评价鱼类环境污染程度的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了评价鱼类污染程度的方法和试剂盒，其中，检测鱼类污染程度的方法包括：将冷冻的待测鱼类进行切片处理，以便得到待测切片；将所述待测切片进行常压敞开式质谱成像检测，以便得到质谱检测信息；基于所述质谱检测信息，以便得到污染标志物的分布信息；以及基于所述污染标志物的分布信息进行污染程度分析，以便获得所述待测鱼类的污染程度。该方法用于确定鱼类所处的污染阶段，检测速度快、操作简单，能有效为食品安全提供指导。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地，评价鱼类环境污染程度的方法和试剂盒。

背景技术

全氟化合物(PFCs)，作为一种工业化学制品，自20世纪50年代以来一直在使用。由于PFCs具有较高的稳定性和较强的疏脂疏水性能，常用于各种工业产品中，如防护涂料、表面活性剂、油漆材料、消防泡沫，以及不粘炊具、一次性食品包装等日常消费品中。此外，PFCs既抗化学降解又抗生物降解，导致其无法被常规污水处理厂有效去除。此前的研究发现，中国城市和地区的饮用水中的PFCs污染已经到了令人担忧的水平。PFCs大部分被释放到水环境中，分布在自然水体、生物样品等基质中，且持久性高，容易发生生物积累。另一方面，PFCs具有毒理学作用，会影响脂肪酸和脂质代谢，流行病学研究发现，接触PFCs与健康问题之间存在联系，如胆固醇和肝酶升高、睾丸癌和肾癌发病率增加、生育能力下降等；而且，它们还可以沿着食物链转移和生物放大，在许多物种甚至人体组织中都发现了它们的存在。虽然我国水产品质量安全水平呈稳定提升，但鱼体内检测到PFCs的情况仍时有发生。

因此，鱼类的污染，尤其是PFCs导致的鱼污染有待进一步研究，从而保证水产品的质量安全。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种评价鱼类环境污染程度的方法，该方法通过对待测切片进行敞开式质谱成像检测，得到差异化的组织分布信息，从而获得鱼类污染程度的信息，该方法用于确定鱼类所处的污染阶段，检测速度快、准确率高，能有效为食品安全提供指导。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种评价鱼类环境污染程度的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将冷冻的待测鱼类进行切片处理，以便得到待测切片；将所述待测切片进行常压敞开式质谱成像检测，以便得到质谱检测信息；基于所述质谱检测信息，以便得到污染标志物的分布信息；以及基于所述污染标志物的分布信息进行污染程度分析，以便获得所述待测鱼类的污染程度。

根据本发明实施例的评价鱼类环境污染程度的方法，通过对待测鱼类的切片进行敞开式质谱成像检测，得到污染标志物差异化的组织分布信息，从而获得鱼类污染程度的信息，该方法适于确定鱼类所处的污染阶段，无需复杂的预处理过程、操作简单、检测速度快、绿色环保，能有效为食品安全提供指导。

另外，根据本发明上述实施例的评价鱼类环境污染程度的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述切片处理是沿所述待测鱼类的身体的纵向进行的。

根据本发明的实施例，所述切片处理是沿所述待测鱼类的身体的纵向进行的。

根据本发明的实施例，所述待测切片的厚度为20-40μm。

根据本发明的实施例，谱成像检测为MALDI-TOF-MSI质谱成像检测。

根据本发明的实施例，所述常压敞开式质谱成像检测包括：将所述待测切片进行多次基质喷涂处理，以便得到喷涂后切片；以及利用成像显微镜对所述喷涂后切片进行质谱成像检测，以便得到所述质谱检测信息。

根据本发明的实施例，所述常压敞开式质谱成像检测的质谱条件：离子极性：负离子；质量范围：m/z 100-850Da；样品电压：3.0kV；检测器电压：1.90kV。

根据本发明的实施例，所述污染标志物为全氟化合物(PFCs)。

根据本发明的实施例，所述污染标志物为全氟辛酸(PFOA)。

根据本发明的实施例，所述污染标志物，所述污染程度分析包括：基于所述质谱检测信息，以便得到不同组织的污染标志物随时间变化的曲线；基于曲线斜率的变化趋势，将所述不同组织分为I类组织和II类组织，其中，所述I类组织的所述曲线的斜率呈减小趋势，所述II类组织的所述曲线的斜率呈增加趋势；将同一时间点的所述I类组织的所述污染标志物的强度除以所述II类组织的所述污染标志物的强度，得到随时间变化的强度比，以便得到随时间变化的污染曲线；以及基于所述污染曲线，以便获得所述待测鱼类的污染程度。

