PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法，涉及生物制品质量控制检测技术领域。本发明提供的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法，采用探针qPCR法，具有引物和探针双重特异性，提高了检测的特异性和准确性，灵敏度高，检测定量限可低至3pg/mL，适用于由PG13细胞表达或生产的细胞产品、半成品的快速放行质控。本发明基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术，具有高效、快速、准确、特异性强的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品质量控制检测技术领域，尤其涉及PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法。

背景技术

PG13细胞作为包装细胞应用于细胞产品(如CAR-T或TCR-T细胞等)的开发，通常是采用PG13细胞包装逆转录病毒，生产逆转录病毒载体，再侵染患者T淋巴细胞，制成细胞制剂。PG13细胞作为生产逆转录病毒载体的包装细胞，其残留DNA可能存在潜在致癌性，因此，从安全性角度，需要对产品的PG13细胞DNA残留制定限度标准，《中国生物制品规程》中规定rDNA含量每剂量应不高于10ng。《中国药典》2020版(三部)中提出需采用适宜的方法对生物制品中的宿主DNA进行检测，限定标准在各论中多为小于10ng/剂。美国食品药品监督管理局(FDA)颁布的指导原则规定生物制品宿主细胞DNA残留量不得超过100pg/剂，对于大剂量的生物制品，根据其残余DNA来源和给药途径，宿主DNA的残留量不超过10ng/剂。

对于外源性DNA残留量的检测方法，《中国药典》2020年版通则中，收录了DNA探针杂交法和荧光染料法、定量PCR法三种，其中DNA探针杂交法，耗时较长且灵敏度较低，只可定量检测至微克与纳克级别。荧光染料法，不具有序列特异性，所以容易受到其他DNA序列的干扰。且灵敏度低，以PicoGreen染料法为例，仅能检测0.2ng的纯DNA溶液。而实时定量PCR法是一种灵敏度高、特异性强且可通过实时监控进行定量的核酸检测技术，目前常用的有两种化学物质，一种是基于双链DNA的结合染料，如SYBR Green，但其与DNA亲和力强，通常对PCR反应有抑制作用；另一种是TaqMan技术，此技术特异性强，灵敏度较高，它的定量范围也最宽，可以从微克级别跨越至飞克级别。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有的外源性DNA残留量检测方法灵敏度低，特异性差，不适用以PG13作为宿主细胞的细胞疗法的产品质控和检测。

为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

本发明提供PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，包括引物对及探针；

所述引物对、探针的核苷酸序列如下所示，或与这些序列具有至少95％同一性的同功能序列；

Primer-F(SEQ ID No 1)：TCCGAAGGTCCAGAGTTCAA；

Primer-R(SEQ ID No 2)：TCAGACACTCCAGAAGAGGG；

Probe(SEQ ID No 3)：CCACATGGTGGCTCACAACCATCCGTA；

所述探针上连接有荧光基团。

其进一步地技术方案为，所述探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为TAMRA。

其进一步地技术方案为，还包括Premix Ex Taq、ROX Reference Dye II、UltraPure water、PG13细胞标准品。

其进一步地技术方案为，荧光定量qPCR检测的反应体系中，引物的反应浓度为10μM，探针的反应浓度为10μM。

其进一步地技术方案为，荧光定量qPCR检测的反应体系为15μL，其组成为PremixEx Taq 10μL、Primer-F 0.4μL、Primer-R 0.4μL、Probe 0.8μL、ROX Reference Dye II0.2μL、UltraPure water 3.2μL。

其进一步地技术方案为，荧光定量qPCR检测的反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，63℃34s，40个循环。

本发明还提供所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒在检测由PG13细胞表达或生产的产品中DNA残留量的应用。

可以理解的，所述产品可以是细胞产品、重组疫苗或单克隆抗体。

本发明还提供一种PG13宿主细胞DNA残留检测方法，包括步骤：

使用磁珠法进行样品前处理；

配制标准曲线用标准品溶液；

使用所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒对样品进行DNA残留量的检测；

其进一步地技术方案为，该检测方法还包括制备PG13细胞标准品，并精确测定PG13细胞标准品中PG13细胞基因组DNA的浓度。

与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

本发明提供的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法，采用探针qPCR法，具有引物和探针双重特异性，提高了检测的特异性和准确性，灵敏度高，检测定量限可低至3pg/mL，适用于由PG13细胞表达或生产的细胞产品、半成品的快速放行质控。

本发明提供的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法，基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术，具有高效、快速、准确、特异性强的优点。

