用于检测引起李细菌性穿孔病的成团泛菌的引物组及应用

摘要

本发明涉及微生物检测技术领域，公开了用于检测引起李细菌性穿孔病的成团泛菌的引物组及应用，包括内引物、环引物和外引物，所述外引物包括外引物F3和外引物B3，所述内引物包括内引物FIP和内引物BIP，所述环引物包括环引物LF和环引物LB；还公开了应用。本发明可应用于LAMP可视化快速检测，特异性强，灵敏度高，灵敏度验证LAMP体系最低检测限成团泛菌DNA浓度为5fg/μL，比常规PCR高1000倍，同时可于发病早期检测出成团泛菌，未来可在生产上为成团泛菌早期快速诊断提供技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于检测引起李细菌性穿孔病的成团泛菌的引物组及应用。

背景技术

李细菌性穿孔病是威胁李树生产的主要病害，可以危害叶片、果实和枝干，造成李树叶片穿孔并早期脱落，果实表面生黑紫色龟裂斑，枝干生近梭形溃疡斑，在流行年份感病品种叶片和果实发病率可达90％以上。成团泛菌是李细菌性穿孔病的病原之一，除能致李树病害之外，它还能引起许多植物病害，包括白菜细菌性软腐病、甜瓜枯萎病和枣树坏死病等。

环介导等温扩增(LAMP)是近年来发展起来的分子生物学技术，应用于微生物的快速检测。技术原理是针对靶序列的6个区域设计一套4个特异性引物，利用高活性的BstDNA聚合酶在恒温(60℃～65℃)下特异性扩增靶DNA片段，快速、简便、高效、灵敏、经济，已广泛应用于病原微生物的检测。LAMP反应产物经SYBR GreenI、羟基萘酚蓝染色后，不仅可以通过凝胶电泳检测，还可以肉眼鉴别。而目前还没有关于成团泛菌快速检测技术的报道，因此，发明人设计了针对李细菌性穿孔病的成团泛菌特异性LAMP扩增引物，并研究了相应的LAMP反应体系和反应条件，建立了以SYBRGreenI为指示剂的LAMP可视化检测方法。

发明内容

基于以上问题，本发明提供用于检测引起李细菌性穿孔病的成团泛菌的引物组及应用，本发明可应用于LAMP可视化快速检测，特异性强，灵敏度高，可在生产上为成团泛菌早期快速诊断提供技术支撑。

为解决以上技术问题，本发明提供了用于检测引起李细菌性穿孔病的成团泛菌的引物组，包括内引物、环引物和外引物，所述外引物包括外引物F3和外引物B3，所述内引物包括内引物FIP和内引物BIP，所述环引物包括环引物LF和环引物LB，所述外引物F3、外引物B3、内引物 FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB的核苷酸序列分别见SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。

为解决以上技术问题，本发明还提供了引物组在制备检测引起李细菌性穿孔病的成团泛菌的试剂盒中的应用。

进一步的，所述试剂盒中含有外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，所述试剂盒可用于LAMP检测， LAMP检测的反应体系为如下25μL体系：1.6μM内引物，0.4μM环引物，0.2μM外引物，1.4mM dNTP Mix，6mM MgSO

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可应用于LAMP可视化快速检测，特异性强，灵敏度高，灵敏度验证LAMP体系最低检测限成团泛菌DNA浓度为5fg/μL，比常规PCR高1000倍，同时可于发病早期检测出成团泛菌，未来可在生产上为成团泛菌早期快速诊断提供技术支撑。

附图说明

图1为本发明的实施例的成团泛菌LAMP体系优化结果图；

图2为本发明的实施例的特异性试验验证结果图；

图3为本发明的实施例的LAMP灵敏度试验结果图；

图4为本发明的实施例的PCR灵敏度试验结果图；

图5为本发明的实施例接种成团泛菌的李叶片组织检测图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

本实施例所使用的主要试剂如下：SYBR GreenⅠ核酸染料购自美国 Solarbio公司；琼脂糖(Agarose)购自西班牙Biowest公司；细菌基因组 DNA提取试剂盒(离心柱型)、DL1500 DNA marker、2×Taq PCR Master Mix和10mM dNTP Mix购自生物工程(上海)股份有限公司，10X Isothermal Amplification Buffer、100mM MgSO