根据本发明的实施例，所述I类组织为胆囊、肝脏、心脏、肾脏或肠道，所述II类组织为鱼鳔、脊髓、鳃、肌肉或脑。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种评价鱼类环境污染程度的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测鱼类污染程度的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，本发明实施例的试剂盒通过对待测鱼类的切片进行敞开式质谱成像检测，得到污染标志物差异化的组织分布信息，从而获得鱼类污染程度的信息，该试剂盒适于确定鱼类所处的污染阶段，样品用量少、操作简单、检测速度快、准确率高，能有效为食品安全提供指导。此外，需要说明的是，该试剂盒具有前述检测鱼类污染程度的方法的全部技术手段和技术特征，在此不再一一赘述。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的斑马鱼组织光学图像和PFOA相关的MALDI信号图；

图2显示了根据本发明一个实施例的心脏的I类拟合曲线的结果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的大脑的II类拟合曲线的结果示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的“暴露曲线”的结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种评价鱼类环境污染程度的方法。本发明实施例的检测鱼类污染程度的方法，通过对待测鱼类的切片进行敞开式质谱成像检测，得到污染标志物差异化的组织分布信息，从而获得鱼类污染程度的信息，该方法适于确定鱼类所处的污染阶段，样品用量少、操作简单、检测速度快、准确率高，能有效为食品安全提供指导。

根据本发明实施例的评价鱼类环境污染程度的方法，通过对两类不同组织在一段时间内污染标志物的含量进行测定，并通过评估含量的比值的变化趋势来判断所处的污染阶段，实现了鱼类污染程度和污染时间的判定。

为了便于理解该评价鱼类环境污染程度的方法，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明：

S100切片处理

根据本发明的实施例，将冷冻的待测鱼类进行切片处理，得到待测切片。由此，通过显微镜观察切片的情况，灵活自由选择待测切片，提高检测的准确性和自由度。

在此需要说明的是，切片处理的方法可以根据待测鱼类的品种、实验条件和污染标志物的种类等自行选择。根据本发明的一些实施例，该切片处理包括：将鱼类进行冷冻，得到冷冻鱼类；将冷冻鱼类进行冷冻切片，得到切片样本；将切片样本进行显微观察，选取所述待测切片。其中，需要说明的是，在冷冻之后，切片之前，可以将冷冻鱼类进行固定包埋，得到包埋后鱼类；包埋用包埋剂将组织包裹起来以提供性能支撑或化学保护的过程，鱼类的肉质较软，部分组织可能比较松散，通过包埋，使鱼类质地变硬或变紧实，便于后续处理。根据本发明的一些实施例，该冷冻为液氮冷冻。

根据本发明的实施例，所述切片处理是沿所述待测鱼类的身体的纵向进行的。由此，切片覆盖的脏器和组织多，便于观察污染标志物各脏器和组织的分布情况。

根据本发明的实施例，所述待测切片的厚度为20-40μm。由于在质谱成像中，污染标志物的强度随着切片厚度的增加而增加，但是，当切片过厚时，会丢失大量的空间分布信息，降低了空间分辨率。由此，上述厚度的切片，污染标志物的强度适宜，有利于充分获得污染标志物的空间分布信息，空间分辨率高，污染程度检测准确性高。

S200质谱成像检测

根据本发明的实施例，将所述待测切片进行常压敞开式质谱成像检测，得到质谱检测信息。由于敞开式质谱具有操作简单、分析时间短、无须或仅很少的样品需预处理、样品用量少，适于切片的目标化合物的分布检测。

根据本发明的实施例，谱成像检测为MALDI-TOF-MSI质谱成像检测。该质谱检测利用分子成像技术，可以同时检测和表征多种化合物的空间分布和相对丰度；该质谱检测适于提供同一组织切片中各种化合物的空间信息，无需额外标记、抗体反应、染色或其他复杂的样品前处理步骤；并且，该质谱检测方式可以直接分析样品，无需均质化和萃取，从而减少了分析物的损失。