附图说明

图1为标准品的荧光定量PCR标准曲线图；

图2为标准品的荧光扩增图。

具体实施方式

下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及使用该试剂盒进行DNA残留量的检测方法

本实施例提供PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，包括引物对及探针，具体介绍如下：

1、引物及探针

PG13细胞是利用家鼠(Mus musculus)细胞株NIH3T3改造而来的逆转录病毒包装工具细胞系。通过对已发表文献公开的核苷酸序列对比分析，我们发现在家鼠基因组中存在一类与人转座子序列(human Alu transposon element)发挥相似作用的短序列，分为两个家族，B1 sequences和B2 sequences。它们的共同特点是在家鼠基因组中散布存在，保守片段长度为150bp-200bp，拷贝数可达10

表1:

2、标准品的制备

本发明实施例所用标准品为PG13细胞，其制备过程具体如下：

2.1试剂

QIAamp DNA Mini Kit，QIAGEN；

RNaseA，天根生物；

Quant-iTTM

UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water(以下简称UltraPure water)，Invitrogen；

Primer-F、Primer-R、Probe，生工生物；

琼脂糖，50×TAE DNA Electrophoresis Buffer，核酸染料，6×Loading buffer，DL500 Marker。

2.2制备过程

2.2.1PG13细胞基因组DNA的提取

取生长状态良好的PG13细胞约≤5×10

然后，按照《QIGEN基因组DNA提取试剂盒》说明书进行PG13细胞基因组DNA的提取。

2.2.2PG13基因组DNA质量检测

初步浓度和纯度检测：使用超微量紫外分光光度计测定提取的PG13细胞基因组DNA的浓度和纯度，OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间，OD260/OD230＞2。

基因组完整性检测：将提取的PG13细胞基因组DNA利用琼脂糖凝胶电泳检测是否发生降解和是否有蛋白残留，若凝胶成像中PG13基因组条带为单一无降解条带，则符合要求，否则需要重新进行基因组DNA的提取。

2.3PG13细胞基因组DNA的稀释

用1×TE稀释PG13细胞基因组DNA至浓度为20ng/μL，记为PG13基因组标准品(stock)。

2.4PicoGreen法精确测定提取的PG13细胞基因组DNA的浓度

采用《Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit》试剂盒，利用标准曲线法精确测定PG13基因组标准品(stock)的浓度。

2.5标准品的储存

将PicoGreen法精确定量的PG13基因组标准品(stock)稀释至15ng/μL，充分吹打混匀后，分装到0.2mL PCR管中，10μL/管，于-80℃冰箱保存。

3、PG13宿主细胞DNA残留检测过程

3.1样品

待检样品：TCR-T细胞产品的上清液(规格100mL/剂)；

标准品：PG13基因组标准品(stock)(15ng/μL)；

阴性质控：制剂buffer(含1％HSA的0.9％氯化钠注射液)。

3.2试剂

(1)Premix Ex Taq(Probe qPCR)(Taqman探针法预混型试剂)，Takara；

(2)UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water(简称UltraPure water)，Invitrogen；

(3)宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)，湖州申科。

(4)Primer-F、Primer-R、Probe，生工生物。

3.3样本前处理

按照SHENTEK《宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)》说明书进行操作，所用样品具体包括：

阴性质控(NCS)：100μL制剂buffer(含1％HSA的0.9％氯化钠注射液)；

待检样品：100μL TCR-T细胞产品的上清液；

阳性质控(PCS)：100μL制剂buffer(含1％HSA的0.9％氯化钠注射液)+10μL PG13基因组标准品(3pg/μL)；

加样回收质控(ERC)：100μL TCR-T细胞注射液的上清液+10μLPG13基因组标准品(3pg/μL)。

3.3.1样品消化

(1)在上述样品中均加入5mol/L NaCl 10μL。

(2)每管加入10μL蛋白酶K和100μL蛋白酶K缓冲液，震荡混匀，短暂离心，消化液震荡混匀后，置金属恒温器上55℃孵育1小时。

然后，按照SHENTEK《宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)》说明书进行DNA结合、DNA洗涤、DNA洗脱步骤提取DNA。

3.4qPCR检测

3.4.1qPCR反应体系的配制

标准品/检测样品的反应体系配制见下表2。

表2标准品/检测样品的qPCR反应体系配制

3.4.2标准曲线用标准品的配制

(1)将PG13基因组标准品(stock)从-80℃冰箱取出，放4℃冰箱解冻。

(2)按下表3配制不同浓度的标准品溶液：

表3：标准曲线用标准品的配制

3.4.3qPCR加样、上机检测

(1)设置靶点：靶点名称为“PG13-DNA”，报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“TAMRA”，检测参比荧光为“ROX”。

