一种小麦单株穗数主效QTL-qSnpp-5D连锁的分子标记方法和应用

摘要

本发明公开了小麦品种科农9204在5D染色体上一个新的与单株穗数主效QTL‑qSnpp‑5D连锁的分子标记方法和应用。利用本发明InDel标记如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对5D‑1498421对小麦基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出大小为332bp的DNA片段，则标志着在5D染色体上有关单株穗数的增效等位变异基因的存在。以小麦基因组DNA为模板，采用上述引物组进行PCR扩增所得产物即为与小麦单株穗数性状相关的分子标记。本发明对于加快小麦单株穗数的遗传改良进程，提高小麦产量性状具有重要的理论和实践意义。

说明书

技术领域

本发明属于小麦分子生物技术与育种技术领域。通过利用与小麦单株穗数主效QTL紧密连锁的分子标记，从而利用其对小麦单株穗数进行分子标记辅助育种及遗传改良。

背景技术

小麦作为世界上播种面积最大、产量最多、分布最广泛的粮食作物，与此同时作为我国重要的口粮，对我国的粮食安全具有至关重要的作用。小麦产量的三要素有单位面积穗数(单株穗数)、穗粒数和千粒重组成。单株穗数与小麦单位面积穗数直接相关，单株穗数的增加是提高小麦产量的重要途径之一，小麦单株成穗数较多是个体发育良好的标志。挖掘新的提高小麦单株穗数与分蘖数相关基因，开发紧密连锁分子标记，对加快高产小麦新品种的选育具有重要的理论意义和实践应用价值。

小麦单株穗数是典型的数量性状，由多基因控制，且易受环境条影响。应用传统的质量遗传学的方法，无法有效地阐明控制数量性状表达基因的数目、位置、遗传效应及互作方式。随着分子生物学和分子标记技术的发展，出现了以分子标记遗传图谱和各种统计模型为基础的数量性状位点(quantitative trait loci，QTL)作图技术。利用QTL可检测出目标性状在染色体上的位置和效应以及与其它基因的关系。因此，不断丰富小麦的单株穗数基因，通过分子标记技术，研究和开发与小麦单株穗数相关的优异等位基因，可促进加快小麦遗传育种的选育进程。

迄今已发现小麦21条染色体上均有小麦单株穗数QTL(张娜等，农业生物技术学报，DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2021.03.003)，通过数量性状基因位点(Quantitative trait locus，QTL)分析，利用多个作图群体在5D染色体上检测与单株穗数相关的QTL位点。(Li et al.Front.Plant Sci.,DOI10.3389/fpls.2021.611106；Huang etal.Theor.Appl.Genet.DOI：10.1007/s00122-002-1179-7；Yang et al.J TriticeaeCrops.DOI：10.7606/j.issn.1009-1041.2013.05.005)目前，在5D染色体上与单株穗数QTL相关的标记开发及分子育种应用的报道相对较少。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种小麦单株穗数主效QTL--qSnpp-5D连锁的分子标记和应用，通过获得的与小麦单株穗数主效QTL-qSnpp-5D紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种或品系中是否在该位点具有增加小麦单株穗数的优异等位基因，以加快高产小麦新品种选育进程。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦单株穗数性状的引物组，为能够扩增得到如下DNA片段的引物组：所述DNA片段是以小麦基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对5D-1498421进行PCR扩增所得的DNA片段。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明公开的小麦单株穗数连锁的分子标记5D-1498421充分体现了小麦品种或品系的单株穗数主效QTL-qSnpp-5D，通过分子标记对小麦品种或品系PCR扩增，可以快捷地对小麦品种或品系是否具有该单株穗数的QTL进行判断，以便快速筛选出具有增加小麦单株穗数的QTL-qSnpp-5D的小麦品种或品系用于育种，可大大加快高产小麦新品种选育进程，为小麦产量性状分子育种提供优异基因资源和选择工具。

