一种转铁蛋白的制备方法及包含转铁蛋白的组合物和应用

摘要

本发明属于生物药品应用领域，具体涉及一种转铁蛋白的制备方法及包含转铁蛋白的组合物和应用。转铁蛋白的制备原料包括人血浆CohnIV组分，转铁蛋白的制备方法，包括预处理液制备，疏水层析纯化和浓缩置换步骤。本发明的转铁蛋白可以单独使用也可与其他血浆蛋白联用，起到增强记忆力、提高认知的作用。

说明书

本申请是申请日为2019年05月23日、申请号为201910432249.2、发明名称为《转铁蛋白的应用及包含转铁蛋白的组合物》的分案申请。

技术领域

本发明属于生物药品应用领域，具体涉及一种转铁蛋白的制备方法及包含转铁蛋白的组合物和应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年性痴呆，是一种由神经元丢失导致的脑中枢神经系统退行性疾病，在老年人群中该病的发病率约为 4％-8％。1906年，德国神经病理学家阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性记忆力下降表现的51岁女性患者。1910年，以命名和分类大脑疾病著称的精神病学家Emil Kraepelin提议将此病命名为阿尔茨海默病。该病常见的临床表现为进行性记忆力和认知力减退、语言障碍、精神运动异常等，对患者的正常生活造成严重影响，同时也给家庭和社会带来沉重的负担。2010年，WHO报道全球痴呆患者为3500万，中国为540万。自2010年起，全世界痴呆总人口每20年将翻一倍。《世界阿尔茨海默病2015报告》指出，到2050年，全球AD的患病人数将增加至1.3亿。AD的发病机制复杂，涉及多种分子信号通路，目前已上市的治疗药物仅4种(多奈哌齐，加兰他敏，卡巴拉汀以及美金刚)，均以延缓AD中早期病状进展和改善早期AD临床病状为主，迄今尚无逆转或阻止病情进展的有效药物。

近年来有研究把来自于年轻小鼠的血浆重复的注射进老年小鼠，发现血浆可以通过调节参与海马认知的经典分子通路而提高记忆功能。而血浆组成极其复杂，包括蛋白质、脂类、无机盐、糖、氨基酸、代谢废物以及大量的水，迄今尚无研究确定是血浆中哪些成分具有提高记忆，改善和治疗老年痴呆的作用；且目前中国血液制品公司对单采血浆的开发和利用亟需提高。

因此，目前的科研和实践中，需要找出血浆中具有改善学习记忆能力以及治疗老年性痴呆的成分，并充分提高单采血浆的利用率，开发新的血液制品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转铁蛋白的制备方法，包括预处理液制备，疏水层析纯化和浓缩置换步骤；

所述预处理液制备包括将血浆Cohn IV组分依次经过第一次复溶处理，第一次离心处理，第一次过滤处理，调节pH处理，去除杂质蛋白处理，第二次离心处理，第二次过滤处理，得到预处理液；

所述疏水层析纯化包括将所述预处理液经过缓冲液置换处理，疏水层析处理，得到纯化转铁蛋白；所述纯化转铁蛋白的纯度为大于等于95％；

所述浓缩置换包括将所述纯化转铁蛋白进行超滤处理、置换处理，得到转铁蛋白。

优选的，所述第一次复溶处理，采用PBS缓冲液复溶，所述血浆Cohn IV 组分与所述PBS缓冲液的质量体积比为1：(2-10)；所述PBS缓冲液为： 10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0；

所述第一次离心处理，转速为4000-15000rpm，温度为0-10℃，保留上清液用于所述第一次过滤处理；

所述第一次过滤处理，采用孔径为0.1-1.0μm滤膜，过滤后取滤液用于所述调节pH处理；

所述调节pH处理，将所述滤液的pH值调节为6.5-7.5；所述调节pH的 pH调节剂为1mol/L柠檬酸钠溶液；

所述去除杂质蛋白处理，向调节pH后的滤液中加入蛋白沉淀剂去除杂质蛋白；所述蛋白沉淀剂包括PEG4000和/或乙醇溶液；所述PEG4000与调节 pH后的滤液的质量体积比为10-20％；所述乙醇溶液的体积百分浓度为 90-98％，温度为0至零下10℃；

所述第二次离心处理，转速为4000-10000rpm，温度为0-10℃，保留上清液用于第二次过滤处理；

所述第二次过滤处理，采用孔径为0.1-1.0μm滤膜，得到的滤液作为预处理液。

优选的，所述PBS缓冲液为：10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0。

优选的，所述PBS缓冲液为：20mmol/L PBS，pH7.5。

优选的，所述第一次离心处理，转速为10000rpm，温度为4℃。

优选的，所述第一次过滤处理，采用孔径为0.45μm滤膜。

优选的，所述调节pH处理，将所述滤液的pH值调节为7.0。

优选的，所述PEG4000与调节pH后的滤液的质量体积比为15％。

优选的，所述乙醇溶液的体积百分浓度为96％，温度为零下4℃。

优选的，所述第二次离心处理，转速为10000rpm，温度为4℃。

优选的，所述第二次过滤处理，采用孔径为0.45μm滤膜。

优选的，所述缓冲液置换处理，采用HiTrap Desalting脱盐柱，采用的平衡缓冲液为：10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0，其中(NH

