一种获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法及其应用

摘要

本发明公开一种获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法及其应用，属于兽用生物制品技术领域。本发明提供的方法包括选取经塞内卡病毒原始毒感染后的发病猪的临床症状表现最严重的发病组织，并对发病组织进行抗原分离，经细胞培养和连续多次克隆纯化获得高毒力的塞内卡病毒疫苗种毒。本发明方法能够有效获得高滴度且免疫原性强的塞内卡病毒疫苗种毒，可用于生产免疫效果特别理想的塞内卡病毒疫苗。

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法及其应用，尤其是在塞内卡病毒疫苗制备中的应用。

背景技术

塞内卡病毒(Seneca virus A，SVA)，属小RNA毒科塞内卡病毒属，该病毒感染猪后可使感染猪出现水泡性病变或死亡，成为养猪业重点关注的病毒。

目前对该病毒引起的疾病的防治主要以疫苗预防为主，在疫苗的研发过程中疫苗种毒的选择是最为重要的环节，高毒力(表现为高滴度和对本动物猪具有高致病性(即高免疫原性))的种毒直接决定疫苗的免疫效果。然而目前用于塞内卡病毒疫苗制备的塞内卡病毒疫苗种毒常常表现出滴度不高(通常在10

现有技术中虽然已经公开了可以在病毒的敏感细胞中通过连续培养传代的方式逐渐提高病毒的滴度，进而获得高滴度的塞内卡病毒疫苗种毒，例如专利文献CN110551694A(以下称文献2)将SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886在其敏感细胞PK-15上连续传代12代次，可以使该病毒株的滴度由最初的10

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法，其包括以下步骤：

S1：选取经塞内卡病毒原始毒感染后的发病猪的临床症状表现最严重的发病组织，经处理后接种PK-15细胞，培养传代至能够使PK-15细胞产生明显且典型的细胞病变(优选培养传代至首次能够使PK-15细胞产生明显且典型的细胞病变)，收获病毒液；

S2：取步骤S1收获的病毒液进行连续N代次病毒克隆纯化，获得N个种毒，其中N≥1；

S3：对步骤S2每次克隆纯化后获得的种毒的滴度进行检测，以获得高滴度塞内卡病毒种毒，所述高滴度塞内卡病毒种毒满足：种毒的滴度≥10

S4：检测步骤S3获得的高滴度塞内卡病毒种毒对健康猪的致病能力，直至获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒；

所述高毒力塞内卡病毒疫苗种毒满足：种毒的滴度≥10

上述方法中，所述高毒力塞内卡病毒疫苗种毒还满足以下条件的一个或多个：种毒的滴度≥10

上述方法中，步骤S1中所述临床症状包括以下中的一种或多种：蹄掌部、蹄冠部边缘或蹄附趾部出现水疱、破溃或结痂；和吻突部出现水疱、破溃或结痂；和/或所述发病组织包括以下中的一种或多种：蹄掌部、蹄冠部边缘或蹄附趾部出现的水疱、破溃或结痂；和吻突部出现的水疱、破溃或结痂。

上述方法中，步骤S1中所述塞内卡病毒原始毒为SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886的F7代毒株。

上述方法中，若步骤S3中没有获得高滴度塞内卡病毒种毒，则使用克隆纯化后获得的N个种毒中任一个种毒(优选N个种毒中的滴度最高、且克隆纯化代次最低的种毒)替代步骤S1中的塞内卡病毒原始毒，重复步骤S1至S3，直至获得高滴度的塞内卡病毒种毒；和/或若步骤S4中没有获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒，则使用克隆纯化后获得的N个种毒中任一个种毒(优选N个种毒中的滴度最高、且克隆纯化代次最低的种毒)替代步骤S1中的塞内卡病毒原始毒，重复步骤S1至S4，直至获得高毒力的塞内卡病毒疫苗种毒。

上述方法中，所述明显且典型的细胞病变是指细胞病变程度在70％以上，病变早期可见典型的细胞变大、变圆现象，折光性增强，然后局部细胞开始融合；晚期细胞开始表现为大面积融合呈网状，最后融合细胞坏死、脱落。

