一种脐带间充质干细胞的运输保存液及保存方法

摘要

本发明公开了一种脐带间充质干细胞的运输保存液，由以下原料组成：氯化钠注射液、α‑倒捻子素、橙皮甙、小白菊内酯、葡萄糖、腺苷、磷酸二氢钠。本发明提供的脐带间充质干细胞运输保存液，以氯化钠注射液为主要成分，不含血清，人血白蛋白等血液制品，成分明确安全。还添加α‑倒捻子素、橙皮甙、小白菊内酯三种成分作为保护剂，对细胞膜起到保护作用，避免细胞在降温后局部电解质浓度增高，引起细胞内部空间结构紊乱，帮助细胞快速适应低温环境，同时避免细胞失活。本发明还提供了一种脐带间充质干细胞的运输保存方法，采用本发明的运输保存液，实现在4‑8℃下对细胞的短期保存，在保存3天后细胞的存活率还在90%以上，充分满足临床的使用要求。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的运输保存液及保存方法。

背景技术

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最早在骨髓中发现，因其具有多项分化潜能、造血支持、促进干细胞植入、免疫调节和自我复制等特点而日益受到人们的关注。骨髓间充质干细胞已经在临床上得到广泛应用，目前研究表明脐带来源的间充质干细胞也将有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞，表达多种干细胞的特有标志，具有分化潜力大，增殖能力强，免疫原性低，取材方便，无道德伦理问题限制，易于工业化制备等特征。

脐带间充质干细胞在脱离培养条件后会很快死亡，长期保存的话一般会在液氮中冻存。但是对于需要短途运输的脐带间充质干细胞，采用液氮保存的方式不仅增加运输成本，对运输条件要求苛刻，而且液氮中保存的细胞由于处于超低温下，细胞需要经过较长的复苏过程，该过程中也会有大量细胞凋亡，造成细胞的利用率很低，极大的限制了脐带间充质干细胞在临床上的应用。

现有技术中也有部分保存液可以实现脐带间充质干细胞在低温下的保存，如专利CN201910924898.4中公开了一种脐带间充质干细胞保存，保存液可以实现在4℃保存脐带间充质干细胞。但是该保存液中需要使用低糖MDMEM培养基和人血白蛋白。培养基由于成分复杂，用于细胞保存时对细胞后续的应用造成安全隐患。人血白蛋白为人血液制品，因原料来自人血，虽然对原料血浆进行了相关病原体的筛查，并在生产工艺中加入了去除和灭活病毒的措施，但理论上仍存在传播某些已知和未知病原体的潜在风险，临床使用时应权衡利弊。所以需要提供一种更为安全的保存液，在保证脐带间充质干细胞活性的前提下不会对细胞的后续临床应用造成安全隐患。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于脐带间充质干细胞的运输保存液，成分安全，有效满足脐带间充质干细胞的运输需求。

本发明的目的之二在于提供一种脐带间充质干细胞的运输保存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种脐带间充质干细胞的运输保存液，由以下原料组成：氯化钠注射液、α-倒捻子素、橙皮甙、小白菊内酯、葡萄糖、腺苷、磷酸二氢钠。

进一步地，所述脐带间充质干细胞的运输保存液由以下重量份的原料组成：氯化钠注射液85-95份、α-倒捻子素2.8-3.5份、橙皮甙4.5-7.5份、小白菊内酯1.6-2.4份、葡萄糖3-8份、腺苷0.5-1份、磷酸二氢钠1-5份。

进一步地，所述脐带间充质干细胞的运输保存液，由以下重量份的原料组成：氯化钠注射液90份、α-倒捻子素3.1份、橙皮甙6份、小白菊内酯1.8份、葡萄糖5份、腺苷0.7份、磷酸二氢钠3份。

进一步地，所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9%。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种脐带间充质干细胞的运输保存方法，采用上述的保存液进行运输保存。

进一步地，所述脐带间充质干细胞的运输保存方法包括以下步骤：将保存液在4-8℃预冷后，加入待运输的脐带间充质干细胞，然后在4-8℃条件下保存。

进一步地，所述脐带间充质干细胞为传代培养得到的P2-P10代细胞。

进一步地，所述保存液中脐带间充质干细胞的浓度为1-5×10

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脐带间充质干细胞的运输保存液，以氯化钠注射液为主要成分，不含血清，人血白蛋白等血液制品，成分明确安全。本发明的保存液中还添加α-倒捻子素、橙皮甙、小白菊内酯三种成分作为保护剂，对细胞膜起到保护作用，避免细胞在降温后局部电解质浓度增高，引起细胞内部空间结构紊乱，帮助细胞快速适应低温环境，同时避免细胞失活。还添加葡萄糖、腺苷、磷酸二氢钠，一方面和氯化钠注射液一起维持细胞外渗透压；另一方面为细胞提供能量，有助于细胞快速复苏。

