的方法可在步骤6之后进一步包括：对测试线310不产生着色带并且对照线410产生着色带进行确认，随后进行诊断的步骤(步骤7)。

实施例

在下文中，将通过示例的方式更详细地对本公开进行描述。然而，这是为了说明的目的，并且本公开的范围不限于此。

将1mL的40nm AuNP(Cat.EM.GC40，BBI Solutions)溶液、100μL硼酸盐缓冲液(pH8.5，0.1M，Cat.BB001，Bio-solution)和链霉亲和素(Cat.434302，Thermo)混合至10μg/mL的终浓度以制备混合溶液。将混合溶液涡旋并旋转沉降，随后在环境温度下孵育1小时。将含有100mg/mL BSA的10μL PBS(10mM，pH 7.4)添加到混合物溶液中至终浓度为0.1％，以封闭AuNP表面。将该混合物涡旋并旋转沉降，然后在环境温度下进行孵育2小时。使用离心机在9,000rpm和10℃下将混合物离心15分钟。弃上清，加入1mL硼酸盐缓冲液(10mM，pH 8.5)并进行悬浮。重复离心和悬浮过程3次后，去除上清液，并向其中引入100μL硼酸盐缓冲液(10mM)。通过对所得混合物进行涡旋和旋转沉降，将10×亲和素-AuNP缀合物溶液制备作为最终悬液。

LFA条带由四个组件组成：样品垫、缀合物垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。将组件固定在带有聚酯的背衬卡上。使用切割工具将背衬卡切成4mm宽以制备LFA条带。使用1μL移液管将亲和素(1mg/mL)加载到硝酸纤维素膜上的测试线上，并且将生物素-BSA(1mg/mL)加载到硝酸纤维素膜上的对照线上。这两条线之间的距离是3mm。加载后，将硝酸纤维素膜在37℃下干燥1小时。将2×亲和素-AuNP缀合物加载到缀合物垫(4mm×8mm)上，并在37℃的温度和25％的湿度下干燥后储存。此后，将样品垫、缀合物垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按此顺序在粘性背衬卡上组装。每个部分相互重叠1.5mm，以促进分析过程中溶液的移动。

为了通过逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)反应对流感病毒RNA进行扩增，将10×等温缓冲液(NEB)、dNTP(0.3mM)、生物素-dUTP(0.01mM)、甜菜碱(0.8M)、6种引物(1.6μMFIP、BIP/0.2μM F3、B3/0.4μM LB、LF)、Bst聚合酶(8U)和5μL含有10ng流感病毒RNA的水性溶液混合，使终体积为25μL，随后在65℃下进行反应30分钟。

在这种情况下，FIP代表正向内引物，BIP代表反向内引物，F3代表正向外引物，B3代表反向外引物，LB代表反向环引物，并且LF代表正向环引物。

以与实施例2-1相同的方式对流感病毒RNA进行扩增，不同之处在于混合生物素-dUTP(0.02mM)而不是生物素-dUTP(0.01mM)。

以与实施例2-1相同的方式对流感病毒RNA进行扩增，不同之处在于混合生物素-dUTP(0.04mM)而不是生物素-dUTP(0.01mM)。

以与实施例2-2相同的方式对流感病毒RNA进行扩增，不同之处在于混合其中溶解有1ng流感病毒RNA的水性溶液而不是其中溶解有10ng流感病毒RNA的水性溶液。

以与实施例2-2相同的方式对流感病毒RNA进行扩增，不同之处在于混合其中溶解有0.1ng流感病毒RNA的水性溶液而不是其中溶解有10ng流感病毒RNA的水性溶液。

将10×等温缓冲液(NEB)、dNTP(0.3mM)、生物素-dUTP(0.01mM)、甜菜碱(0.8M)、6种引物(1.6μM FIP、BIP/0.2μM F3、B3/0.4μM LB、LF)和Bst聚合酶(8U)混合至终体积为25μL，并将该混合物在65℃下扩增30分钟，但由于流感病毒RNA不存在，扩增未进行。

以与实施例2-1相同的方式进行扩增，不同之处在于混合生物素-dUTP(0.02mM)而不是生物素-dUTP(0.01mM)，但是由于流感病毒RNA不存在，扩增未进行。