所述疏水层析处理，先将所述平衡缓冲液平衡所述辛基疏水柱，再用所述平衡缓冲液淋洗所述辛基疏水柱，再用洗脱缓冲液洗脱；

所述疏水层析柱为辛基疏水柱，用OctylSepharose 4Fast Flow装填；

所述平衡缓冲液为：10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0，其中(NH

所述洗脱缓冲液为：10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0，其中(NH

所述超滤处理，采用1KD-10KD超滤膜；

所述置换处理，采用的置换缓冲液为：10-50mmol/L PBS，pH7.0-7.4。

优选的，所述缓冲液置换处理，采用HiTrap Desalting脱盐柱，采用的平衡缓冲液为：20mmol/L PBS，pH7.0，其中(NH

优选的，所述平衡缓冲液为：20mmol/L PBS，pH7.0，其中(NH

优选的，所述洗脱缓冲液为20mmol/L PBS，pH64.0，其中(NH

优选的，所述超滤处理，采用3KD超滤膜。

优选的，所述置换处理，采用的置换缓冲液为：20mmol/L PBS，pH7.2。

本发明提供了一种包含转铁蛋白的组合物，包括上述制备方法得到的转铁蛋白和其他组分；所述其他组分包括人血白蛋白、人免疫球蛋白和临床治疗老年性痴呆的一线药物中的一种或多种。

优选的，当所述其他组分为白蛋白和免疫球蛋白时，按质量份计，所述组合物包括转铁蛋白0.5-4份，人血白蛋白5-40份和人免疫球蛋白5-40份。

优选的，当所述其他组分为白蛋白和免疫球蛋白时，按质量份计，所述组合物包括转铁蛋白1份，人血白蛋白8.33份和人免疫球蛋白8.33份。

优选的，所述临床治疗老年性痴呆的一线药物包括多奈哌齐，加兰他敏，卡巴拉汀和美金刚中的一种或几种。

优选的，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

优选的，所述药学上可接受的载体包括抛射剂、缓冲液、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇和表面活性剂中的一种或多种。

本发明还提供了上述制备方法得到的转铁蛋白或上述组合物在制备预防或/和改善或/和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。

本发明还提供了上述制备方法得到的转铁蛋白或上述组合物在制备改善记忆力的药物中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明中，转铁蛋白可以起到增强记忆力、提高认知功能的作用。发明人发现转铁蛋白能够显著促进神经细胞的生长，并且能够显著改善痴呆动物模型的学习记忆能力。筑巢实验结果也表明本发明提取的转铁蛋白能够提高痴呆动物模型的筑巢能力，提示痴呆动物的自理能力提高。

2、在本发明中，转铁蛋白可以与其他血浆蛋白或/和临床治疗老年性痴呆一线药物联合使用，进一步提高治疗效果。

3、本发明还提供一种转铁蛋白制备方法，该法能从目前常用的 Nitschmann-Kistler或cohn 6法或cohn6+9法生产血液制品时废弃物Cohn IV 组分里提取转铁蛋白，其充分、合理地利用了有限的血浆，减少了血浆资源的浪费。

4、本发明转铁蛋白的制备方法较为简单，而且可以直接工业化放大生产，大规模地应用于制药工业。

附图说明

图1：(a)：实施例1中疏水层析UV280峰图；(b)：实施例1中SDS-PAGE 检测不同步骤得到的含有蛋白的产物的电泳图。

图2：检测例1中光镜检测不同浓度的转铁蛋白处理原代培养海马神经元的效果图，A部分为海马神经元数量柱状图，B部分为海马神经元突起长度柱状图。

图3：检测例1中MTT法检测不同浓度的转铁蛋白处理原代培养海马神经元后改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的损伤。

图4：检测例1中水迷宫行为学实验检测转铁蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白、转铁蛋白+人免疫球蛋白、人血白蛋白+人免疫球蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白处理小鼠前后筑巢行为得分。

图5：检测例1中水迷宫行为学实验检测转铁蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白、转铁蛋白+人免疫球蛋白、人血白蛋白+人免疫球蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白处理小鼠的记忆改善情况。其中，A部分为小鼠在隐藏平台训练阶段上台时间，B部分为小鼠在测试阶段在目标象限所处时间百分比。

具体实施方式

为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明，下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。第一方面，本发明提供转铁蛋白在制备预防或/和改善或/和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用；或/和转铁蛋白在制备益智类补充剂或药物方面的应用。

