一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶及其制备方法和应用，其制备方法包括：将碳源和氮源按质量比0.02‑0.2：1研磨混匀后，在惰性气体保护下依次经550‑650℃碳化和750‑850℃保温45‑100min石墨化，收集后研磨得到二维类石墨烯碳GMCs；将二维类石墨烯碳GMCs加入到PBS中，超声处理后加入酶溶液，经常温振荡、离心、洗涤和真空冷冻干燥后即得。本发明所制备的二维类石墨烯碳GMCs具有较大的比表面积可以为酶的负载提供位点，增加酶的负载率，减少酶的堆积，且有利于酶催化过程中的质量转移；制备的二维类石墨烯碳GMCs固载的酶用于催化叶黄素与琥珀酸酐酯化具有较高的酯化率。

说明书

技术领域

本发明涉及酶固定化技术领域，更具体地，涉及一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶及其制备方法和应用。

背景技术

催化剂的研究一直以来都备受关注，不论是在基础研究还是在工业生产中都具有加快反应速率、提高产率、缩短时间和降低成本的作用；然而，包括酸、碱和过渡金属催化剂等在内的传统催化剂均存在反应温度高、难溶于有机溶剂、易腐蚀反应容器、难分离、后处理麻烦、催化效率低和污染严重等问题。

生物催化剂作为一种新型催化剂引起了人们浓厚的研究兴趣。脂肪酶是一类重要的生物催化剂，与非生物催化剂相比，具有易于在常温常压下反应、反应速率快、催化作用专一等优势，广泛应用于食品加工、医药、纺织物、生物传感器、生物柴油等工业生产中，还与生命科学的发展密切相关。脂肪酶能够催化酯键的水解和合成，具有很高的区域选择性和对映体选择性，能够催化很多类型的反应，但其只在油水界面发生催化，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物的水解才有显著的催化作用；此外，脂肪酶易受到反应体系温度、pH、溶剂、反应底物浓度等因素的影响而使得酶活性降低甚至失活。同时因为脂肪酶难回收，导致酶重复使用率低，大大增加了使用成本。

叶黄素是存在于人类血清中的六大类胡萝卜素之一，具有抗氧化、增强人体免疫系统、延缓与年龄相关的黄斑变性等功能，是人类重要的膳食补充剂；然而，由于叶黄素富含不饱和键，在光照或加热的条件下极易分解。将叶黄素两端的羟基与不同的脂肪酸或酸酐酯化形成叶黄素二酯，不仅能有效提高其稳定性和生物利用率，还可以赋予叶黄素不同的功能和活性。利用固定脂肪酶催化酯化制备叶黄素二酯，能够避免叶黄素本身的结构不被破坏。

现有叶黄素酯的合成方法(天然提取法和化学合成法等)的工艺流程繁琐复杂，提取效率低，还存在溶剂污染、环境污染等问题；而生物酶合成法制备叶黄素酯具有效率高、选择性强、专一性强、催化介质温和、环境友好等优点，是一种很有前景的方法。但是，由于游离脂肪酶对反应条件极为敏感，容易失活，成本较高，难以实现在大规模工业生产中应用。目前大多使用商业固定化酶Novo 435，且均使用甲苯、甲基叔丁基醚(MTBE)或甲基异丁基酮(MIBK)等毒性和污染性较强的溶剂作为叶黄素酯化介质，在食品领域中应用是不可取的。

因此，迫切需要开发绿色安全的固定化脂肪酶及溶剂以实现叶黄素酯的高效酶法合成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶及其制备方法和应用。

本发明采用如下技术方案：

一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶的制备方法，包括：

S1、将碳源和氮源按质量比为0.02-0.2：1的比例研磨混匀后，在惰性气体保护下，依次经过550-650℃碳化和750-850℃下保温45-100min进行石墨化后，收集产物，研磨得到二维类石墨烯碳GMCs；

S2、将二维类石墨烯碳GMCs加入到PBS中，超声处理后，加入酶溶液后，在常温下振荡后，依次经离心、洗涤和真空冷冻干燥后，即得二维类石墨烯碳GMCs固定化酶。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述碳化的过程的升温速率为小于3℃/min，优选为2-2.5℃/min。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述石墨化的过程的升温速率为小于2℃/min，优选为1.2-1.75℃/min。

再进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述碳化的碳化温度为580-625℃，优选为600℃。

再进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述石墨化的温度和保温时间分别为780-845℃和50-75min，优选为800℃和60min。

具体地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、壳聚糖和纤维素中的一种或多种，优选为葡萄糖。

具体地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述氮源为二氰二胺、三聚氰胺、单氰胺、尿素和盐酸胍中的一种或多种，优选为二氰二胺。

