二色补血草提取物制备免疫低下疾病治疗药物的应用

摘要

本发明属于植物提取物领域，涉及二色补血草多糖提取物用于制备免疫增强药物中的应用。其中二色补血草多糖采用热水辅助超声提取。二色补血草多糖也可进行进一步的蛋白沉淀和脱色处理，以纯化去杂。在体外小鼠免疫细胞增殖实验中，二色补血草多糖对正常RAW264.7细胞增殖具有促进作用；在体内免疫抑制模型中，二色补血草多糖对免疫抑制小鼠胸腺、脾脏指数及血清免疫球蛋白水平具有一定的升高作用。基于免疫功能降低与疾病的关系，本发明的二色补血草多糖提取物可用于提高机体免疫功能，辅助治疗反复感染性疾病、免疫缺陷疾病及药物引起的免疫功能抑制等。

说明书

技术领域

本发明属于植物提取物领域，具体涉及二色补血草提取物制备免疫低下疾病治疗药物的应用。

背景技术

二色补血草是白花丹科（即蓝雪科）植物，拉丁植物名：Limonium bicolor（Bunge） Kuntze [Statice bicolor Bunge]。化学成分研究表明，二色补血草中含有黄酮、多糖、挥发油等物质。根据《全国中草药汇编》记载，二色补血草具有活血、止血、温中健脾、滋补强壮功效，用于月经不调、功能性子宫出血、痔疮出血、胃溃疡、脾虚浮肿的治疗。目前临床用于止血等，效果较好。

随着现代分析化学和实验药理学的发展，近20年来，各省对二色补血草的不同提取物以及活性相继开展研究。其中已发现二色补血草黄酮的雌激素样作用、二色补血草醇提取物的血管收缩作用、二色补血草水提取液的子宫收缩作用、二色补血草多糖的抗癌作用等等以及二色补血草水、醇提取物的保肝作用等。除上述作用外，二色补血草还具有抗菌消炎作用，已用于肾炎等的治疗。部分研究人员推测，该作用与二色补血草中的槲皮素、木犀草素等黄酮类物质有关。但截至目前，关于二色补血草的研究仍不够深入，二色补血草黄酮、多糖、挥发油药理活性的针对性研究不足。

多糖是天然药物中常见的一大类化学物质，如黄芪多糖、绿舒筋多糖、香菇多糖等等。天然植物中的多糖具有复杂的结构单元、连接方式，构象、分子量大小也千差万别。这导致不同的天然多糖活性也存在很大的差别。目前缺乏关于多糖活性的详细构效关系研究。天然植物中的多糖大多数为β-D多糖，其中(1,3)-β-D多糖等β-D多糖已显示出良好的免疫增强作用。而天然植物中的α-D多糖较少，相关的研究也较少。

二色补血草多糖是一种新型线性(1,4)(1,6)-α-D多糖，关于二色补血草多糖的研究目前除自由基清除和肿瘤抑制作用外，尚未见其他研究报道。虽然二色补血草有滋补强壮功效，目前也没有关于其相应活性物质的研究。

发明内容

通过对二色补血草多糖提取物的活性研究，本发明的目的是提供一种具有免疫增强功能的提取物，进而提供了二色补血草多糖提取物在制备免疫功能低下相关疾病中的应用。其中所述免疫功能低下相关疾病，也称为免疫低下疾病，是指伴随免疫功能低下状态，需要给予免疫增强剂或给予免疫增强剂更有利缓解的疾病，包括免疫缺陷性疾病、反复性或难治性感染性疾病（例如反复呼吸道感染、反复尿路感染）、甲状腺功能亢进等。这类疾病也有针对性的药物治疗，但由于机体免疫功能低下，导致反复发作、治疗用药周期较长。临床上需要联合免疫增强药物进行治疗。另外，免疫功能低下相关疾病也包括因使用糖皮质激素、环磷酰胺等免疫抑制剂引起的免疫功能低下。更准确的说，本发明的目的是提供二色补血草多糖提取物在制备纠正免疫功能低下药物中的应用。

植物多糖的提取通常采用热水提取，关于二色补血草多糖的提取及纯化方法此前已有报道。本发明中的二色补血草多糖采用超声辅助热水提取。但需要明确，二色补血草多糖提取物无论是否经过脱蛋白处理，或多或少仍含有蛋白杂质，但含量较低。

一般而言，二色补血草多糖可采用如下的超声辅助热水提取法提取：

脱脂：如前所述，将干燥的二色补血草全草粉碎至一定的粒度或长度范围，有利于物质的溶出，由于二色补血草为草本植物，粉碎至1～5cm即可，也可更细，如可过4目筛。 随后加入80%～95%的乙醇加热回流进行脱脂处理。乙醇加入的料液比为1：（6～10），回流温度为70℃～90℃。可进行多次脱脂处理如每次1～2h，反复脱脂2～4次。脱脂也可采用超声法脱脂，超声频率20 kHz～40kHz、超声功率300W～500 W，超声提取温度50℃～90℃。