本发明在细胞水平验证了不同浓度转铁蛋白对原代海马神经元生长的影响，并通过MTT法检测不同浓度的转铁蛋白处理原代培养海马神经元后改善 Aβ25-35对原代培养海马神经元的损伤，试验结果表明，在0.25-2mg/mL的浓度范围内，转铁蛋白促进海马突触长度增长的作用明显，其可以显著改善Aβ 25-35对原代培养海马神经元的毒性损伤。另外，发明人从动物试验水平检测了转铁蛋白和包含转铁蛋白的组合物对5×FAD转基因(APP)小鼠的记忆力改善情况，结果表明，转铁蛋白和包含转铁蛋白的组合物可以明显改善痴呆模型小鼠的记忆力。

第二方面，本发明提供了一种包含转铁蛋白的组合物，包括：转铁蛋白和其他组分，所述其他组分包括：人血白蛋白、人免疫球蛋白和临床治疗老年性痴呆的一线药物中的一种或多种；

优选地，所述组合物包括：转铁蛋白、人血白蛋白和人免疫球蛋白；三种蛋白联合使用可以显著增加任何一种蛋白单独使用的效果。

更优选地，按质量份数，转铁蛋白0.5-4质量份(例如：可以为0.5、0.8、1、 1.2、1.5、1.8、2、2.3、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4质量份中任意值或任意二者之间的数值范围)，人血白蛋白5-40质量份(例如：可以为5、8、10、12、 15、18、20、23、25、28、30、32、35、38、40质量份中任意值或任意二者之间的数值范围)，人免疫球蛋白5-40质量份(例如：可以为5、8、10、12、15、 18、20、23、25、28、30、32、35、38、40质量份中任意值或任意二者之间的数值范围)；进一步优选地，转铁蛋白1质量份，人血白蛋白8.33质量份，人免疫球蛋白8.33质量份。

所述临床治疗老年性痴呆的一线药物包括：多奈哌齐，加兰他敏，卡巴拉汀和美金刚中的一种或几种。

本发明所述的转铁蛋白、人血白蛋白、人免疫球蛋白均为人源蛋白，以下实施例中使用的人血白蛋白、人免疫球蛋白为市售产品，人血白蛋白纯度不低于96％，人免疫球蛋白纯度不低于90％。

所述组合物还包括药学上可接受的载体。上述药学上可接受的载体包括：药学上可接受的抛射剂、缓冲液、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇和表面活性剂中的一种或多种。

所述组合物中的几种成分，可以分别单独使用，也可以混合后再共同使用。

所述转铁蛋白可以是采用目前任何方法制备的人转铁蛋白，优选是采用如下方法制备的转铁蛋白，其采用人血浆Cohn IV组分作为原料，得到的转铁蛋白的SDS-PAGE变性胶电泳图中清晰可见1条分子量约为79kD的条带，人血浆Cohn IV组分是指按Nitschmann-Kistler法，或cohn 6法，或cohn 6+9法生产人血液制品时的废弃物——Cohn IV组分。

无论是目前临床上AD的治疗还是AD新药研发中的思路都是从单一的通路或机制切入，而AD的临床病理机制除突变基因外还涉及胆碱能损伤，脂质代谢异常，氧自由基损伤，免疫炎症等。血浆中含大量白蛋白和免疫球蛋白，临床试验表明人血白蛋白可清除AD患者血浆中游离的Aβ，从而在一定程度上改善认知能力。健康人群血液中存在天然的自身抗体抗Aβ，这些抗体主要由免疫球蛋白M组成，动物实验结果表明静脉注射免疫球蛋白可提高动物的认知能力，转铁蛋白在脑内有表达，且有数据表明AD患者多个区域的皮层的白质中的转铁蛋白含量显著下降。本发明从目前已有的血液制品制备过程中废弃的Cohn IV组分里通过疏水层析方法分离并鉴定出一种血浆蛋白-转铁蛋白，并发现这一蛋白能够促进神经元细胞生长以及改善痴呆模型动物的认知能力，包括学习和记忆能力。

上述转铁蛋白的具体制备方法如下：依次包括以下步骤：预处理液制备，疏水层析纯化，浓缩置换。

步骤一、预处理液制备：本步骤的目的为复溶人血浆Cohn IV组分沉淀中的蛋白质，去除助滤剂，并去除复溶后的一些杂蛋白。

分步骤一、第一次复溶处理：将Cohn IV组分固体溶解到PBS缓冲液中，混合均匀，得到第一次复溶液。

上述人血浆Cohn IV组分与PBS缓冲液的质量体积比(w/v)为1：(2-10)，优选为1：3.5；上述PBS缓冲液为：10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0，优选为20mmol/L PBS，pH7.5。

分步骤二、第一次离心处理：将上述第一次复溶液离心，保留上清液，作为第一次上清液。

上述离心的转速为4000-15000rpm，温度为0-10℃，优选为10000rpm，4℃。

分步骤三、第一次过滤处理：将上述第一次上清液用0.1-1.0μm，优选为 0.45μm的滤膜过滤，得到滤液，作为第一次过滤液。

分步骤四、调节pH处理：在上述第一次过滤液中加入1mol/L的柠檬酸钠溶液，得到调节pH值后的过滤液，其pH值为6.5-7.5，优选为7.0。

分步骤五、去除杂质蛋白处理：搅拌上述调节pH值后的过滤液同时向其中缓慢加入蛋白沉淀剂至沉淀自动沉降变实(此处的变实指：上清和沉淀有明显的分界线，上清变得透亮，沉淀数量不再增多)，之后取上清液，作为去除杂质蛋白液，以备下一步的离心。