又进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述碳源和氮源的加入量之比为0.025：1。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，对应于每100mg的二维类石墨烯碳GMCs，所述PBS的加入量为20-50mL，优选为30mL。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，对应于每100mg的二维类石墨烯碳GMCs，所述酶溶液的加入量为控制酶溶液中所含的酶的质量为100-500g，优选为300g。

具体地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述酶溶液的浓度为5-20g/mL，优选为15g/mL。

又进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述振荡的转速和时间分别为130-180rpm和8-15h。

又进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述离心和洗涤的次数相同，且均为2-5次。

本发明另一方面还提供了上述制备方法制备得到的二维类石墨烯碳GMCs固定化酶。

本发明又一方面还提供了上述制备方法或上述二维类石墨烯碳GMCs固定化酶在酶法合成叶黄素酯中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所制备的二维类石墨烯碳GMCs具有较大的比表面积可以为酶的负载提供位点，一方面增加了酶的负载率，另一方面减少了酶的堆积，另外，较大的比表面积有利于，酶催化反应过程中的质量转移，从而提高了催化效率；

(2)相对于游离酶而言，本发明所制备的二维类石墨烯碳GMCs固定化酶，能够赋予酶重复使用性，从而降低了成本，且热稳定性和pH适应性提高，能够使得酶的应用范围更广；

(3)本发明制备二维类石墨烯碳GMCs过程中所选用的原料来源广泛，而且价格低廉，使用成本低，其制备过程简单，操作简单，在实际应用中有很好的发展前景；

(4)本发明所制备的二维类石墨烯碳GMCs可用于固载各种不同类型的酶，其普适性较好，所制备的二维类石墨烯碳GMCs固载的酶用于催化叶黄素与琥珀酸酐酯化，相对于游离酶具有较高的酯化率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。

基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

在本发明实施例中，所使用的原料均为常规市售产品。

实施例1

本发明实施例提供一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、分别以葡萄糖和二氰二胺为碳源和氮源，按质量比为0.025：1的比例称取碳源和氮源，用玛瑙研钵研磨混匀后转移至氧化铝坩埚中，转移至管式炉中，在氮气保护下，由常温按2.5℃/min的升温速率升温至600℃碳化后，再以1.667℃/min的升温速率升温至800℃下保温60min进行石墨化，随后自然降温至室温，得到的块状蓬松黑色产物，研磨后即得二维类石墨烯碳GMCs，称重并保存在干燥的样品瓶中；

S2、称取0.1g步骤S1制得的二维类石墨烯碳GMCs加入到30mL的PBS中，超声处理后，加入20mL浓度为15g/mL的CALB溶液，在常温下以150rpm的转动速度振荡12h，最后经离心、洗涤和真空冷冻干燥，得到二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶。

分析检测步骤S1制得的二维类石墨烯碳GMCs的微观结构和孔结构，可知所制得的二维类石墨烯碳GMCs粉末蓬松，且具有堆叠而成的多孔结构；根据BET测试结果可知，其比表面积高达372.2m2/g。

此外，分别选用三聚氰胺和尿素为氮源，以葡萄糖为碳源，选用上述工艺并采用相同的工艺参数，制得二维类石墨烯碳GMCs及二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶；采用BET测试选用三聚氰胺和尿素为氮源所制得的二维类石墨烯碳GMCs的比表面积分别为303.5m2/g和212.6m2/g。

实施例2

本发明实施例提供一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、分别以壳聚糖和三聚氰胺为碳源和氮源，按质量比为0.05：1的比例称取碳源和氮源，用玛瑙研钵研磨混匀后转移至氧化铝坩埚中，转移至管式炉中，在氮气保护下，由常温按2.5℃/min的升温速率升温至785℃碳化后，再以1.6℃/min的升温速率升温至800℃下保温60min进行石墨化，随后自然降温至室温，得到的块状蓬松黑色产物，研磨后即得二维类石墨烯碳GMCs，称重并保存在干燥的样品瓶中；

S2、称取0.1g步骤S1制得的二维类石墨烯碳GMCs加入到35mL的PBS中，超声处理后，加入15mL浓度为20g/mL的CALB溶液，在常温下以175rpm的转动速度振荡10h，最后经离心、洗涤和真空冷冻干燥，得到二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶。

通过XPS和EDS检测步骤S1中分别以壳聚糖和三聚氰胺为碳源和氮源采用上述工艺参数制得的二维类石墨烯碳GMCs，结果表明，其N的含量为24％，且表面含有较多的含N、O的多电子基团。

此外，分别选用二腈二胺和尿素为氮源，以蔗糖为碳源，选用上述工艺并采用相同的工艺参数，制备得到二维类石墨烯碳GMCs，同样采用XPS和EDS对其进行检测，结果表明，其N的含量分别为18％和13％。分析其原因，主要在于：壳聚糖和三聚氰胺分子中均含有N原子，且一个三聚氰胺单体中含有6个N原子，且在煅烧过程中，N原子不会损失，因此所制得的二维碳材料表面具有较高的多电子基团；而这些基团能够通过氢键或静电吸附来固定酶，从而提高固定酶的循环稳定性及温度耐受性。

