一种调控牛分枝杆菌逆境适应能力的sRNA基因及其应用

摘要

本发明公开了一种调控牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)逆境适应能力的sRNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，属于分子生物学领域。该sRNA基因具有调节牛分枝杆菌对碳饥饿、酸化压力、膜压力条件适应能力的显著特征，并能够调节牛分枝杆菌的细菌生长、生物被膜形成、细胞壁通透性、对宿主细胞的侵袭能力等，从而调控牛分枝杆菌的逆境适应能力。本发明能用于制备防治结核病的疫苗或药物，在降低牛分枝杆菌细菌毒力、提高细菌对抗结核药物的敏感性等方面具有潜在应用前景，同时在阐明牛分枝杆菌甚至结核分枝杆菌复合群的相关致病机制及开发新型诊断试剂等方面也具有极为重要的参考价值。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种调控牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)逆境适应能力的sRNA基因及其应用。

背景技术

人兽共患性结核病是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosisComplex，MTBC)感染引起的慢性消耗性疾病。包括人在内的几乎所有脊椎动物都易感。其中，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)是引起动物结核病的主要病原菌，与主要引起人结核病的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)高度同源，基因水平上有99.95％的相似性，因此感染谱相互交叉。

研究结果显示，2010-2019年我国牛结核病的总体个体流行率约为2.4％，大约有25.9万头牛的感染(Gong QL,et al.,2021)；而更为严重的是，在全球人结核病例中，约有14万人即所有病例的1.8％为牛分枝杆菌感染；在一些牛结核病严重的国家，该比例则显著升高(Olea-Popelka F,et al.,2017)，如墨西哥(28％)，尼日利亚(15％)，坦桑利亚(16％)，埃塞俄比亚(17％)，印度(9％)和土耳其(5％)等。在一些发展中国家这一比例由于无法区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌感染等技术原因，造成评估比例偏低，低估了牛结核病在结核病感染和公共卫生的重要影响(Müller B,et al.,2013)。我国的一项回顾性调查显示，约为0.34％的结核病人感染的为牛分枝杆菌(Chen Y,et al.,2009)。

牛分枝杆菌是一种具有悠久历史的病原菌，它的发现甚至早于结核分枝杆菌。在长期的进化过程中，牛分枝杆菌在一系列的逆境压力如酸化压力、膜压力、低氧、亚硝基应激、氧化还原应激、营养饥饿等条件下不断通过各种调节机制适应这些逆境环境，从而成功实现了与宿主的长期协同进化，最终导致对宿主的感染、发病及扩散，以及对药物耐受能力的不断提升。因此，深入挖掘牛分枝杆菌适应逆境的分子机制，确定影响牛分枝杆菌感染、致病及扩散、耐药的主要关键因子，是开发牛结核病甚至于结核病新型诊断试剂、疫苗、药物的重要途径。

细菌的小RNA(small RNA,sRNA)是一类能够帮助病原菌适应环境压力变化的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子，通过与其靶mRNA配对，在转录后水平影响靶mRNA的翻译或(和)稳定性，对靶基因的表达进行调节，并在外界因素的刺激下，通过自身的表达来帮助病原菌适应不断变化的环境，调节致病的关键阶段。

在目前动物结核病缺乏疫苗，缺乏诊断金标准，耐药菌严重的各种严峻形势下，sRNAs的研究无疑为人兽共患性结核病新型防控手段的研发提供了一个新的思路。寻找并确定以牛分枝杆菌为模型的结核分枝杆菌复合群中具有调控逆境能力、影响细菌致病性(包括黏附、侵袭能力、胞内存活能力、生长速度等)、改变细菌耐药性等多种表型的sRNA，将有助于我们对结核病致病机理及宿主防御机制的了解，可以为结核病诊断和临床治疗技术发展提供理论依据和候选靶点。