实施例3-3

以与实施例2-1相同的方式进行扩增，不同之处在于混合生物素-dUTP(0.04mM)而不是生物素-dUTP(0.01mM)，但是由于流感病毒RNA不存在，扩增未进行。

实施例2-1至实施例2-5和实施例3-1至实施例3-3的生物素-dUTP和流感病毒RNA的量总结在下表1中。

表1

[实验实施例]

标示有6个生物素的合成寡聚物[生物素-TEG]AAAAAAAAAA[生物素-TEG]AAAAAAAAAA[生物素-TEG]AAAAAAAAAA[生物素-TEG]AAAAAAAAAA[生物素-TEG]AAAAAAAAAA[生物素-TEG]和标示有1个生物素的合成寡聚物[生物素-TEG]AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA由寡聚物合成公司BioneerCo.，Ltd.根据Koster开发的“亚磷酸三酯”方法制造和合成，该方法中DNA结构的主链中的磷酸二酯键由氰乙基亚磷酰胺连接。合成过程从连接核苷的固体支持物开始，并对由去封闭、偶联、氧化和加帽组成的循环进行重复，以获得具有期望的碱基序列的寡核苷酸。

将10nM、5nM、2.5nM和1.25nM的标示有六个生物素的合成寡聚物中的每一个以及50nM、25nM、12.5nM和6.25nM的标示有一个生物素的合成寡聚物中的每一个引入实施例1中制备的LFA条带，然后进行LFA测试。结果在图6中示出。在图6中，使用结合至蛋白质的生物素-BSA代替“BSA”牛血清白蛋白，因为其难以将小的生物素分子固定在NC膜上。参考图6，仅在标示有6个生物素的合成寡聚物的情况下，才可能在LFA条带的测试线中确认颜色变化。

从实施例2-2、实施例2-4、实施例2-5和实施例3-2获得的扩增结果在图7中示出。参考图7，确认了在流感病毒RNA存在的情况下发生从紫色到浅蓝色的颜色变化。

从实施例2-2、实施例2-4、实施例2-5和实施例3-2得到的扩增产物的电泳结果在图8中示出。参考图8，当存在流感病毒RNA时，证实了梯形图案。

通过将实施例2-1至实施例2-3和实施例3-1至实施例3-3中获得的扩增产物引入实施例1获得的LFA条带中，进行侧流测定，并将结果在图9中示出。在这种情况下，侧流测定通过使用150μL运行缓冲液(1.0M GH)和1.0μL扩增子进行，并且反应时间为10分钟。在图9中，“+”表示存在核酸，“-”表示不存在核酸。

参考图9，确认了当生物素浓度降低时，信号减弱。当生物素-dUTP的浓度降低时，所有扩增子的生物素都结合至亲和素(结合至缀合物的检测剂)，从而测试线中的待结合至亲和素的生物素消失，由此减弱信号。这可通过优化标记有生物素的扩增子前体的浓度和包被在缀合物上的亲和素的浓度来解决。

通过将实施例2-2、实施例2-4、实施例2-5和实施例3-2中获得的扩增产物引入实施例1中制备的LFA条带中，进行侧流测定，并且结果在图10中示出。参考图10，仅当存在流感病毒RNA时，才在LFA条带的测试线中确认颜色变化。

在上文中，虽然已经描述了本公开的优选实施方式，但是在不脱离权利要求中指明的本公开的精神的情况下，可通过添加、改变或删除本公开的组成部分来对本公开进行各种修改和改变，并且这也将包括在本公开的范围内。例如，作为单一类型进行描述的各个组成部分可按独立形式实施，并且同样地以独立形式进行描述的组件可按组合形式来实施。本公开的范围由所附权利要求而不是以上的详细描述来指示，并且源自权利要求及其等同物的含义和范围的所有变化或修改均应解释为包括在本公开的范围内。

工业实用性

本公开的侧流测定条带可检测扩增子(例如核酸)，并具有立即用肉眼确认结果的效果，所述扩增子使用在其上标记有一种类型的标签的扩增子前体(例如引物或dNTP)进行扩增。

此外，由于使用具有强结合力的至少一种标签、结合标签的捕获分子、检测剂和结合至检测剂的捕获分子，侧流测定条带具有高灵敏度的效果。

此外，由于使用具有恒定结合力的至少一种标签、结合至标签的捕获分子、检测剂和结合至检测剂的捕获分子，因此存在可再现且稳定的效果。