公开/公告号CN113812632A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-12-21
原文格式PDF
申请/专利权人 江南大学;
申请/专利号CN202111087687.3
申请日2021-09-16
分类号A23L33/135(20160101);A23L29/30(20160101);A23L29/00(20160101);A23P10/30(20160101);
代理机构32272 南京禹为知识产权代理事务所(特殊普通合伙);
代理人刘峰
地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
入库时间 2023-06-19 13:48:08
技术领域
本发明涉及爆珠制作领域，特别是涉及一种小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠及其制备方法。
背景技术
益生菌是指通过摄入一定数量而对宿主具有许多健康益处的活微生物，对人体具有缓解乳糖不耐症、增强免疫力、抵抗胃肠感染等诸多益处。益生菌只有足够数量定殖人体肠粘膜上，才会发挥上述功效。益生菌产品的制备多采用冷冻干燥方式。目前面临冷冻干燥过程、贮藏期间和胃肠消化过程中易失活的难题。
益生菌的微胶囊化是通过将益生菌包埋在壁材中，对益生菌提供外加保护来减轻益生菌在加工、贮藏和胃肠道中的失活。益生菌微胶囊的壁材多选用天然安全的多糖和蛋白类。其中，交联是一种形成微胶囊的常用方式。在食品工业中，考虑到安全和法律原因，通常更偏向于使用物理交联而不是共价交联，在此使用钙离子交联方法。钙离子在阴离子多糖的交联和胶凝化方面效果突出，如海藻酸钠、果胶和卡拉胶。
单独的钙离子交联多糖含有较大空隙率，并且在酸性条件下(pH<2.0)会引起“爆炸性释放”等，不利于益生菌在恶劣环境下的存活。因此，复配其他多糖是一种有效策略。透明质酸是由N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸的重复二糖单元组成的阴离子多糖。作为一种生物相容性多糖，透明质酸具有多种生理功能，例如抗衰老，抗炎，血管生成和胚胎发育等。透明质酸生理功能与其分子量也有关系。目前透明质酸的生产多采用发酵法，来源于菌体周围荚膜主要成分。受微生物生物膜对菌体保护的启发，透明质酸可复配钙离子交联多糖，对益生菌起到保护作用，然而目前尚未研究。
中国2008年批准透明质酸为新资源食品，使用范围为保健食品原料；2021年1月7日，国家卫健委批准透明质酸为新食品原料，使用范围为乳及乳制品，饮料类，酒类，可可制品，巧克力及巧克力制品(包括代可可脂巧克力及制品)以及糖果、冷冻饮品。因此，透明质酸作为益生菌壁材应用于广泛的益生菌普通食品中是可行的。
小分子糖，如葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、海藻糖和蔗糖等，可作为冷冻干燥保护剂。并且具有与透明质酸协同作用，共同提高益生菌存活率的潜力。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有爆珠产品中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是，克服现有爆珠产品的不足，提供一种小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠，其特征在于：所述多糖凝胶珠包括小分子糖、透明质酸、钙离子和多糖。
本发明另一个目的是，提供一种小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法，其包括如下步骤：准备材料：配制液体培养基、固体培养基、0.85％的生理盐水，与其他待使用器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20min；
制备微生物菌悬液：将使用的微生物培养24h后在4℃、3500g的条件下离心10min清洗2次，制成菌悬液；
糖溶液制备：称取小分子糖于去离子水中，搅拌至完全溶解；
加入透明质酸：向制得的糖溶液中加入透明质酸并搅拌至完全溶解；
加入多糖：称取多糖于加入糖溶液中，搅拌至完全溶解并脱气制得芯料液；
制备钙离子溶液：称取钙离子溶于去离子水中，搅拌至完全溶解；
菌悬液与芯料液混合：将菌悬液加入到芯料液中进行搅拌；
菌悬液与芯料液混合后的液体滴加到钙离子溶液中，30min后滤网过滤并冲洗。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：制备微生物菌悬液中，微生物为乳酸菌、双歧杆菌中的一种或几种。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：制备微生物菌悬液中，微生物为鼠李糖乳杆菌LGG。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：糖溶液制备中，小分子糖包括海藻糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、透明质酸中的一种或几种。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：糖溶液制备中，小分子糖为海藻糖。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：加入多糖中，所述多糖包括果胶、卡拉胶、海藻酸钠中的一种或几种。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：加入透明质酸中，透明质酸的分子量为30万Da。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：钙离子包括氯化钙、碳酸钙中的一种或几种。
作为本发明所述小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的制备方法的一种优选方案，其中：糖溶液制备中，糖溶液的浓度为5％(w/v)，所述加入透明质酸中，透明质酸的浓度为0.5％(w/v)，所述加入多糖中，优选的海藻酸钠浓度为1.0％(w/v)。