发明内容

为了补充现阶段尚未研究清楚的牛分枝杆菌的致病机理，为人兽共患性结核病的诊断和临床治疗技术的发展提供理论依据，本发明提供了一个重要的牛分枝杆菌sRNA基因ncBCG427(以下简称ncBCG427)，该基因能调控牛分枝杆菌的逆境适应能力，改变细菌致病性和耐药性，具有开发为人兽共患性结核病新型诊断试剂、疫苗、药物靶标等的潜力，并为牛分枝杆菌致病机理研究、免疫机制研究提供重要的理论依据。

为了实现上述目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室、国家动物结核病专业实验室(武汉)对牛分枝杆菌卡介苗(BCG)东京株感染巨噬细胞THP-1后胞内及胞外菌的总RNA进行了全转录组的测序，发现胞内及胞外菌中有315个ncRNA出现了差异表达。进一步的通过铁饥饿、碳饥饿、酸化压力、氧化压力、膜压力以及模拟肉芽肿压力这6种压力模型对这些差异ncRNA进行了筛选，发现有14个ncRNA在不同压力条件下出现了表达的差异。其中一种只在胞外菌中存在的ncRNA于碳饥饿、酸化压力及膜压力条件下的表达均显著下调。经鉴定该ncRNA为一种新型的sRNA，且位于基因间，推测其对牛分枝杆菌的逆境适应能力具有调控作用，编码该sRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，申请人将该基因命名为ncBCG427。

申请人以牛分枝杆菌经典模式菌株耻垢分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis,MS)为模板，构建ncBCG427的过表达菌株，命名为MS_ncBCG427。

通过对过表达菌株进行菌落形态、生长速度、侵袭能力等的测定，发现ncBCG427过表达菌株相比野生株更快到达对数生长期，但也更快进入平台期，平台期后的OD

接着，对ncBCG427过表达菌株MS_ncBCG427的生物被膜形成能力进行了测定，发现ncBCG427能够显著提升细菌的生物被膜形成能力。生物被膜能够帮助分枝杆菌抵御逆性环境压力，对细菌能起到积极的屏障作用。

为进一步验证ncBCG427在调控牛分枝杆菌逆境适应能力方面的功能，对过表达菌株MS_ncBCG427对抗结核一线药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、对氨基水杨酸(PAS)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)与左氧氟沙星(LVX)的敏感性进行了检测，发现MS_ncBCG427对INH与PAS的敏感性降低，对RFP与LVX的敏感性升高，推测sRNA ncBCG427可能改变了牛分枝杆菌细胞壁的通透性，从而改变细菌对药物的敏感性。

最后，将MS_ncBCG427感染A549细胞，通过平板计数检测MS_ncBCG427的侵袭能力，结果显示，MS_ncBCG427的侵袭能力显著降低，表明ncBCG427具有降低牛分枝杆菌侵袭宿主细胞的生物学功能，推测细菌为躲避细胞吞噬作用而主动选择上调ncBCG427的转录。侵袭是细菌实现感染的重要步骤，直接影响着细菌的毒力，该结果也预示了ncBCG427具有降低细菌毒力的作用。

综上所述，ncBCG427是一种调控牛分枝杆菌逆境适应能力的sRNA基因，该基因在调控细菌生长、生物被膜形成、细胞壁通透性、宿主细胞侵袭等方面都发挥着重要作用，既可用于制备防治结核病的疫苗或药物，在降低牛分枝杆菌细菌毒力、提高细菌对抗结核药物的敏感性等方面具有潜在应用前景，同时在阐明牛分枝杆菌甚至结核分枝杆菌复合群的相关致病机制及开发新型诊断试剂等方面也具有极为重要的参考价值。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》。

附图说明

图1：BCG ncRNA用数据库Rfam和BSDR注释结果。

图2：ncBCG427在不同压力培养条件下表达情况的检测。ncBCG427在碳饥饿、酸压力和膜压力条件下显著下调(p<0.001)。

图3：ncBCG427在基因组的位置分布(A)及其二级结构预测(B)。ncBCG427的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致。