上述方法中，步骤S1中在收获病毒液后还包括使该病毒液在PK-15细胞上继续连续传代2代次以上，并使所述PK-15细胞产生稳定的明显且典型的细胞病变。

上述方法中，步骤S1中还包括对所述发病组织，和对收获的病毒液或该病毒液在PK-15细胞上继续连续传代获得的病毒液进行PCR鉴定的步骤；任选地，所述PCR鉴定中使用的PCR引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

上述方法中，步骤S1中所述处理为将发病猪的发病组织用1000～2000IU/ml的青链霉素冲洗后剪碎、研磨，加入含青霉素、硫酸链霉素各100～200IU/ml的PBS，浸泡过夜；将浸泡液吸出，离心取上清液，并经滤膜(孔径为0.22μm)过滤除菌。

上述方法中，步骤S1中所述培养传代的具体操作为：发病猪的发病组织经处理后，按细胞培养基体积比5％～10％的量接种于长满单层的PK-15细胞上，于20～25℃吸附1～2小时，置于37℃的CO

上述方法中，步骤S2中所述病毒克隆纯化为采用蚀斑克隆法；

任选地，所述病毒克隆纯化的具体操作为：取收获的病毒液作10倍系列稀释，将系列稀释病毒液分别接种于长满单层PK-15细胞的多孔板中，每个稀释度设置复孔，同时设立空白对照；置于37℃、5％二氧化碳培养箱中吸附1小时，吸附期间每隔15分钟震荡摇匀一次；吸附后，取出多孔板，弃去吸附液，每孔加入琼脂营养液，置于4～8℃冰箱中(或在常温下)静置5～10分钟使其凝固，取出倒置放入36～37℃、含5％的二氧化碳培养箱中培养48～72小时；待多孔板出斑后，选择大小适中的独立斑点，用病毒维持液反复吹吸后，接种于长满单层的PK-15细胞中，置于37℃、5％二氧化碳温箱吸附1小时后，补加病毒维持液，置37℃、5％二氧化碳温箱培养，每日观察病变情况，当细胞病变达70％～90％时收获病毒液，冻融3次，获得克隆纯化一代次后的病毒液，记为P1；将病毒液P1继续按照上述操作继续克隆纯化，共计克隆纯化N代次，且N≥1。

本发明另一方面提供一种高毒力塞内卡病毒疫苗种毒，其由上述的方法获得，其中所述高毒力塞内卡病毒疫苗种毒满足：种毒的滴度≥10

优选地，所述高毒力塞内卡病毒疫苗种毒还满足以下条件的一个或多个：种毒的滴度≥10

上述的高毒力塞内卡病毒疫苗种毒在制备塞内卡病毒疫苗中的应用也属于本发明的内容。

基于以上技术方案提供的获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法通过选取经塞内卡病毒原始毒感染后的发病猪的临床症状表现最严重的发病组织(该发病组织可以是经塞内卡病毒原始毒对健康易感的本动物猪进行攻毒后使攻毒猪产生典型的临床症状，且临床症状表现最严重的发病组织(该发病组织可以是从发病猪的最严重发病部位坏死脱落的结痂，或者实验室保存的从发病猪的最严重发病部位获取的蹄皮、水疱皮或结痂样本)。由于塞内卡病毒原始毒对本动物猪进行攻毒后，该病毒可以在猪体内进行多轮次繁殖，进而可以提高该病毒的毒力，并且在临床症状表现最严重的发病组织中存在的塞内卡病毒的毒力更强)，并经培养传代和连续多次克隆纯化，可以获得高毒力的塞内卡病毒疫苗种毒，具体为获得高滴度且对本动物猪的致病能力强的塞内卡病毒疫苗种毒。实施例结果表明，当使用SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886的F7代毒株(病毒滴度为10