上述蛋白沉淀剂优选为聚乙二醇4000(PEG4000)，PEG4000与调节pH值后的过滤液的质量体积比为10-20％，优选为15％。

上述蛋白沉淀剂也可以为体积百分浓度为90-98％、优选为96％，温度为零下10℃，优选为零下4℃的乙醇溶液；由于采用乙醇溶液在沉淀过程中会产热，所以乙醇溶液要保持低温。

本分步骤可以有效去除一部分杂质蛋白，同时还可以沉淀病毒，提高产品的安全性。

分步骤六、第二次离心处理：将上述去除杂质蛋白液离心，保留上清液，作为第二次上清液。

上述离心的转速为4000-15000rpm，温度为0-10℃，优选为10000rpm，4℃。

分步骤七、第二次过滤处理：将上述第二次上清液用0.1-1.0μm，优选为 0.45μm的滤膜过滤，得到滤液，作为人血浆CohnIV组分预处理液。

步骤二、疏水层析纯化：本步骤的目的是从人血浆Cohn IV组分预处理液中去除其他蛋白杂质，分离得到纯化转铁蛋白。

分步骤一、缓冲液置换处理：

本分步骤中，选用HiTrap Desalting脱盐柱，置换上述人血浆Cohn IV组分预处理液，使其初始盐浓度和pH与平衡缓冲液(10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0， 0.5-3mol/L(NH

分步骤二、疏水层析处理：

本分步骤中，选用辛基疏水柱(Octyl Sepharose 4FastFlow装填)。

具体的操作为：(1)预先用5-10倍柱体积的平衡缓冲液(10-50mmol/L PBS，pH6.0-8.0，其中(NH

作为优选的实施方式，上述制备方法还包括：

步骤三、浓缩置换步骤：

分步骤一、浓缩处理：将上述纯化转铁蛋白采用1KD-10KD，优选为3KD 的超滤膜浓缩，得到浓缩液。上述步骤二的层析过程会稀释样品，本分步骤的目的为将样品浓缩达到可以使用的程度。

分步骤二、置换处理：采用置换缓冲液通过透析或超滤的方法，将上述浓缩液中的高浓度盐(主要是硫酸铵)置换到置换缓冲液中，取透析膜内的蛋白溶液或超滤膜上的蛋白溶液即为转铁蛋白。本分步骤的目的是将浓缩液含有的高浓度盐(主要是硫酸铵)的缓冲液置换到PBS缓冲液中。

其中采用的置换缓冲液为10-50mmol/L PBS，pH7.0-7.4，优选为20mmol/L PBS，pH7.2。

采用透析时：优选上述置换缓冲液作为透析缓冲液，透析时间为20-72h，优选为24h，透析体积比是1：(100-10000)，优选为1：500，保留透析膜内的蛋白溶液，即为转铁蛋白。

采用超滤时：优选上述置换缓冲液作为超滤缓冲液，超滤膜的规格为 1-10KD，优选为3KD，压力为0.1-0.3MPa，优选为0.1MPa，保留超滤膜上的蛋白溶液，即为转铁蛋白。

本发明中涉及的质量体积比(w/v)是指：固体的质量(g)与液体体积(mL)之间的比例，如：上述人血浆Cohn组分与PBS缓冲液的质量体积比(w/v)为1：3.5，是指人血浆Cohn IV组分量取1g时，PBS缓冲液则量取3.5mL。

下面通过实施例对本发明转铁蛋白的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，请参照 SambrookJ等主编，科学出版社，2017，分子克隆实验指南(第四版)或相应产品的说明书。以下实施例中使用的原代海马细胞是按照如下参考文献培养的：Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronalactivityalters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J CellSci 127(Pt 10):2249-2260。

实施例1

本实施例为转铁蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1：人血浆Cohn IV组分预处理液制备：

(1)第一次复溶：将按Nitschmann-Kistler法生产血液制品时的废料——人血浆Cohn IV组分固体溶解到20mmol/L PBS溶液(pH7.5)中，按照1:3.5(w/v)溶解后，用磁力搅拌器，混合均匀，得到第一次复溶液。

(2)第一次离心：将第一次复溶液于10000rpm，4℃离心，得到第一次上清液。

(3)第一次过滤：将第一次上清液用0.45μm滤膜过滤，得到第一次过滤液。

(4)调节pH：将第一次过滤液用1mol/L柠檬酸钠将pH值调到7.0。

(5)去除杂质蛋白：在第一次过滤液中加入15％(w/v)的PEG4000，需要在搅拌的同时缓慢加入，PEG4000完全溶解后待沉淀变实，取上清，作为去除杂质蛋白液。