图4：ncBCG427在过表达耻垢分枝杆菌中表达量的检测。ncBCG427明显超高表达(p<0.001)。

图5：ncBCG427的耻垢分枝杆菌过表达菌株生长速度的测定。ncBCG427能够帮助细菌较快进入平台期，但后期生长缓慢。

图6：ncBCG427的耻垢分枝杆菌过表达菌株MS_ncBCG427菌落形态(A)及大小测定(B)。MS_ncBCG427菌落明显变小，皱褶变多且变高(p<0.05)。

图7：ncBCG427的耻垢分枝杆菌过表达菌株MS_ncBCG427侵袭能力的检测。MS_ncBCG427具有显著降低侵袭能力的表型(p<0.01)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：sRNA ncBCG427的筛选和压力适应性检测

1、牛分枝杆菌的RNA-Seq测序、数据处理与sRNA的注释

将牛分枝杆菌卡介苗东京株BCG(武汉大学刘君炎教授馈赠)复苏及培养后感染巨噬细胞24小时，收集胞内菌(感染巨噬细胞后处于细胞内的BCG)与胞外菌(感染巨噬细胞后处于细胞外即从培养基中收集到的BCG)进行RNA-seq测序。

首先将测序数据原始reads中包含超过2-N碱基的reads去除，然后将所得的reads去掉低质量的碱基、过短的reads(少于13nt)并切除adaptor。使用FASTX工具包获得cleanreads。使用Bowtie2将获得的clean reads mapping分别比对到M.tb 1458(NZ_CP013475)与BCG(NC_012207)基因组上，比对参数设置为不超过1nt错配。根据基因组注释和比对的reads位置计算区域分布，获得antisense sRNA和intergenic sRNA序列。比对后弃掉具有多个基因组比对位点的reads，仅取只有单一基因组位点的reads进行intergenic sRNA分析。对Intergenic sRNA的峰度进行筛选：(1)选取长度在40到500bp的峰；(2)单峰中位数高度不少于20nt；(3)单峰最大高度不应少于60nt。使用Graphpad Prism7.0或Excel对ncRNA数量分布与表达量差异进行可视化。

分析发现BCG保守表达的ncRNA有243个，胞内菌特有表达的76个，胞外菌中特有表达的171个。

使用Rfam数据库(http://rfam.xfam.org/)对sRNA进行注释，Rfam数据库所使用的版本号为13。同时从BRSD数据库中下载分枝杆菌属的全部ncRNA信息，包括ID、菌种、基因组位置及序列信息等，利用NCBI-Blast本地版进行序列比对分析，以对全部ncRNA进行注释。结果显示，BCG中未注释的新型未知ncRNA达到96％以上。而被注释到的ncRNA，除小部分为核糖体RNA与转运RNA外，其余均是已有实验证实的具有调控功能的结核分枝杆菌小RNA(图1)。

2、差异ncRNA的初步筛选

对胞外菌与胞内菌比较后fold change不小于1.5，或者在胞外菌中有表达但胞内菌中无表达的，记为在胞外菌中上调表达的ncRNA；反之，则记为在胞外菌中下调表达的ncRNA，发现BCG胞外菌中，有192个ncRNA上调表达，123个下调表达；除胞内菌与胞外菌特有的ncRNA之外，保守且差异表达的ncRNA在BCG中仅剩68个。部分ncRNA仅在特定实验组内表达(表1)，因此在括号内标注了RPKM值。