因此，本发明提供的方法能够有效获得高毒力(高滴度和免疫原性强)的塞内卡病毒疫苗种毒，可用于生产免疫效果特别理想的塞内卡病毒疫苗产品。

附图说明

图1为正常细胞和接毒后细胞的生长状态电镜照片；

图2为病毒液的PCR鉴定凝胶电泳胶图。

具体实施方式

针对现有技术中在制备塞内卡病毒疫苗中由于使用的种毒常表现滴度不高，免疫原性较弱，进而导致制备的疫苗免疫效力不能达到特别理想状态的缺陷，本发明提供一种获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法，以有助于制备免疫效果特别理想的塞内卡病毒疫苗。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1、使用塞内卡病毒原始毒对本动物猪进行攻毒

该实施例中选择使用SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886(参见CN110551694A)的F7代病毒液作为塞内卡病毒原始毒病毒液(测定毒价为10

(1)实验动物选取：选取90日龄以上健康易感架子猪10头(购自呼和浩特某猪场)，雌雄不限，SVA血清中和抗体效价水平小于1:2。其中5头攻毒，作为试验组，另外5头作为对照。

(2)用塞内卡病毒原始毒病毒液对试验组家猪进行攻毒，攻毒途径为滴鼻，攻毒剂量为5.0ml/头，每鼻孔2.5ml；对照组以相同方式及剂量接种生理盐水。

(3)攻毒后每天观察试验组家猪的发病情况，发现攻毒后第5天，试验组家猪开始出现蹄掌部、蹄冠部边缘或蹄附趾部出现水疱、破溃或结痂；吻突部出现水疱、破溃或结痂等临床症状，发病率为2/5，而对照组猪未见异常。取发病猪发病组织进行PCR检测，结果为SVA阳性(具体PCR检测方法如以下实施例2中所述)。该攻毒试验结果表明，作为原始毒的SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886的F7代病毒液对本动物猪的致病能力较弱，致病率仅达到40％，表明其作为塞内卡病毒疫苗种毒时，免疫原性较弱，难以制备得到具有特别理想的免疫效果的塞内卡病毒疫苗产品。

实施例2、高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的获得

取实施例1中发病猪的PCR检测结果为SVA阳性的临床症状表现最为严重(即临床症状表现最为明显)的发病组织，经处理后接种PK-15贴壁细胞，具体包括以下步骤。

(21)病料处理：选取发病猪的临床症状表现最为严重发病组织(蹄皮、水疱皮或结痂)，将发病组织用2000IU/ml的青链霉素冲洗后剪碎、研磨，加入适量含青霉素、硫酸链霉素各100IU/ml的PBS，浸泡过夜。将浸泡液吸出，5000r/min离心10分钟，取上清液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌备用。

(22)接种细胞：将步骤(21)处理后的上清液，按细胞培养基(DMEM)体积比5％～10％的量接种于长满单层的PK-15细胞上，于20～25℃吸附1～2小时，置于37℃的CO

(23)核酸检测：该步骤以步骤(22)中传代至F4代的病毒液(F4病毒液)为例，对病毒核酸进行检测。具体为对传代至F4代收获的病毒液进行RNA提取(采用RNA提取试剂盒，购自生工生物工程有限公司)，具体操作方法为：取200μl F4病毒液加入1.5ml离心管中，加入200μl Buffer V-L，涡旋振荡混合均匀，静置5分钟；加入75μl Buffer V-N，涡旋振荡混合均匀，12000rpm离心5分钟；将上清转移至新的2ml离心管中，加300μl异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6～8次，混合均匀，将其移入制备管，置于2ml离心管中，6000rpm/min离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加500μl Buffer W1A，置温室静置1分钟，12000rpm离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800μl Buffer W2，12000rpm离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12000rpm离心1分钟；将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40μl无酶水，室温静置1分钟，12000g离心1分钟洗脱获得RNA。用PCR方法鉴定SVA的具体操作方法如下：使用的PCR引物包括上游引物SVA-F：5’-TATCTCAGATCCCTGGCTGTC-3’(SEQ ID NO:1)，下游引物SVA-R：5’-CCTGATGATCACATTGTTGAGC-3’(SEQ ID NO:2)，扩增产物片段大小为129bp。反应体系：2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μl，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μl，PrimeScript RT EnzymeMixⅡ0.5μl，SVA-F(20μM)0.5μl，SVA-R(20μM)0.5μl，RNA模板2.0μl，RNA-free H