发明人将gyrB(登录号：MZ713250)基因序列保存为TXT文本格式，通过LAMP引物在线设计网站Primer Explorer V5 (http://primerexplorer.jp/e/)设计引物。具体见表1，包括外引物F3和 B3、内引物FIP和BIP及环引物LF和LB。

表1.引物序列

将上述六条引物用于LAMP反应，首先需要提取DNA，将纯化后的细菌菌株接种至NB培养液中，28℃、120rpm摇床内振荡培养至菌液浑浊，参照细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)的说明书提取菌株的基因组DNA。

利用提取的DNA进行LAMP反应，LAMP反应采用如下25μL体系：1.6μM的内引物(FIP和BIP)，0.4μM的环引物(LF和LB)，0.2 μM的外引物(F3和B3)，1.4mM dNTP Mix，6mM MgSO

发明人为获得上述优化的LAMP反应体系和反应条件，前期对 LAMP反应体系和反应条件进行了优化实验。发明人分别对LAMP的反应体系(FIP/BIP和F3/B3终浓度)和反应条件(反应温度和反应时间) 进行优化，每个处理进行三次重复。FIP/BIP终浓度的优化：LAMP反应采用25μL体系，FIP/BIP终浓度分别设置为0.8μM、1.2μM、1.6μM、 2.0μM、2.4μM，其它成分的浓度和反应条件按照上述LAMP反应体系进行。F3/B3终浓度的优化：LAMP反应采用25μL体系，F3/B3终浓度分别设置为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM，其它成分的浓度和反应条件按照上述LAMP反应体系进行。反应温度的优化：LAMP反应采用25μL体系，按照上述LAMP反应体系进行，反应温度分别设置为 59℃、61℃、63℃、65℃、67℃和69℃。反应时间的优化：体系同上，反应时间分别设为20min、30min、40min、50min、60min、70min 和80min，反应完成后，产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确定最佳的反应体系。

结果见附图1，其中：A图中的数字代表如下时间：1：20min；2： 30min；3：40min；4：50min；5：60min；6：70min；7：80min；8：阴性对照(ddH

为了评价上述引物的特异性，本实施例选用P.agglomerans、E. carotovora、R.solanacearum、P.viridiflava、Pseudomonas syringae pv. Actinidiae(Psa)、P.ananatis

表2.供试菌株及来源

结果见附图2，其中A图为基于SYBR Green I可视化的检测结果图，B图为LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳分析图；M：DL1500 DNA marker；1-7：分别为P.agglomerans、E.carotovora、R.solanacearum、P. viridiflava、Pseudomonas syringae pv.Actinidiae(Psa)、P.ananatis

发明人随后进行了上述引物组的灵敏度检测实验，对P.agglomerans 菌株HXFJ-1的基因组DNA用ddH

结果见附图3，其中A图为基于SYBR Green I可视化的检测结果图，B图为LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果图；M：DL1500 DNA marker；1-9：DNA浓度分别为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、50 pg/μL、5pg/μL、0.5pg/μL、50pg/μL、5fg/μL和0.5fg/μL；10：阴性对照(ddH

为了测试LAMP检测发病组织的效果，发明人将过夜培养的成团泛菌菌悬液接种至李叶片(刚采回)上，保湿3、6、9、12和24h后，叶片用灭菌超纯水冲洗干净，截取接种部位组织，使用植物组织提取试剂盒提取李组织DNA，将其作为DNA模板用于LAMP检测，以成团泛菌DNA作为阳性对照，ddH

综上所述，本实施例研发的六条引物仅对成团泛菌呈现阳性反应，且特异性强，灵敏度高，可于发病早期检测出成团泛菌，未来可在生产上为成团泛菌早期快速诊断提供技术支撑。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。