表1具有显著差异的部分ncRNA差异倍数

3、压力模型对差异候选ncRNA的进一步筛选

按照分枝杆菌的正常培养方法扩大培养BCG菌株两周，待OD600nm达到0.8-1.0之间，将菌液重悬分散。并至于下述6种压力条件下进行培养。

(1)铁饥饿模型

3800r/min离心10min收集40mL菌液，PBS洗涤菌体1次后，用等体积的铁饥饿培养液重悬分散后，在5％CO

铁饥饿培养液：5g天冬酰胺，5g KH

(2)碳饥饿模型

3800r/min离心10min收集40mL菌液，PBS洗涤菌体1次后，再用等体积的PBS重悬分散后，在5％CO

(3)酸化压力模型

3800r/min离心10min收集40mL菌液，PBS洗涤菌体1次后，再用等体积的酸化7H9培养液(pH4.5)重悬分散后，在5％CO

酸化7H9培养液：4.7g 7H9粉末，2mL甘油，0.05％Tween-80，用蒸馏水定容至900mL，用盐酸调节pH值至4.5，121℃高温高压蒸气灭菌10min。待温度冷却至45℃左右，加入100mL OADC，4℃保存。

(4)氧化压力模型

3800r/min离心10min收集40mL菌液，PBS洗涤菌体1次后，再用等体积的氧化压力培养液重悬分散后，在5％CO

氧化压力培养液：7H9培养基灭菌后，在超净台内添加终浓度为1mM的tBHP，4℃保存。

(5)膜压力模型

3800r/min离心10min收集40mL菌液，PBS洗涤菌体1次后，再用等体积的SDS膜压力培养液重悬分散后，在5％CO

SDS膜压力培养液：7H9培养基灭菌后，在超净台内添加终浓度为0.05％的SDS，4℃保存。

(6)模拟肉芽肿压力模型

3800r/min离心10min收集40mL菌液，PBS洗涤菌体1次后，再用等体积的模拟肉芽肿压力培养液重悬分散后，使用封口膜将培养瓶封口，置于厌氧罐(缺氧环境)中，再放入5％CO

模拟肉芽肿压力培养液：4.7g 7H9粉末，2mL甘油，500μL Tween-80，54g葡萄糖，用蒸馏水定容至900mL，121℃高温高压蒸气灭菌10min。待温度冷却至45℃左右，加入100mLOADC，4℃保存。

培养完成后，采用甲醇裂解法提取分枝杆菌总RNA并进行反转录。将合成后的cDNA按1:10稀释，以sigA为内参基因，实验设置3个平行复孔，试验中根据复孔的数据剔除掉熔解曲线中出现明显双峰的数据。将候选sRNA相对表达量以2

在检测的37个差异BCG ncRNA中，13个在压力培养中有显著差异。其中，ncBCG427在碳饥饿、酸压力及膜压力培养条件下均明显下调(图2)。

4、ncBCG427的二级结构预测

使用RNAfold工具对ncRNA进行二级结构预测，设置最小自由能预测模型，获取ncRNA与靶标mRNA相互作用结合位点的loop环位置与结构信息。结果发现，ncBCG427位于基因间区，loop环大小在4-14bp内(图3)，且环内GC含量偏高，能够更精准且牢固地与靶标mRNA结合。其序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2：ncBCG427过表达菌株的构建及表型测定

1、ncBCG427过表达菌株构建

以耻垢分枝杆菌基因组为模板，扩增核糖体启动子rrnB(-200～-8)片段，pMV261改造为pMV261-P

以基因组为模板扩增ncBCG427，PCR循环条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环反应；72℃彻底延伸10min。反应体系为：模版(20ng)2μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，2×Phanta Max Master Mix(Vazyme)25μL，ddH

上游引物：

5’-agcttATGCACGACGACCCTCGCCTCCTCCCCCCCCTGGCGGGGGTCGTCCCTTTTGGCAGa-3’(SEQ ID NO:2)

下游引物：

5’-agcttCTGCCAAAAGGGACGACCCCCGCCAGGGGGGGGAGGAGGCGAGGGTCGTCGTGCATa-3’(SEQ ID NO:3)