2)将本发明提供的与小麦单株穗数紧密连锁的分子标记方法用于小麦育种，只需检测这些标记的扩增条带特性，可以判断单株穗数主效基因位点的增效变异存在与否，来预测小麦的单株穗数表型，用于指导小麦产量性状改良的育种工作，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了小麦品种或品系的选择效率和质量，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定，为小麦育种开拓更多新的单株穗数基因标记资源。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明小麦品种科农9204的单株穗数主效QTL在染色体5D上的作图区间；图中：空心长方形代表染色体，左侧是分子标记的名称，右侧数字是标记在染色体上的位置，单位是Mb；图中共有两种分子标记，5D-1498421为InDel标记，其余为SNP标记，下划线部分为5D-1498421分子标记；染色体右方黑色的长方形分别表示单株穗数在5个环境下的QTL作图区间。

图2是本发明5D-1498421在部分KJ-RIL家系扩增结果；M1表示D2000；M2表示50bpDNA Ladder；K表示小麦品种科农9204的DNA扩增条带，J为小麦品种京411的DNA扩增条带；数字1-46表示部分KJ-RIL群体扩增结果；

图3是本发明在8个环境下利用IciMapping 4.1检测到的LOD峰值；

图4是本发明在8个环境下188个KJ-RIL家系基于5D-1498421的单株穗数和最大分蘖数的单标记分析及8个环境下188个KJ-RIL家系基于5D-1498421的单株穗数和最大分蘖数的单标记分析：AA表示等位基因来自科农9204，BB表示等位基因来自京411；**：P<0.01表示差异极显著，*：P<0.05表示差异显著。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明所述小麦品种科农9204为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037；京411为审定品种，于1991年通过北京市品种审定；1992年通过天津市、山西省和全国品种审定；京411可以从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984。

本发明中2×Taq PCR StarMix为预混的含有优化浓度的高纯度Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg

实施例1与小麦单株穗数主效QTL-qSnpp-5D紧密连锁的分子标记

采用5D-1498421标记引物：

上游引物序列：GACCAATTCACTTTCCGACG(如SEQ ID NO:1所述)、下游引物序列：CTCCGACTTTCATGGACAGT(如SEQ ID NO:2所述)，

用5D-1498421标记引物对小麦品种科农9204的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增反应体系为10μl，包括：0.5μl如SEQ ID NO:1所示的上游引物，0.5μl如SEQ ID NO:2所示的下游引物，1μl的DNA模板，5μl的2×Taq PCR StarMix，反应体系用ddH2O补至总量为10μl；

PCR扩增程序如下：DNA 95℃预变性5min后，[(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸展40s)循环34次]，最后72℃延伸5min，结束扩增，12℃保存。扩增产物在6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压150V电泳分离，银染法，获得对应的扩增产物的分子量为332bp(如SEQ ID NO:3所述)。

PCR程序采用的型号为：T100

实施例2与小麦单株穗数主效QTL-qSnpp-5D连锁的分子标记的筛选方法及应用

具体包括以下步骤：

(i)以5D染色体上等位基因表现为多单株穗数的小麦品种科农9204为母本、以5D染色体上等位基因表现为少单株穗数的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交产生的F2，F2逐代自交形成含有188个家系的F8代RIL群体；

(ii)用改良的CTAB法，即改良的十六烷基三甲基溴化铵法(Vander Beek et al.,1992)提取上述RIL群体各株系的DNA，采用InDel标记、基于芯片杂交SNP标记(图1)对所述家系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型值材料；InDel(insertion-deletion)标记即插入缺失标记，指的是根据两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计扩增这些插入缺失位点的PCR引物；SNP(single nucleotide polymorphism,SNP)又称为单核苷酸多态性，主要指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态。