(24)病毒的克隆纯化：将步骤(22)传代至F2代(F2代为首次出现明显且典型的细胞病变的代次，使用该最低代次的病毒液进行克隆纯化，可以提高本发明方法的成功率，虽然高代次的病毒液中的病毒浓度比低代次的病毒液的浓度要高，但是一些非目的病毒也可能随着目的病毒的传代逐渐适应细胞，可能也会产生病变。因此，本发明方法中优选首次出现明显且典型的细胞病变的代次病毒液进行克隆纯化)的病毒液作10倍系列稀释为10

表1：克隆病毒蚀斑计数

注：蚀斑数是指每个稀释度4孔出现蚀斑的总数；

“/”表示未计数。

(25)测定克隆纯化后种毒的滴度并与原始毒对比：将克隆纯化后各种毒病毒液用病毒维持液作10倍系列稀释，取10

表2：克隆纯化后各种毒滴度的检测结果

(26)克隆纯化后种毒验证：按照上述步骤(23)分别提取F26、F213病毒液核酸，分别进行塞内卡病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪腹泻病毒PCR检测。鉴定结果为塞内卡病毒阳性，其他检测项为阴性。

(27)克隆纯化后种毒对本动物猪的致病能力测定：取90～95日龄猪5头，每头猪滴鼻攻击5ml克隆纯化后的F22种毒，左右鼻孔各2.5ml，攻毒后连续观察10日，作为攻毒组；另取90～95日龄猪2头，每头猪滴鼻攻击5ml PBS，左右鼻孔各2.5ml，连续观察10日，作为对照组。结果如下表3所示，可见攻毒组5头猪均出现SVA感染的典型症状，发病率为5/5，明显比原始毒的攻毒发病率(40％)高，也明显比上述文献1公开的疫苗用种毒的攻毒发病率(80％)高，对照组2头猪未见异常。因此，该F22种毒即可作为高毒力塞内卡病毒疫苗种毒。

表2：克隆纯化后种毒对本动物猪的致病能力测定结果

以上实施例2结果表明，本发明提供的获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法通过选取经塞内卡病毒原始毒感染后的发病猪的临床症状表现最严重的发病组织(该发病组织可以是塞内卡病毒原始毒对健康易感的本动物猪进行攻毒后使攻毒猪产生典型的临床症状，且临床症状表现最严重的发病组织。由于塞内卡病毒原始毒对本动物猪进行攻毒后，可以在猪体内进行多轮次繁殖，进而可以提高该塞内卡病毒的毒力，并且在临床症状表现最严重的发病组织中存在的塞内卡病毒的毒力更强)，并经培养传代和连续多次克隆纯化，可以获得高毒力的塞内卡病毒疫苗种毒，具体为获得高滴度且对本动物猪的致病能力强的塞内卡病毒疫苗种毒。

该实施例使用SVV/CH/ZZ/2016CGMCC No.14886的F7代毒株(病毒滴度为10

因此，本发明提供的获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法可包括以下步骤：

S1：选取经塞内卡病毒原始毒感染后的发病猪的临床症状表现最严重的发病组织，经处理后接种PK-15细胞，培养传代至能够使PK-15细胞产生明显且典型的细胞病变(优选首次能够使PK-15细胞产生明显且典型的细胞病变)，收获病毒液；

S2：取步骤S1收获的病毒液进行连续N代次病毒克隆纯化，获得N个种毒，其中N≥1；

S3：对步骤S2每次克隆纯化后获得的种毒的滴度进行检测，以获得高滴度塞内卡病毒种毒(滴度≥10

S4：对步骤S3获得的该高滴度塞内卡病毒种毒对本动物猪的致病能力进行检测，直至获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒(满足滴度≥10

实施例3：由高毒力塞内卡病毒疫苗种毒制备的塞内卡病毒疫苗的效力评价

该实施例使用上述实施例2获得的F22病毒液(滴度为10

表4：灭活疫苗的血清学效力检验的中和抗体效价水平

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> 一种获得高毒力塞内卡病毒疫苗种毒的方法及其应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatctcagat ccctggctgt c 21

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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