使用Zymo胶回收试剂盒回收目的片段，使用无缝克隆技术连接rrnB启动子(上下游引物序列分别如SEQ ID NO：4、5所示)与Term转录终止子(上下游引物序列分别如SEQ IDNO：6、7所示)片段。根据TSINGKE公司的TreliefTM SoSoo Cloning Kit无缝高效克隆说明书配置反应体系，设置连接条件，37℃10min，然后50℃10min，立即保存于4℃备用。使用Vazyme公司的T4 DNA连接酶进行候选sRNA及连接反应，转化时设置空载对照组。

对长出的单菌落接种至5mL含卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养，每个平板挑选5-10个单菌落。待菌液浑浊后进行PCR鉴定，阳性克隆的菌液送天一辉远公司测序，测序结果显示序列正确且无任何突变的样品再扩培后保存，并进行菌液PCR鉴定。鉴定正确的菌液使用质粒小提试剂盒(天根)提取质粒。

制备耻垢分枝杆菌感受态细胞。分别取5μL的重组质粒和空载质粒pMV261-rrnBP加到200μL冰上化冻的电转感受态中，轻混匀后转移至预冷的电转杯中，冰上放置10min。擦干电转杯外壁的水，进行电击，电击程序为电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。待电击结束后，立即向电转杯中加入1mL 7H9培养基(不含Tween-80)，混匀后转移至15mL离心管中，于37℃温箱复苏4-6h，以复苏细胞。细胞复苏后，以5000r/min离心5-10min，弃掉大部分上清，将剩余的100-200μL培养基悬浮菌体后涂布含有相应抗生素的7H11固体平板。在37℃静置培养3-5天后，挑取单克隆验证。结果显示，ncBCG427在MS_ncBCG427中超高表达(p<0.001)(图4)。

2、ncBCG427过表达菌株的生长速度测定

将MS_ncBCG427菌株在7H9中静置培养，每隔12h检测一次600nm处的菌液吸光值，发现MS_ncBCG427在对数生长期表现出更快的生长速度，但更早进入平台期，且平台期后OD

将过表达菌株在固体培养基7H11上培养3-5d后，在体视显微镜下记录单菌落形态并测量单菌落面积大小。结果显示MS_空载菌株的单菌落表面较光滑湿润，MS_ncBCG427单菌落褶皱明显增多增厚，且单菌落变小，放大后增多的褶皱清晰可见，且褶皱的“嵴”明显变高(图6)。说明候选sRNA ncBCG427可能通过参与细胞壁组分表达的调控，显著影响耻垢分枝杆菌的生长。而且分枝杆菌的细菌形态及生长速度能够被细胞壁脂质组成所调节，由此推测sRNA ncBCG427有很大可能与脂质代谢调控网络相关。

3、ncBCG427过表达菌株药物敏感性测定

采用刃天青显色法测定过表达菌株对抗结核一线药物利福平RFP、异烟肼INH、对氨基水杨酸PAS、链霉素SM、乙胺丁醇EMB与左氧氟沙星LVX的最小抑菌浓度(MIC)，具体步骤如下：

(1)将重组与空载耻垢分枝杆菌接种至5mL含卡那抗性的新鲜7H9培养基中，37℃，180r/min恒温摇床培养至对数期(OD600nm＝0.6～0.8)，4000r/min离心5-10min集菌，再用无抗培养基分散后调整至OD600nm约为0.625备用。

(2)在无菌96孔板中每孔加7H9培养基100μL。在第1孔加适当稀释的抗结核药原液100μL，双倍连续稀释至第10孔。各孔药物最终浓度:链霉素64～0.125μg/mL，异烟肼256～0.5μg/mL，利福平256～0.5μg/mL，乙胺丁醇256～0.5μg/mL，左氧氟沙星64～0.125μg/mL，对氨基水杨酸1024～2μg/mL。