改良的CTAB法提取叶片DNA的步骤包括：取钢珠和0.2g左右的新鲜叶片放入2.0ml离心管中，快速放在液氮中，摇晃磨成细粉；加CTAB提取液0.8ml，摇匀，65℃水浴30～60min，其间不时反转2-4次摇匀；离心管放置于室温冷却，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)或加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，剧烈摇晃1min混匀；8000rpm离心10min；吸上清600ul至另一1.5ml离心管中；加入0.8倍体积预冷的异丙醇(-20°预冷)沉淀DNA；12000rpm离心6min；倒掉上清，加入适量70％乙醇洗涤沉淀1-2次；离心管倾斜放置于通风橱吹干，待无酒精味，加400ul TE溶解，放-20℃冰箱长期保存。

用5D-1498421标记引物对KJ-RIL群体的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，0.5μl的上游引物，0.5μl的下游引物，5μl的2×Taq PCR StarMix，3μl的ddH

扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度6.0％，电泳缓冲液为1×TBE，150V恒压电泳2小时。凝胶制备及电泳过程：将玻璃板水平放置，平板放下边，凹板放上面，中间放上封条，试插梳子是否合适；小板每板需50ml的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，加20ul的TEMED和200ul 10％的过硫酸铵，搅拌均匀；用玻璃棒引流灌胶，若有气泡，及时敲打玻璃板将其赶出，灌胶完毕，将梳子插上；约10分钟后，观看凝胶是否凝固；拔下梳子，用去离子水冲洗胶孔，看胶孔是否有残胶，若有，用注射器将其吸出；将凝固好的玻璃板放置于电泳槽，凹槽朝里，用夹子夹住。上下各加满1×TBE；点样后电泳2个小时。进行硝酸银染色步骤：电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3min；用去离子水快速冲洗2–3次，每次30–40s；于银染液中染色5–7min后，用水快速冲洗(10s左右，不超过20s)；放入显影液中显影至扩增带出现(一般以Marker出现、颜色不再加深时止)；放入去离子水中停影，拍照，记录带型，得到非变性聚丙烯酰胺凝胶图片(图2)。由此进行结果分析，小麦品种科农9204扩增片段大小为332bp,小麦品种京411扩增片段大小为320bp。

(iii)将RIL群体进行了8个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考察不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的株高及穗下节间长，其中8个环境即：2011–2012、2012–2013、2013–2014连续3年在中国科学院栾城农业生态系统试验站(T1及T2：37°53’N，114°41’E)、2012–2013年在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京平西府农场(T3：40°06’N，116°24’E)及河南省新乡市业科学研究院辉县试验基地(T4：35°27’N，113°48’E)种植，每试验环境分高氮(High nitrogen，HN)和低氮(Low nitrogen，LN)两个处理；

其中LN处理，全年不施肥；而HN处理，每年播种前施300kg·hm-2磷酸二胺和225kg·hm-2尿素作为底肥，拔节期施150kg·hm-2尿素追肥；

其中小麦种植方法：每个系种植2行，每行播40粒；行长3m，株距7.5cm，行距25cm，正常生长及收获；单株穗数测定方法：收获后每个株系随机选择5棵，分出主茎，数出主茎单株穗数；

(v)根据SNP探针物理位置绘制分子图谱。将8个单一环境中直接调查得到的单株穗数表型值，按照IciMapping v4.1的BIP模块格式要求整理后，进行加性QTL定位。以1Mb为步进区间，进行1000次置换检验，确定LOD阈值；利用KJ-RIL遗传群体在8个环境条件下单株穗数QTL定位结果，其中IciMapping 4.1多环境下均在5D染色体区段检测到单株穗数多环境稳定表达的主效QTL—qSnpp-5D(图3)

(vi)利用5D-1498421作为与qSnpp-5D紧密连锁的分子标记，进行188个RIL家系基因型分型，分析qSnpp-5D对产量相关性状的遗传效应。利用SPSS 25.0对KJ-RIL共188个家系的穗部性状值进行差异显著性分析，利用GraphPad Prism 8对KJ-RIL群体的穗部性状值进行描述性统计。结果表明来自科农9204的等位基因相对于京411等位基因可以增加单株穗数和最大分蘖数。(图4)。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。