超声辅助热水提取：脱脂后的固形物挥干乙醇后进行水提取，料液比为1:（50～80），提取温度为50℃～80℃，提取时间为10～90分钟，提取前应向混合液中加入，氢氧化钠调pH为7.0。其中超声的关键参数为：超声频率20 kHz～40kHz、超声功率300W～500W。抽滤获得超声辅助热水提取的水提取液。

多糖分离：超声辅助热水提取的水提取液首先进行浓缩处理，浓缩使其质量降低为药材质量即粉碎产物质量的1～1.5倍，然后加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到80%～90%，过夜使沉淀。抽滤取得沉淀部分，该固形物依次用无水乙醇、乙醚洗涤2～4次，然后干燥至恒重，所得产物即为二色补血草多糖粗提物。

脱蛋白/脱色：将二色补血草多糖粗提物加蒸馏水溶解后，Sevage法、三氯乙酸法或酶法

脱蛋白，降低二色补血草多糖粗提物中蛋白含量。离心除去沉淀的蛋白，上清液加入活性炭脱色，离心取脱色产物的上清液。

二次多糖分离：脱色产物的上清液加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到80%～90%，过

夜使沉淀，抽滤取得沉淀部分，该固形物依次用无水乙醇、乙醚洗涤2～4次，然后干燥至恒重，所得产物即为二色补血草多糖的纯化提取物。

前述的乙醇浓度为体积分数，即体积比。

经过体外巨噬细胞 RAW264.7增殖研究发现，二色补血草多糖提取物对正常巨噬细胞 RAW264.7增殖具备促进作用；通过体内免疫抑制模型的考察发现，二色补血草多糖提取物可提高免疫抑制模型的器官指数及免疫球蛋白含量，有利于对免疫功能低下相关疾病的治疗。多糖是二色补血草滋补强壮功效的成分之一。

附图说明

图1为二色补血草多糖提取物对小鼠巨噬细胞 RAW264.7细胞活力的影响。与正常组相比:*代表p<0.05, **代表p<0.01。

图2为二色补血草多糖提取物对免疫抑制小数脏器指数的影响。与模型组相比:**代表p<0.01。

具体实施方式

以下是本发明的部分实施例。在无额外说明时，以下所称二色补血草全草是指二色补血草的根、茎叶。所称二色补血草即白花丹科（即蓝雪科）植物，拉丁植物名：Limoniumbicolor （Bunge）Kuntze [Statice bicolor Bunge]。

实施例1 二色补血草多糖纯化提取物的制备

脱脂：将干燥的二色补血草全草粉碎过4目筛，收集粉碎产物，按料液比为1:8的比例加入浓度为90%（V/V）的乙醇，80℃回流提取，每次2h，连续提取2次。挥干脱脂用乙醇。

超声辅助热水提取：取挥干脱脂用乙醇后的粉碎产物，按料液比1:60加水，氢氧化钠调pH为7.0，70℃、40kHz、300W条件下提取45分钟，过滤取水溶液部分。

多糖分离：超声辅助热水提取的水溶液进行浓缩，使其质量降低为药材质量即粉碎产物质量的1倍，然后加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到80%（V/V），过夜沉淀。沉淀液抽滤取得沉淀部分，依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，然后干燥至恒重，得二色补血草多糖粗提物。

脱蛋白/脱色：将二色补血草多糖粗提物加蒸馏水溶解后，反复加入Sevage试剂（正丁

醇/三氯甲烷体积比为1/4,）进行沉淀，至无沉淀，抽滤取上清液加入活性炭脱色。离心取脱色产物的上清液。

二次多糖分离：脱色产物的上清液加入无水乙醇，使溶液中乙醇浓度达到80%（V/V），

过夜沉淀。沉淀液抽滤取沉淀部分，依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，然后干燥至恒重，得二色补血草多糖纯化提取物。

实施例2 二色补血草多糖纯化提取物的制备

脱脂：将干燥的二色补血草全草粉碎过6目筛，收集粉碎产物，按料液比为1:6的比例加入浓度为95%（V/V）的乙醇，75℃回流提取，每次2h，连续提取2次。挥干脱脂用乙醇。

超声辅助热水提取：取挥干脱脂用乙醇后的粉碎产物，按料液比1:50加水，氢氧化钠调pH为7.0，50℃、40kHz、300W条件下提取1小时，过滤取水溶液部分。

多糖分离：超声辅助热水提取的水溶液进行浓缩，使其质量降低为药材质量即粉碎产物质量的1.2倍，然后加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到90%（V/V），过夜沉淀。沉淀液抽滤取得沉淀部分，依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，然后干燥至恒重，得二色补血草多糖粗提物。

脱蛋白/脱色：将二色补血草多糖粗提物加蒸馏水溶解后，反复加入Sevage试剂（正丁

醇/三氯甲烷体积比为1/4,）进行沉淀，至无沉淀，抽滤去上清液加入活性炭脱色。离心取脱色产物的上清液。

二次多糖分离：离心取脱色产物的上清液加入无水乙醇，使溶液中乙醇浓度达到90%（V/V），过夜沉淀。沉淀液抽滤取沉淀部分，依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，然后干燥至恒重，得二色补血草多糖纯化提取物。