(6)第二次离心：将去除杂质蛋白液于10000rpm，4℃离心，得到第二次上清液。

(7)第二次过滤：将第二次上清液用0.45μm滤膜过滤，获得人血浆Cohn IV 组分预处理液。

S2：人血浆Cohn IV组分预处理液疏水层析纯化：

(1)缓冲液置换处理：

a)将HiTrap Desalting脱盐柱(1×8cm)预先用5-10倍柱体积的平衡缓冲液(20mmol/L PBS，pH7.0，1.5mol/L(NH

b)将适量的上述人血浆CohnIV组分预处理液进料到HiTrap Desalting柱。

c)用平衡缓冲液(20mmol/L PBS，pH7.0，1.5mol/L(NH

(2)疏水层析处理：

a)预先用5-10倍柱体积的平衡缓冲液(20mmol/L PBS，pH7.0， 1.5mol/L((NH

b)将适量的上述置换缓冲液的Cohn IV蛋白溶液进料到辛基疏水柱。

c)用平衡缓冲液(20mmol/L PBS，pH7.0，1.5mol/L(NH

d)用洗脱缓冲液(20mmol/L PBS，pH7.0，1.2mol/L(NH

S3：浓缩置换：

(1)浓缩：利用3KD超滤膜，将纯化转铁蛋白浓缩得到浓缩液。

(2)置换：将浓缩液采用透析的方式，时间为24h，体积比为1:500，透析缓冲液为20mmol/L PBS(pH7.2)，取透析膜内蛋白溶液作为转铁蛋白。

S4：灭菌：

将上述转铁蛋白采用过滤除菌，滤膜为0.22μm低蛋白吸附的PVDF膜，压力为5bars，得到灭菌后的转铁蛋白。

实施例2

本实施例是实施例1步骤S4得到的灭菌后的转铁蛋白(TF溶液)与人血白蛋白(HSA)、人免疫球蛋白(lgG)联用。

将灭菌后的转铁蛋白与人血白蛋白、人免疫球蛋白混合，得到 TF+HSA+lgG混合液，该混合液中TF、HSA、IgG的质量比为1:8.33:8.33。

实施例3

本实施例是实施例1步骤S4得到的灭菌后的转铁蛋白(TF溶液)与人血白蛋白(HSA)联用。

将灭菌后的转铁蛋白与人血白蛋白混合，得到TF+HSA混合液，该混合液中TF、HSA的质量比为1:8.33。

实施例4

本实施例是实施例1步骤S4得到的灭菌后的转铁蛋白(TF溶液)与人免疫球蛋白(lgG)联用。

将灭菌后的转铁蛋白与人免疫球蛋白混合，得到TF+lgG混合液，该混合液中TF、IgG的质量比为1:8.33。

检测例1

检测1-1：SDS-PAGE检测转铁蛋白。

将实施例1制备的转铁蛋白进行SDS-PAGE变性胶电泳鉴定，包括以下步骤：

(1)分别从复溶Cohn IV(即实施例1中S1(1)的第一次复溶液)、Cohn IV预处理液(即实施例1中步骤S1(7)得到的人血浆Cohn IV组分预处理液)、疏水层析洗脱峰(即实施例1中步骤S2(2)得到的纯化转铁蛋白)里分别取出样品，BCA法测定总蛋白浓度。

(2)分别将上述复溶Cohn IV、Cohn IV预处理液、疏水层析洗脱峰用水稀释至1.25mg/mL，与5×蛋白上样缓冲液(购自北京索莱宝科技有限公司)混合，即为需要进行电泳的样品。

(3)将电泳样品升温至100℃，加热5分钟使蛋白质变性，然后立即将样品放到冰上，等待5分钟后开始跑SDS-PAGE变性还原胶。

该变性还原胶的配制方法如下：30(w/v)％的丙烯酰胺Acrylamide(购自 Sigma)取2.0mL、1.5M Tris-盐酸缓冲液(pH 8.8，购自Sigma)取1.3mL、10(w/v)％的SDS取0.05mL、10％(w/v)过硫酸铵(购自Sigma)取0.05mL、TEMED(购自 Sigma)取0.002mL、以及水取1.6mL，共计5mL，混合后在室温0.5-1h凝固成分离胶，利用约1mL异丙醇封胶，压平；凝固后，将异丙醇倒掉，配制浓缩胶： 30(w/v)％的丙烯酰胺Acrylamide(购自Sigma)取0.17mL、1.0M Tris-盐酸缓冲液 (pH 6.8，购自Sigma)取0.13mL、10(w/v)％的SDS取0.01mL、10％(w/v)过硫酸铵(购自Sigma)取0.01mL、TEMED(购自Sigma)取0.001mL、以及水取0.68mL，共计1mL。灌胶后插入制胶梳，在室温0.5-1h凝固成浓缩胶。

跑胶时，每个泳道的蛋白上样量为15微克，设定跑胶电压为100V，开始跑胶，跑胶时间为1小时。

(4)跑完胶后，用考马斯亮蓝染色液(该染色液的制备方法为：将2.5g考马斯亮蓝R-250溶于500mL 95％乙醇溶液，加入100mL 85％的乙酸溶液，然后，用蒸馏水补充至1000mL，此染液放4℃至少6个月保持稳定)对胶进行染色。