(2)设置反应程序，如下表4所示：

表4 qPCR反应条件

3.4.4结果分析

打开保存的文件，点击分析按钮(Analyze)，数据分析后导出Excel表。检测结果如图1、图2及表5所示。

3.4.5按下式进行待检样品的DNA残留量的计算：

表5 PG13宿主细胞DNA残留检测结果

3.4.6结果判定

本实施例的检测实验结果同时满足以下条件，则实验结果有效：

(1)标准曲线相关系数R

(2)无模板阴性对照(NTC)的Ct值为Undetermined；

(3)阴性质控(NCS)的Ct Mean值为Undetermined或≥37；

(4)同一浓度标准曲线点、质控样品和同一检测样品的复孔Ct值之间的标准偏差≤0.5；

(5)阳性质控(PCS)样品、加样回收质控样品(ERC)的回收率介于50％～150％之间；

4、专属性(引物特异性)验证试验

TCR-T细胞产品生产过程中所用到的样品都有可能与PG13细胞基因组引物同源，因此需要排除干扰。本次专属性验证的样本主要有：Phoenix-ECO细胞、pMSGV-质粒、健康人PBMC、患者本身的TCR-T细胞(Control-T)、TCR-T细胞、DMEM完全培养基(含10％FBS)、T淋巴细胞完全培养基(X-vivo15完全培养基)、阳性对照样本(PG13细胞基因组DNA)，利用《QIAGEN细胞基因组DNA提取试剂盒》分别进行以上样品的基因组DNA的提取，将上述样品均按实施例1所示方法进行荧光定量PCR检测，来验证引物和探针的特异性。结果如表6所示。

表6专属性验证试验检测结果

其中，专属性验证试验的标准曲线线性方程为，y＝-3.323lgX+27.613,R

根据表6结果可知，除了阳性样本PG13基因组DNA，其余样本均未检出，说明本发明提供的引物和探针不会在这些样本中发生非特异性反应。因此，本发明提供的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒中的引物对PG13细胞具有良好的特异性。

5、灵敏度试验

本实施例将PG13基因组标准品(stock)用UltraPure Water稀释出一系列上样质量浓度的样品：1500pg/反应、150pg/反应、15pg/反应、1.5pg/反应、0.15pg/反应以及0.015pg/反应，分别标记为：ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6，得到的标准曲线及扩增结果见图1及图2。

如图2的扩增曲线显示：各浓度的扩增曲线均有明显的指数增长期。如图1的标准曲线：线性方程Y＝-3.244lgX+27.702，R

从表7的重复实验结果中可看出，额外三次实验结果的标准曲线，在DNA模板量1500pg/反应至0.015pg/反应之间的线性很好，R

检测结果见下表7：

表7灵敏度试验标准曲线重复实验结果

6、准确度与精密度验证

由于我们的TCR-T细胞产品的上清液中PG13宿主细胞DNA残留非常低，因此无法考察样品的检测精密度，所以本方案是采用向两批次的待检样品中加标(高、中、低浓度)的方式作为质控样品进行进行qPCR检测，由同一实验人员重复该实验三次。根据检测结果计算三次实验高、中、低浓度样品加标的回收率，来验证准确度；根据检测结果计算三次实验高、中、低浓度样品加标测定值的CV值，来验证批内、批间精密度，结果见表8-10。

另由两名不同的实验人员在不同的时间进行各批次样品加标的检测，比较不同实验人员的测定结果，计算中间精密度，结果见表11。

其中，(1)高浓度加标：在样本中加入1125pg/反应的PG13基因组标准品stock；(2)中浓度加标：在样本中加入12.5pg/反应的PG13基因组标准品stock；(3)低浓度加标：在样本中加入1pg/反应的PG13基因组标准品stock。

表8准确度验证(回收率％)结果

表9批内精密度验证结果

表10批间精密度验证结果

根据上表8-10的结果可知，两批次样品的高中低浓度加标回收率均介于50％～150％之间，符合质量标准要求。

在三次实验中，两批次样品的高中低加标含量测定值的批内变异系数不超过15％、批间变异系数不超过25％。

表11中间精密度验证结果

由表11可知，在不同实验人员的检测结果中，二批次样品的高中低加标的含量测定值的变异系数不超过20％。

综上结果可知，本发明提供的试剂盒和检测方法的精密度验证符合标准要求。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 深圳因诺免疫有限公司、深圳市因诺转化医学研究院

<120> 一种PG13宿主细胞 DNA残留检测试剂盒及检测方法

<130> 1

<141> 2021-10-27

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tccgaaggtc cagagttcaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tcagacactc cagaagaggg 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccacatggtg gctcacaacc atccgta 27