本发明还提供了一种脐带间充质干细胞的运输保存方法，采用本发明的运输保存液，实现在4-8℃下对细胞的短期保存，在保存3天后细胞的存活率还在90%以上，充分满足临床的使用要求。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1至3中所保存的P2-P10代脐带间充质干细胞均是通过常规培养方法得到，本领域技术人员可根据需要进行常规选择。

实施例1

一种脐带间充质干细胞的运输保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度为0.9%氯化钠注射液90份、α-倒捻子素3.1份、橙皮甙6份、小白菊内酯1.8份、葡萄糖5份、腺苷0.7份、磷酸二氢钠3份。

一种脐带间充质干细胞的运输保存方法，包括以下步骤：取2mL保存液预冷至4℃，加入传代培养得到的P2代脐带间充质干细胞，细胞浓度为1×10

实施例2

一种脐带间充质干细胞的运输保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度为0.9%氯化钠注射液85份、α-倒捻子素2.8份、橙皮甙4.5份、小白菊内酯1.6份、葡萄糖3份、腺苷0.5份、磷酸二氢钠1份。

一种脐带间充质干细胞的运输保存方法，包括以下步骤：取2mL保存液预冷至6℃，加入传代培养得到的P5代脐带间充质干细胞，细胞浓度为3×10

实施例3

一种脐带间充质干细胞的运输保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度为0.9%氯化钠注射液95份、α-倒捻子素3.5份、橙皮甙7.5份、小白菊内酯2.4份、葡萄糖8份、腺苷1份、磷酸二氢钠5份。

一种脐带间充质干细胞的运输保存方法，包括以下步骤：取2mL保存液预冷至8℃，加入传代培养得到的P10代脐带间充质干细胞，细胞浓度为5×10

对比例1

对比例1提供一种脐带间充质干细胞的运输保存液，和实施例1的区别为：省去α-倒捻子素，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种脐带间充质干细胞的运输保存液，和实施例1的区别为：省去小白菊内酯，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种脐带间充质干细胞的运输保存液，和实施例1的区别为：省去α-倒捻子素和橙皮甙，将小白菊内酯的用量调整为10.9份，其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种脐带间充质干细胞的运输保存液，和实施例1的区别为：省去小白菊内酯和α-倒捻子素，将橙皮甙的用量调整为10.9份，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种脐带间充质干细胞的运输保存液，和实施例1的区别为：省去小白菊内酯和橙皮甙，将α-倒捻子素的用量调整为10.9份，其余均和实施例1相同。

对实施例1至3，对比例1至5的样品，分别在保存0d（将细胞加入保存液后即刻检测）、1d、2d、3d、4d时取样，采用台盼蓝染色法用Countstar细胞计数仪进行计数，活细胞排斥台盼兰，被染成蓝色的为死亡的细胞，统计不同保存时间下脐带间充质干细胞活率，结果如表1所示。

表1

由表1可以看出实施例1至3的保存液中脐带间充质干细胞的活率较高，在4-8℃条件下保存3d后细胞活率均在90%以上，到第4d才开始有明显下降。

对比例1中省去了α-倒捻子素，对比例2中省去了小白菊内酯，在保存第1d时细胞存活率还在90%以上，但是随着保存时间的延长，在第4d时细胞活率仅为44.85%和53.79%，下降显著，其保存的细胞不能满足科研临床使用要求。

对比例3、对比例4和对比例5中，分别省去了α-倒捻子素、小白菊内酯、橙皮甙中的两种，并增加剩余组分的用量，从表1可以看出对比例3至5保存液中的脐带间充质干细胞随着保存时间的延长，细胞活率均有不同程度的下降，在第3d时细胞活率在60%-70%之间，远远不及实施例1至3。由此可知，本发明的保存液中通过添加α-倒捻子素、橙皮甙、小白菊内酯三种成分作为保护剂，对细胞膜起到保护作用，避免细胞在降温后局部电解质浓度增高，引起细胞内部空间结构紊乱，帮助细胞快速适应低温环境，同时避免细胞失活，上述成分和葡萄糖、腺苷、磷酸二氢钠等一起延长细胞保存时间，提高细胞活率，充分满足脐带间充质干细胞的运输需求。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。