根据本发明的实施例，所述常压敞开式质谱成像检测包括：将所述待测切片进行多次基质喷涂处理，以便得到喷涂后切片；以及利用成像显微镜对所述喷涂后切片进行质谱成像检测，以便得到所述质谱检测信息。

根据本发明的实施例，该成像显微镜为iMScope TRIO显微镜。由此，显微呈像效果好。

根据本发明的实施例，所述常压敞开式质谱成像检测的质谱条件：离子极性：负离子；质量范围：m/z 100-850Da；样品电压：3.0kV；检测器电压：1.90kV。由此，在该检测条件下，检测的准确率高。

S300污染标志物的分布分析

根据本发明的实施例，基于所述质谱检测信息，得到污染标志物的分布信息。由此，通过质谱结果，得到污染标志物在不同脏器和组织的分布情况。

根据本发明的实施例，所述污染标志物为全氟化合物(PFCs)。全氟化合物是常见的水污染物，并且对人体危害大，是重要的鱼类污染物，对鱼污染程度的判断有重要意义。根据本发明的具体实施例，所述污染标志物为全氟辛酸(PFOA)，全氟辛酸是常见的全氟化合物，也是重要的鱼类污染物。

S400污染程度分析

根据本发明的实施例，基于污染标志物的分布信息进行污染程度分析，获得所述待测鱼类的污染程度。

在此需要说明的是，准确预测不同组织中目标物含量是非常重要的，因为其含量受多种因素的影响。光学图中可清楚地看到各个组织所处的位置，MSI很难看到确切的含量变化规律和差异，故提取和记录目标物强度时在离子图中，通过目标物强度与光学图像进行对照，提取并记录单个组织中目标物的强度，对蓄积过程进行拟合尤为重要。

发明人发现，由于PFCs在不同组织中的分布速度和富集效率不同，污染标志物在不同组织中强度变化的速率不同，有的逐渐增加，呈增长趋势，有的逐渐减小，呈减小趋势，而这种速率上的差异适合于描述模式生物在环境中的暴露程度和时间，从而发明人将不同的组织分为I类和II类。根据本发明的实施例，所述污染程度分析包括：基于所述质谱检测信息，以便得到不同组织的污染标志物随时间变化的曲线；基于曲线斜率的变化趋势，将所述不同组织分为I类组织和II类组织，其中，所述I类组织的所述曲线的斜率呈减小趋势，所述II类组织的所述曲线的斜率呈增加趋势；将同一时间点的所述I类组织的所述污染标志物的强度除以所述II类组织的所述污染标志物的强度，得到随时间变化的强度比，以便得到随时间变化的污染曲线；以及基于所述污染曲线，以便获得所述待测鱼类的污染程度。

其中，需要说明的是，所述I类组织的所述曲线的斜率呈减小趋势，在一些实施例中，可以体现为I类组织污染标志物含量在暴露初期急剧增加，然后缓慢增加，最后趋于平衡；所述II类组织的所述曲线的斜率呈增加趋势，在一些实施例中，可以体现为II类组织污染标志物含量在暴露初期增长缓慢，然后急剧增加，最后趋于平衡。

通过对鱼类污染标志物进行检测，发明人得到一些常见I类组织和II类组织。根据本发明的实施例，所述I类组织为胆囊、肝脏、心脏、肾脏或肠道，所述II类组织为鱼鳔、脊髓、鳃、肌肉或脑。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种评价鱼类环境污染程度的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测鱼类污染程度的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，本发明实施例的试剂盒通过对待测鱼类的切片进行敞开式质谱成像检测，得到污染标志物差异化的组织分布信息，从而获得鱼类污染程度的信息，该试剂盒适于确定鱼类所处的污染阶段，样品用量少、操作简单、检测速度快、准确率高，能有效为食品安全提供指导。此外，需要说明的是，该试剂盒具有前述检测鱼类污染程度的方法的全部技术手段和技术特征，在此不再一一赘述下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例中，利用本发明实施例的检测鱼类污染程度的方法对斑马鱼的污染程度进行检测，其中，污染标志物是PFOA，具体如下：