实施例3

本发明实施例提供一种二维类石墨烯碳GMCs固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、分别以葡萄糖和二氰二胺为碳源和氮源，按质量比为0.025：1的比例称取碳源和氮源，用玛瑙研钵研磨混匀后转移至氧化铝坩埚中，转移至管式炉中，在氮气保护下，由常温按2.5℃/min的升温速率升温至600℃碳化后，再以1.667℃/min的升温速率分别升温至700℃、750℃、800℃和850℃下保温60min进行石墨化，随后自然降温至室温，得到的块状蓬松黑色产物，研磨后即得二维类石墨烯碳GMCs，称重并保存在干燥的样品瓶中；

S2、称取0.1g步骤S1中在不同温度下进行石墨化制得的二维类石墨烯碳GMCs加入到30mL的PBS中，超声处理后，加入20mL浓度为15g/mL的CALB溶液，在常温下以150rpm的转动速度振荡12h，最后经离心、洗涤和真空冷冻干燥，得到二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶。

对比分析不同石墨化温度对二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶，结果表明：

在较高温度下石墨化，其表面的含氧基团会脱落，从而使得二维类石墨烯碳GMCs表面石墨化程度越高；由于含氧基团的减少，会提高其表面的疏水性；对于酶的固定而言，由于酶具有盖子结构，固定在疏水的材料表面，在一定程度上有利于酶的盖子结构打开，使得内部的活性中心暴露从而有利于提高酶的催化活性；因此，在一定程度上提高煅烧温度能够，增加材料表面疏水性从而提高酶催化活性，但是继续增加煅烧温度会导致表面的含氧基团极大的减少，表面带电基团的减少会减少酶的负载率同时减少了材料与酶之间的氢键等相互作用不利于酶的循环稳定性及温度耐受性。

结果验证

分别检测实施例1-3所制得的二维类石墨烯碳GMCs固定化酶的催化效率和循环稳定性等，同时以不采用二维类石墨烯碳GMCs作为负载的CALB为空白对照组；各试验组的样品信息具体具体如下：试验组1为实施例1中以葡萄糖和二氰二胺为碳源和氮源在800℃下保温石墨化所制得的二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶，试验组2为实施例2中以壳聚糖和三聚氰胺为碳源和氮源在800℃下保温石墨化所制得的二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶，试验组3为实施例3中以葡萄糖和二氰二胺为碳源和氮源在750℃下保温石墨化所制得的二维类石墨烯碳GMCs固定化CALB酶。

具体检测结果如下表1所示。

表1样品的性能检测结果

分析表1的结果，可以看出：通过将CLAB固定在具有较大的比表面积并结构蓬松多孔的二维类石墨烯碳GMCs，能够提高固定酶的对叶黄素酯催化活性及循环稳定性，且所得的固定酶在较宽的温度范围内具有较高的稳定性。

究其原因在于，一方面，制备的多层二维类石墨烯碳GMCs具有较高的比表面积，其固定酶后进行催化会有利于催化过程中质量转移，减少催化产物堆积，有利于催化的进行，此外，由于蓬松多孔的结构能够提高酶的负载率，从而提高了催化活性物质酶的量，提高了催化过程中酶与反应底物的接触，进一步提高其催化酯化率，同时，载体材料表面含有氨基等官能团，能够通过氢键、静电吸附等作用固定酶，从而使得固定酶在循环使用的过程中其表面的酶不易脱离，从而提高了固定酶的循环稳定性，进一步地，对于温度稳定性的提升，这是因为酶通过氢键和静电吸附等作用固定在载体表面后，酶结构不易改变，随着温度在一定程度上的升高，酶结构稳定，活性保持。

本发明实施例所制备的二维类石墨烯碳GMCs具有较大的比表面积可以为酶的负载提供位点，既增加了酶的负载率，又减少了酶的堆积，且较大的比表面积有利于，酶催化反应过程中的质量转移，从而提高了催化效率；相对于游离酶而言，二维类石墨烯碳GMCs固定化酶能够赋予酶重复使用性，从而降低了成本，且热稳定性和pH适应性提高，能够使得酶的应用范围更广；本发明实施例所制备的二维类石墨烯碳GMCs可用于固载各种不同类型的酶，其普适性较好，所制备的二维类石墨烯碳GMCs固载的酶用于催化叶黄素与琥珀酸酐酯化，相对于游离酶具有较高的酯化率。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本领域技术人员在此基础上做出的非突出的实质性特征和非显著进步的改进，均属于本发明的保护范畴。