实施例3 二色补血草多糖纯化提取物的制备

脱脂：将干燥的二色补血草全草粉碎过6目筛，收集粉碎产物，按料液比为1:10的比例加入浓度为80%（V/V）的乙醇，70℃回流提取，每次2h，连续提取2次。挥干脱脂用乙醇。

超声辅助热水提取：取挥干脱脂用乙醇后的粉碎产物，按料液比1:70加水，氢氧化钠调pH为7.0，80℃、20kHz、500W条件下提取1小时，过滤取水溶液部分。

多糖分离：超声辅助热水提取的水溶液进行浓缩，使其质量降低为药材质量即粉碎产物质量的1.5倍，然后加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到90%（V/V），过夜沉淀。沉淀液抽滤取得沉淀部分，依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，然后干燥至恒重，得二色补血草多糖粗提物。

脱蛋白/脱色：将二色补血草多糖粗提物加蒸馏水溶解后，反复加入Sevage试剂（正丁

醇/三氯甲烷体积比为1/4,）进行沉淀，至无沉淀，抽滤去上清液加入活性炭脱色。离心取脱色产物的上清液。

二次多糖分离：离心取脱色产物的上清液加入无水乙醇，使溶液中乙醇浓度达到90%（V/V），过夜沉淀。沉淀液抽滤取沉淀部分，依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，然后干燥至恒重，得二色补血草多糖纯化提取物。

实施例4 二色补血草多糖纯化提取物对小鼠巨噬细胞增殖的影响

1.1细胞培养

小鼠巨噬细胞 RAW264.7 采用DMEM培养基（加葡萄糖4500 g/L、丙酮酸钠110 mg/L、青链霉素1%、胎牛血清10%）37℃下5% CO

1.2小鼠巨噬细胞增殖考察

吸出96孔板的培养基，分别向细胞中加入DMEM 培养基（正常组）、不同浓度的实施例1制备的二色补血草多糖纯化提取物（实验组：2、4、8、16、32μg/ml，培养基稀释）及1μg/mlLPS（阳性组，培养基稀释），各组终体积均为100μL，每组设3个复孔。另取培养基作为阴性组。37℃ 5%CO

1.3 二色补血草多糖纯化提取物对小鼠巨噬细胞增殖的影响

各组RAW264.7细胞活力结果见图1。二色补血草多糖4、8μg/ml可显著提高RAW264.7细胞活力，促进RAW264.7细胞增殖。超过32μg/ml后对RAW264.7细胞活力存在抑制作用。

实施例5 二色补血草多糖对反复呼吸道感染（免疫抑制）小鼠免疫功能的影响

2.1 动物

ICR小鼠，雌雄各半，16～20g。

2.2方法

2.2.1 实验分组与给药 小鼠随机分为正常组、模型组、二色补血草多糖低中高剂量组及阳性对照组，每组10只。正常组腹腔注射生理盐水0.04ml/只，连续注射12天。其余5组腹腔注射氢化可的松0.04ml/只，连续注射12天建立免疫抑制模型。造模结束次日起，正常组及模型组大鼠灌胃生理盐水0.4ml/只/d；二色补血草多糖低中高剂量组分别灌胃二色补血草多糖生理盐水溶液15、75、150mg/kg/d（按二色补血草临床用量及多糖收率换算）；阳性对照组灌胃匹莫多德120 mg/kg/d，灌胃体积均为0.4ml/只，连续给药28d。

2.2.2 胸腺、脾指数及血清指标考察 给药结束后小鼠称重，摘眼球取血，血样离心取血清，ELISA法测定血清IgG、IgM含量。解剖取小鼠胸腺和脾脏，称重，计算脏器指数：脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)。

2.3 结果

各组小鼠脏器指数如附图2所示，模型组胸腺指数和脾指数显著低于正常组（p<0.01）。二色补血草多糖75 mg/kg、150mg/kg组胸腺和脾指数显著高于模型组（p<0.01），与匹莫多德组差异不显著。二色补血草多糖150mg/kg组胸腺和脾指数与正常组无显著差异。各组小鼠血清IgG、IgM水平见表1。

表1 二色补血草多糖对免疫抑制小鼠血清IgG、IgM的影响

注：**代表与模型组比较p<0.01。

各组小鼠血清IgG、IgM水平如表1所示。与正常组比较，模型组IgG、IgM水平显著降低（p<0.01）。二色补血草多糖15、75、150mg/kg剂量组及匹莫多德IgG水平显著高于模型组（p<0.01），与正常组相比无显著差异（p>0.05）。二色补血草多糖75、150mg/kg剂量组及匹莫多德IgM水平显著高于模型组（p<0.01），与正常组相比无显著差异（p>0.05）。