检测结果参见图1：(a)：疏水层析UV280峰图。(b)：泳道M：蛋白分子量标准；泳道1-3：泳道1-3的主要条带中均包括：1：复溶Cohn IV，2：CohnIV 预处理液，3：疏水层析洗脱峰。由此可见，经过疏水层析步骤，原料血浆中的其他成分基本去除完全，得到了分子量约为79KD的纯化转铁蛋白(纯度>95％)。

检测1-2：

实施例1的提取方法中，3个阶段产物的纯化简表如下：

其中，总得率的测定和计算方式为：先利用ELISA法测定了复溶Cohn IV 中目标蛋白的总含量，将该总含量作为总起始量，将该总起始量定义为100％；之后，再用ELISA法分别测定Cohn IV预处理液、疏水层析洗脱峰中目标蛋白的总含量，再用这2个产物的目标蛋白总含量除以上述复溶Cohn IV中目标蛋白的总含量，得出的百分数即为总得率。上述目标蛋白选用人血清转铁蛋白 (human serotransferrin，HTF)、含有679个氨基酸残基，分子量大小为79570Da，参见《Transferrin as a Metal Ion Mediator》(Hongzhe Sun,HongyanLi,and,and Peter J.Sadler*Chemical Reviews 1999 99(9),2817-2842DOI:10.1021/cr980430w)。

纯度的测定计算方式为：利用图像分析软件分别测量上述3个阶段产物的 SDS-PAGE凝胶电泳的结果的每个条带的灰度强度，并计算出每个产物的各个条带的灰度值(灰度强度)之和，然后将每个产物的目标条带的灰度值除以该产物的总条带的灰度值之和，得出的百分数即为纯度。

检测2：原代海马神经元培养及血浆蛋白组分处理。

(1)利用0.1％的poly-L-lysine包被48孔培养板，放入37℃培养箱中包被2小时以上。

(2)在冰的HBSS-buffer中解剖0天初生小鼠，取出海马体。用1×PBS清洗3 次。加0.25％trypsin，37℃消化15分钟。

(3)用完全DMEM终止消化，并用1mL枪轻吹吸海马细胞16-20次，没有明显组织块即可，再用40mM滤网过滤，1000rpm，离心3min。

(4)离心后弃上清，加完全DMEM重悬细胞。并将神经元种植在细胞培养板中，种植密度为3×10

(5)第二天无血清Neurobasal培养基全换液；第三天处理：将灭菌后的转铁蛋白(实施例1的步骤S4得到的)加入到不同的培养板孔内，终浓度为 0.25mg/mL(其纯度为96.5％)、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，并采用1×PBS作为对照；第五天：利用cell-IQ相差显微镜进行拍照。

检测结果参见图2：其中，A部分均为海马神经元数量柱状图，B部分为海马神经元突起长度柱状图。A部分中，PBS处理：1.00±0.07AU(arbitrary unit)， 0.25mg/mL处理：1.21±0.07AU(p<0.05vs.PBS处理)，0.5mg/mL处理： 1.33±0.09AU(p<0.01vs.PBS处理)，1mg/mL处理：1.25±0.12AU，2mg/mL处理： 1.19±0.09AU，4mg/mL处理：0.75±0.09AU(p<0.05vs.PBS处理)。B部分中，PBS 处理：1.00±0.06AU，0.25mg/mL处理(p<0.001vs.PBS处理)：1.76±0.18AU， 0.5mg/mL处理：1.74±0.09AU(p<0.001vs.PBS处理)，1mg/mL处理：1.84±0.17AU(p<0.001vs.PBS处理)，2mg/mL处理：1.72±0.10AU(p<0.001vs.PBS 处理)，4mg/mL处理：1.14±0.12AU。

以上说明在0.25-0.5mg/mL的浓度范围内，转铁蛋白对促进海马神经元生长作用明显；在0.25-2mg/mL的浓度范围内，转铁蛋白促进海马神经元突起生长作用明显。

检测3：转铁蛋白对Aβ引起的原代海马神经元损伤的保护作用，其可以显著改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的毒性损伤。淀粉样肽Aβ具有细胞毒作用，如果能拮抗Aβ神经毒，即可望达到抗AD的目的。

(1)Aβ25-35溶解于灭菌的双蒸水中，使其终浓度为1mg/mL，在37℃放置 7天进行老化，老化的Aβ25-35分装后于-20℃冻存。

(2)利用0.1％的poly-L-lysine包被96孔培养板，放入37℃培养箱中包被2小时以上。

(3)在冰的HBSS-buffer中解剖0天初生小鼠，取出海马体。用1×PBS清洗3 次。加0.25％trypsin，37℃消化15分钟。

(4)用完全DMEM终止消化，并用1mL枪轻吹吸海马细胞16-20次，没有明显组织块即可，再用40mM滤网过滤，1000rpm，离心3min。

(5)离心后弃上清，加完全DMEM重悬细胞。并将神经元种植在细胞培养板中，种植密度为2×10

(6)第二天无血清Neurobasal培养基(含10μM阿糖胞苷)全换液；第五天、第八天无血清Neurobasal培养基半换液。

(7)第八天换液后，将灭菌后的转铁蛋白(实施例1的步骤S4得到的)加入到不同的培养板孔内，终浓度为0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、 2mg/mL、4mg/mL。