(3)将(1)中分散好的菌液在无菌96孔板中每孔接种100μL。设置菌液对照与纯培养基对照孔。

(4)用无菌膜封板，放入湿盒内，37℃培养24h后，加入过滤除菌0.1g/L刃天青显色液30μL至菌液对照孔，继续温育12h，如菌液对照孔(未加药物)变成粉红色，则加同量刃天青显色液至其他各孔，12h后记录颜色变化。如菌液对照仍为蓝色，每隔6h观察一次。颜色从蓝色变为粉色即预示细菌生长。以保持蓝色的最低药物浓度为MIC。

结果显示过表达菌株MS_ncBCG427对INH与PAS的敏感性降低，对RFP与LVX的敏感性升高(表2)，综合上述MS_ncBCG427菌株单菌落形态的改变，推测候选sRNA ncBCG427可能改变了耻垢分枝杆菌细胞壁的通透性，以使其过表达菌株对药物更为敏感。

表2 MS_ncBCG427对药物的敏感性测定

4、ncBCG427过表达菌株生物被膜形成能力测定

将重组与空载耻垢分枝杆菌接种至5mL含卡那抗性的新鲜7H9培养基中，37℃，180r/min恒温摇床培养至对数期(OD

小心去除生物被膜以外的液体和菌体，将12孔板在生物安全柜中吹干后，加入1％结晶紫500μL/孔，染色10min；无菌双蒸水洗涤3次，每次5min后再吹干；加入95％酒精1mL/孔作用10min，充分溶解后，3倍倍比稀释后测OD

结果显示MS_ncBCG427生物被膜成膜能力显著提高，且更多明显的皱襞漂浮在培养液表面。由于生物被膜能够帮助分枝杆菌抵御逆性环境压力，对细菌起到积极的屏障作用，且牛分枝杆菌的生物膜可导致耐药表型，能有效对抗50倍最小浓度的抗结核药物异烟肼和利福平。因此推测MS_ncBCG427通过对生物被膜形成的调控来协助牛分枝杆菌抵御逆境。

5、ncBCG427过表达菌株侵袭能力的测定

将A549细胞复苏后进行传代。将重组菌及耻垢分枝杆菌接种于7H11固体培养基上，于37℃孵育箱中培养；挑取适量新鲜的菌苔至10mL EP管中，管中加入2mL HBSS(含0.5％吐温)溶液，用注射器将菌液吹散，以HBSS稀释菌悬液至OD600nm约0.625，即浓度为10

待A549细胞长成单层细胞后，弃去细胞瓶中的培养液，加入2mL胰酶稍冲洗后弃掉，重新加入等量的消化液静置3min；倒掉消化液，加入5mL DMEM培养液(含10％FBS)，吹打瓶壁至细胞完全脱落；将细胞悬液转入50mL离心管中，3000r/min离心7min，弃上清，加入适量的DMEM完全悬浮细胞；对细胞悬液进行计数，制备1×10

以每孔2×10

结果显示，MS_ncBCG427侵袭能力显著降低(图7)，表明高表达的sRNA ncBCG427不利于耻垢分枝杆菌侵入宿主细胞，因此推测在BCG中，细菌为躲避细胞吞噬作用而主动选择上调sRNA ncBCG427的转录，以使其抑制某些细胞壁表面抗原蛋白的表达。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控牛分枝杆菌逆境适应能力的sRNA基因及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)

<400> 1

atgcacgacg accctcgcct cctccccccc ctggcggggg tcgtcccttt tggcag 56

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcttatgca cgacgaccct cgcctcctcc cccccctggc gggggtcgtc ccttttggca 60

ga 62

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcttctgcc aaaagggacg acccccgcca ggggggggag gaggcgaggg tcgtcgtgca 60

ta 62

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaccagatc tttaaatcta gatttatgtg aacaacgcg 39

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgacatcg ataagcttaa gttacgtcct tggaaac 37

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcttccccg cgaaagcggg gttttttttt t 31

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agctaaaaaa aaaaccccgc tttcgcgggg 30