本发明以小分子糖、不同分子量透明质酸、钙离子交联多糖作为壁材，采用挤压法形成负载益生菌的凝胶珠。该体系能够显著提高益生菌的冷冻干燥存活率、贮藏期间的存活率以及胃肠消化存活率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例1制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠；
图2为本发明实施例2制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠；
图3为本发明实施例2制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取100万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例2
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例3
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为2％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例4
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为8％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例5
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.2％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例6
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.8％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例7
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例8
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.8％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为2.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例9
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例10
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为2.8％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例11
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取碳酸钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例12
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的双歧杆菌BB12接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例13
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的嗜热链球菌IFFI6038接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例14
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取葡萄糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例15
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取果糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例16
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取乳糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例17
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取甘露糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例18
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取透明质酸于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取海藻酸钠于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例19
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取果胶于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例20
(1)配置液体培养基、固体培养基、0.85％生理盐水，与其它器具材料一起使用高压灭菌锅115℃灭菌20分钟；
(2)取冻存的鼠李糖乳杆菌LGG接种于液体培养基中厌氧培养24小时，并离心(4℃，3500g，10分钟)清洗2次，制成菌悬液；
(3)称取海藻糖于去离子水中，浓度为5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(4)称取30万Da透明质酸于步骤(3)溶液中，浓度为0.5％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(5)称取卡拉胶于步骤(4)溶液中，浓度为1.0％(w/v)，搅拌至完全溶解并脱气；
(6)称取氯化钙于去离子水中，浓度为1.9％(w/v)，搅拌至完全溶解；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液，菌悬液和芯料液的配比为1:20(v/v)，加入后搅拌均匀；