图3中，最左边的Control为不加Aβ而加入1×PBS的对照(阴性对照)，左起第二个柱为加入Aβ和1×PBS的对照(模型对照)，这两个对比是检测AD细胞模型是否造模成功；左起3-8的6个柱是加入Aβ和不同浓度的转铁蛋白组，用来研究在AD细胞模型中药物的作用。

(8)37℃孵育24小时后，加入老化的Aβ25-35，终浓度为30μM。

(9)37℃孵育24小时后，加10μl 5mg/mL的MTT。

(10)37℃孵育4小时后，去除上清，加入150μl DMSO于酶联免疫测定仪上以测定波长570nm，参比波长630nm测定吸光值。

检测结果参见图3：图中从左至右，第1-8柱分别编号为Bar1-8，Bar2表明 30μM老化的Aβ25-35与原代海马神经元孵育24小时后，与Bar1相比细胞MTT 还原明显降低，细胞存活率降低到70.7±8.5％(p＝0.0088)，而Bar6-8用1mg/mL、 2mg/mL、4mg/mL的转铁蛋白预处理24小时可以明显改善Aβ25-35对细胞的毒性损伤，并且随着药物剂量的增加，这种改善作用越明显，其中4mg/mL的转铁蛋白最显著(细胞存活率分别为108.6±7.4％，p＝0.0022，134.1±15.7％，p ＝0.0009，139.2±16.8％，p＝0.0008)。

以上说明在1-4mg/mL的浓度范围内，转铁蛋白可以显著改善Aβ25-35对原代培养海马神经元的毒性损伤。

检测4：筑巢行为学实验检测：

(1)厨房纸剪成细的长条后揉皱，空笼中加入1cm左右高的木屑垫料，在垫料上均匀撒入3-4g剪碎的厨房纸，放入一只5×FAD转基因(APP)小鼠或野生型 (WT)对照小鼠。

(2)48小时后观察筑巢情况并评分。评分标准如下：

0分：小鼠没有动过筑巢材料，筑巢材料保持放入时原样。

1分：虽然筑巢材料被小鼠动过，但在笼中没有明显形成巢的位置，筑巢材料分散在笼中。

2分：有明显巢的位置，巢扁平，中间没有明显凹陷。

3分：有明显巢的位置，巢中间稍有凹陷，高度低于小鼠背部弓起后1/2。

4分：有明显巢的位置，巢中间有凹陷，高度为小鼠背部弓起后1/2。

5分：有明显巢的位置，巢中间有凹陷，高度高于小鼠背部弓起后1/2。

(3)将小鼠分为以下七组，每组8只小鼠。

第一组(WT_PBS)：野生型(WT)对照小鼠，其尾静脉均注射20mmol/L PBS(pH7.2)100μl；本组为空白对照；

第二组(TG_PBS)：5×FAD转基因(APP)小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射PBS 100μl；本组为模型对照；

第三组(TG_TF)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射灭菌后的转铁蛋白(实施例1的步骤S4得到的)100μl(含4.5mg TF)；

第四组(TG_TF+lgG)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射实施例4的灭菌后的转铁蛋白+人免疫球蛋白混合液共100μl(含 37.5mg IgG、4.5mg TF)；

第五组(TG_TF+HSA)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射实施例3的灭菌后的转铁蛋白+人血白蛋白混合液共100μl(含 37.5mg HSA、4.5mg TF)；

第六组(HSA+lgG)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射人血白蛋白+人免疫球蛋白混合液共100μl(含37.5mg HSA和37.5mg IgG)；

第七组(TG_TF+HSA+lgG)：5×FAD转基因小鼠，该组5×FAD转基因小鼠的尾静脉均注射实施例2的灭菌后的转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白混合液(实施例2的TF+HSA+lgG)共100μl(含37.5mg HSA、37.5mg IgG、4.5mg TF)；

上述7组每隔两天注射一次，共注射8次；之后再按照(1)和(2)步骤进行筑巢行为实验。

测试结果见图4。第一组(WT_PBS)得分为3.63±0.21，第二组(TG_PBS)得分为0.88±0.32，第三组(TG_TF)得分为3.25±0.16，第四组(TG_TF+lgG)得分为 3.56±0.15，第五组(TG_TF+HSA)得分为3.50±0.13，第六组(HSA+lgG)得分为 3.06±0.15，第七组(TG_TF+HSA+lgG)得分为3.81±0.19。可见对于阿尔茨海默症模型小鼠来说，注射转铁蛋白、转铁蛋白+人免疫球蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白、人血白蛋白+人免疫球蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白均能够明显提高筑巢行为；单独注射转铁蛋白比注射人血白蛋白+免疫球蛋白能够提高筑巢能力，联合注射转铁蛋白+人血白蛋白或转铁蛋白+人免疫球蛋白比单独注射转铁蛋白能够提高筑巢能力，而且，注射转铁蛋白+人血白蛋白+ 免疫球蛋白能够进一步提高筑巢能力。