1、设备和材料

(1)设备：

质谱显微镜(iMScope TRIO)仪器(岛津公司，日本)；

冷冻切片机(Leica CM 1950，德国)；

喷枪(MR.Linear Compressor L7/PS270 Airbrush，东京，日本)；

AG-204电子分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)。

(2)材料：

MALDI级的基质1,5-二氨基萘(DAN)(纯度＞98％)购自美国Sigma-Aldrich公司；三氟乙酸(TFA)购自美国Sigma-Aldrich公司；PFOA(≥99％)与PFOA(≥94.4％)分别购自美国Sigma-Aldrich公司和BEIJING MANHAGE BIO-TECHNOLOGY COMPANY；高效液相色谱级乙腈和甲醇由美国Fisher Chemical公司提供；去离子超纯水(＜18.2MΩcm电阻率)在Milli-Q水系统(Millipore，布鲁塞尔，比利时)上净化；氧化铟锡(ITO)涂层载玻片(尺寸75mm×25mm，表面电阻率≤6Ω/平方米)购自华南科学与技术有限公司。

2、实验方法：

(1)切片制备

斑马鱼阳性样品采用PFOA添加入培养环境中方式培养，分别于1、2、4、8、12、16、20、24和30天后处死。利用冷冻切片机(Leica CM 1950，德国)将速冻的样品在–20℃下切成40μm的薄片，然后利用融裱法将薄片贴在ITO导电载玻片上进行光学成像和后续的基质沉积及质谱成像研究。

(2)基质喷涂

A、称取适量的DAN基质，用含0.1％TFA的70％乙腈溶液溶解至浓度为10mg/mL的基质溶液；

B、用移液枪吸取1mL基质溶液添加到手动喷枪的空腔中(MR.Linear CompressorL7/PS270 Airbrush，东京，日本)，喷枪尖端与样品切片表面之间的距离约为10cm，基体每隔60秒连续喷2秒，直到基质用完；

C、将载玻片置于通风橱中5分钟，使溶剂蒸发进行MALDI-MSI分析，斑马鱼组织光学图像和PFOA相关的MALDI信号图如图1所示。

3、质谱检测

质谱数据是在成像显微镜(iMScope TRIO)仪器(岛津公司，日本)上获得的，该仪器配备有光学显微镜、大气压MALDI源(AP-MALDI)和混合四极离子阱飞行时间(QIT-TOF)质谱分析仪。本实施例使用5ns脉冲宽度的聚焦激光(355nm Nd:YAG激光)扫描样品切片。在iMScope系统中，激光的工作参数为：频率1000Hz，激光强度15.0，激光步距50μm，所有试验均在激光斑点直径(10μm)下进行，在优化的参数下，每像素照射样品表面125次。离子极性，负离子；质量范围，m/z 100-850Da；样品电压，3.0kV；检测器电压，1.90kV。Imaging MSSolution Version 1.30版本的软件(岛津公司，日本)用于控制仪器和数据采集。质谱成像数据提取m/z＝412.9(PFOA)获得，结果如图3所示，结果表明，PFOA具有时间和空间分布特征。

4、不同组织中PFOA含量变化曲线的拟合

经分析，得到两类组织模型：第一类(I类)模型：其含量在曝光初期快速增加，然后缓慢增加，最后趋于均衡值。符合这类模型的组织包括胆囊、肝脏、心脏、肾脏和肠道；第二类(II类)模型:其含量在暴露初期缓慢增加，随后相对快速增加，直至达到相对平衡值，存在于鱼鳔、脊髓、鳃、肌肉和脑组织中。

为了更准确地预测含量的变化，对蓄积过程进行拟合。对于I类模型，这个过程可以近似用指数增长函数来描述，PFOA的强度(I

I

图2绘制了心脏公式(1)的典型拟合曲线。与上述模型不同的是，II类模型符合s型增长函数，PFOA的强度(I

I

图3绘制了脑公式(2)的典型拟合曲线。

5、通过“暴露曲线”确定暴露程度

根据上述两类拟合曲线的比值定义了一种新的特征“暴露曲线”(图4)。本实施例中，以心脏和脑为例，将得到的“暴露曲线”以顶点和平衡点为边界分为三个部分，分别定义为轻度污染期、中度污染期和深度污染期。在到达暴露曲线顶点之前，I类组织的含量增长迅速，II类组织的含量增长缓慢，这使得它们的比值不断上升。而在顶点之后和平衡点之前，两类组织的蓄积趋势相反，使得暴露曲线呈现不断下降的趋势。在平衡点之后，比值几乎是一个定值。“暴露曲线”最重要的意义是通过比值在一段时间内的变化趋势来确定鱼类所处的污染阶段。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。