(7)取步骤(2)菌悬液加入步骤(5)制得的芯料液中搅拌；
(8)使用流动泵，将步骤(6)制得的氯化钙溶液以600rpm的转速进行搅拌，将步骤(7)制得的芯料液加入到步骤(6)制得的芯料液氯化钙溶液中，30分钟后滤网过滤并冲洗，制得负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠。
实施例21
将实施例1～19中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠进行冷冻干燥存活率、贮藏存活率、耐胃酸存活率、耐胆酸存活率测定记录在表1中，测定方法如下：
冷冻干燥存活率测定方法：取0.01g冻干样品放于5ml的0.055M柠檬酸钠溶液中涡旋解囊，然后梯度稀释，倾倒法混合固体培养基，37℃厌氧培养48h，计数。
冷冻干燥存活率＝冷冻干燥后总菌数量(log CFU)/包埋总菌数量(log CFU)*100％
贮藏存活率测定方法：分别取0.01g贮藏在25℃、水分活度分别控制为0.113，0.313，0.501，0.812的60天冻干样品，放于5ml的0.055M柠檬酸钠溶液中涡旋解囊，然后梯度稀释，倾倒法混合固体培养基，37℃厌氧培养48h，计数。
贮藏存活率＝贮藏后菌数量(log CFU/g)/冷冻干燥后菌数量(log CFU/g)*100％
耐胃酸存活率测定方法：分别取0.01g样品放置于600rpm搅拌下的体外模拟胃液(pH＝2)2小时，然后用灭菌水冲洗两次，放于5ml的0.055M柠檬酸钠溶液中涡旋解囊，然后梯度稀释，倾倒法混合固体培养基，37℃厌氧培养48h，计数。
耐胃酸存活率＝胃酸后菌数量(log CFU/g)/冷冻干燥后菌数量(log CFU/g)*100％
耐胆酸存活率测定方法：
分别取0.01g样品放置于600rpm搅拌下的体外模拟胆盐溶液中(pH＝6.8)1小时，然后用灭菌水冲洗两次，放于5ml的0.055M柠檬酸钠溶液中涡旋解囊，然后梯度稀释，倾倒法混合固体培养基，37℃厌氧培养48h，计数。
耐胆酸存活率＝胆酸后菌数量(log CFU/g)/冷冻干燥后菌数量(log CFU/g)*100％
表1实施例1～中制得凝胶珠的存活率数据
由表1可得，根据实施例1、2中冷冻干燥存活率、贮藏存活率、耐盐酸存活率和耐胆酸存活率数据可得，当使用的透明质酸分子量上升时，会导致制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的菌种存活率得到提升，同时结合目前30万Da和100万Da的透明质酸价格相同，以及30万Da以下透明质酸价格较高的市场行情，结合性能和成本两方面考虑，优选透明质酸的分子量优选为30万Da。
根据实施例2、3、4中冷冻干燥存活率、贮藏存活率、耐盐酸存活率和耐胆酸存活率数据可得，实施例2中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的菌种存活率最高，优选的海藻糖溶液的浓度为5％
(w/v)。
根据实施例2、5、6中冷冻干燥存活率、贮藏存活率、耐盐酸存活率和耐胆酸存活率数据可得，实施例2中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的菌种存活率最高，优选的透明质酸溶液的浓度为0.5％(w/v).
根据实施例2、7、8中冷冻干燥存活率、贮藏存活率、耐盐酸存活率和耐胆酸存活率数据可得，实施例2中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的菌种存活率最高，优选的海藻酸钠的浓度为1.0％(w/v)。
根据实施例2、9、10中冷冻干燥存活率、贮藏存活率、耐盐酸存活率和耐胆酸存活率数据可得，实施例2中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的菌种存活率最高，优选的氯化钙的浓度为1.9％(w/v)。
根据实施例2、11中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的数据可得，我方发明中使用的钙离子溶液包括碳酸钙等多种钙盐溶解制得。
根据实施例2、12、13中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的数据且实施例2、12、13中制得的凝胶珠均具有成型的形状，可以得到我方发明中制得的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠可以对于多种微生物具有良好的保持存活的性能。
根据实施例2、14、15、16、17、18中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的数据可得，我方发明中制得的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶可将透明质酸替换为其他种类的糖类物质。
根据实施例2、19、20中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的数据可得，我方发明中多糖的使用包括多种多糖的使用，对于使用的多糖具有多种类适配于使用的特性。
由实施例1、2中制得的负载益生菌的小分子糖/透明质酸/钙离子交联多糖凝胶珠的性能可得，采用的透明质酸从100万Da转变为30万Da时，性能有着明显增强，透明质酸的分子量的降低有着明显的提高性能的趋势，但是采用30万Da以下分子量的透明质酸时，会有着明显的成本上升的问题。
如上述论述可得，我方发明中制备的凝胶珠成品对于微生物的贮藏率有着明显的提高作用。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
机译： 使用第一多糖衍生物和第二多糖衍生物，第一和第二多糖衍生物，第一透明质酸衍生物（ah）和第二透明质酸衍生物（ah）的组合，多缸注射器系统，用于局部形成交叉联多糖水凝胶，局部形成交联水凝胶的方法
机译： 制备交联多糖凝胶的方法，基本上抗透明质酸酶降解的交联多糖凝胶，药物组合物，治疗或预防选自组织增大，关节炎，组织粘连的疾病或病症的方法，有需要的个体并使用凝胶剂的免疫原性，粘膜疾病，皮肤病学状况，眼科疾病，激素疾病，关节润滑疾病和美容疾病
机译： 交联透明质酸凝胶的制备方法及由其制备的交联透明质酸凝胶