小鼠的筑巢能力转化到人类指人类对日常生活的综合管理能力，由此可见，注射转铁蛋白可以明显改善阿尔茨海默症模型小鼠日常生活的综合管理能力。

检测5：Morris水迷宫测试(水迷宫行为学实验检测)。

(1)将小鼠分为以下七组，每组10只小鼠。

第一组(WT_PBS)：野生型(WT)小鼠，作为对照，小鼠尾静脉注射PBS 100μl；本组为空白对照；

第二组(TG_PBS)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射PBS 100μl；本组为模型对照；

第三组(TG_TF)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射灭菌后的转铁蛋白(实施例1的步骤S4得到的)100μl(含4.5mg TF)；

第四组(TG_TF+HSA)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射实施例3 的灭菌后的转铁蛋白+人血白蛋白混合液共100μl(含37.5mg HSA、4.5mg TF)；

第五组(TG_TF+IgG)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射实施例4的灭菌后的转铁蛋白+人免疫球蛋白混合液共100μl(含37.5mg IgG、4.5mg TF)；

第六组(TG_HSA+IgG)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射人血白蛋白+人免疫球蛋白的混合液(HSA+lgG)共100μl(含37.5mg HSA和37.5mg IgG)；

第七组(TG_TF+HSA+IgG)：5×FAD转基因小鼠，各小鼠尾静脉注射实施例2的灭菌后的转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白混合液(实施例2的 TF+HSA+lgG)共100μl(含37.5mg HSA、37.5mg IgG、4.5mg TF)；

上述7组每隔两天注射一次，共注射8次；之后进行Morris水迷宫训练。

(2)水迷宫实验记录潜伏期的长短测定小鼠的空间辨别能力。水迷宫装置由直径120cm、高50cm的圆形水池和可移动的直径10cm的平台组成，水池的上方装有摄像头并与电脑自动记录仪连接，水温保持(22±3)℃。

(3)第1-5天训练为隐藏平台训练，平台放置于固定位置并低于水面1cm，加入钛白粉使平台不可见，将小鼠头朝池壁轻轻随机放入水池中4个象限之一，每次试验每只小鼠游泳60s，让其找到水中平台，让其停留5s；若小鼠入水后未能找到平台，则将时间记录为60s，并且将其人为放置在平台上20s，每只小鼠每天重复4次试验。

(4)最后一次定位航行实验结束后24h，撤出平台，将小鼠放入水中追踪器运动轨迹60s，测试小鼠60s内的运动轨迹、潜伏期及穿过原先放置平台位置象限次数及时间作为空间记忆形成指标，并进行组间对比。

注意：整个测试过程中保持实验室内灯光、物品摆放等室内环境一致，以排除环境的干扰。

测试结果见图5。其中，A部分为小鼠在隐藏平台训练阶段上台时间，B 部分为小鼠在测试阶段在目标象限所处时间百分比。

A部分中，在隐藏平台训练阶段，WT_PBS组和TG_PBS组学习曲线(逃离潜伏期)前3天差异显著，后面趋于一致，WT_PBS组、TG_TF组、TG_TF+HSA 组、TG_TF+IgG组、TG_HSA+IgG组、TG_TF+HSA+IgG组学习曲线(逃离潜伏期)相近。所有小鼠在测试之前都学会记住隐藏平台的位置。

B部分中，各组在目标象限所处时间百分比依次为：第一组 (WT_PBS:)28.62±2.52，第二组(TG_PBS):19.27±2.37(p<0.05vs.WT_PBS)，第三组(TG_TF):26.76±2.85，第四组(TG_TF+HSA):28.23±2.33，第五组 (TG_TF+IgG):28.69±2.61，第六组(TG_HSA+IgG):25.18±2.01，第七组 (TG_TF+HSA+IgG):32.00±2.06，可见对于阿尔茨海默症模型小鼠来说，注射转铁蛋白、人血白蛋白+人免疫球蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白都能够提高5×FAD转基因(APP)小鼠在目标象限所处时间。

由此可见，注射转铁蛋白、转铁蛋白+人免疫球蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白、人血白蛋白+人免疫球蛋白、转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白均可以明显改善阿尔茨海默症模型小鼠的认知水平；单独注射转铁蛋白比注射人血白蛋白+人免疫球蛋白的效果有提高，联合注射转铁蛋白+人血白蛋白或转铁蛋白+人免疫球蛋白比单独注射转铁蛋白对阿尔兹海默症模型小鼠认知水平略有提高，而且，注射转铁蛋白+人血白蛋白+人免疫球蛋白的效果进一步提高。