基因改造植物对室内空气污染物的降解

摘要

公开了能够降低发达国家城市家庭室内空气中挥发性有机致癌化合物诸如甲醛、苯和氯仿水平的基因改造室内植物。该植物表达解毒转基因哺乳动物细胞色素P450 2e，并且显示出充分的对苯和氯仿的解毒活性。还公开了利用该植物的空气净化生物过滤器及其用途。

说明书

技术领域

本发明涉及能够从室内空气中去除挥发性有机致癌物(VOC)的转基因室内植物和包括此类转基因植物的生物过滤器。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年1月15日提交的美国临时专利申请号62/792,726的权益，其通过引用以其全文并入本文。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称是70586_Seq_Final_2019-12-16.txt。文本文件为6.92KB；创建于2019年12月16日；并且正在通过EFS-Web随说明书一起提交。

政府许可权声明

本发明是在由美国国家科学基金会授予的CBET-1438266和美国国家环境健康科学研究所资助号2P42-ES004696-19的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

家庭空气比办公室空气和学校空气污染更严重，而那些大部分时间都在家里的人，诸如儿童和在家工作的人，接受的家庭致癌物剂量按比例高于一般人群。婴儿由于体重较轻且持续暴露在室内空气中，因此特别容易受到室内空气污染的影响。风险最高的挥发性有机致癌物(VOC)是苯、甲醛、1,3-丁二烯、四氯化碳、乙醛、1,4-二氯苯(PDCB)、萘、全氯乙烯、氯仿和二氯化乙烯。超过急性暴露标准的VOC是丙烯醛和甲醛(在烹饪过程中)以及氯仿(在淋浴过程中)。

这些化学品的一些来源可以被消除或减少。例如，可以通过从家中消除含有它的产品来极大减少PDCB。家庭空气中的甲醛可以通过改变建筑和室内装潢材料的成分来减少，但甲醛也会从其他来源(包括烹饪)排放，这些来源不容易被消除。其他具有多种来源的致癌物更难消除，诸如苯，它来源于储存在附属车库中的燃料、室外空气和环境烟草烟雾。

VOC去除的物理化学方法包括吸附在活性炭、活性氧化铝、沸石或其他表面上以及光催化氧化。吸附方法不太适合甲醛和其他极性化合物。低分子量化合物可能在与较高分子量污染物的竞争中解吸。吸附方法不具有破坏性，并且吸附剂必须定期再生，通常使用能源密集型方法远程再生。低温原位方法实现了节能再生，但需要外部管道。氧化方法使用光催化氧化还原破坏催化材料(诸如TiO

室内植物被广泛吹捧为能够从室内空气中去除空气污染物。这种方法被称为“绿色肝脏”概念，是植物修复领域的中心思想，植物修复是利用植物去除环境中的异生物污染物。对家庭植物空气解毒的早期研究发现，甲醛从含有吊兰的房间的空气中被去除。其他研究人员报告仅土壤或水就可以解释这种去除。随后，对照纯培养植物实验表明，植物可以从空气中吸收和代谢甲醛。然而，通过典型室内植物叶面的甲醛吸收率似乎不足以从没有过多植物的典型房间中去除甲醛。几项研究发现，普通植物可以去除空气中的VOC(诸如甲醛和苯)，但这些研究对特定植物物种从空气中去除既定污染物的速率得出高度可变的估计值。这些测试中使用的浓度比典型的家庭空气浓度高数个数量级(例如，1-7μg m

尽管存在这些相互矛盾的数据，但植物作为有机污染物代谢的平台确实具有许多吸引人的特征。与大多数细菌不同，栽培植物有过量的能量来支持共代谢催化。植物具有高表面积，可促进微量气体从空气传质。植物是自我维持的，不需要细菌系统典型的高维护。与土壤细菌群落相比，栽培植物的遗传和酶组成是确定的。

植物经基因改造以过表达天然植物甲醛脱氢酶活性，但甲醛去除率仅比未改造植物提高25％。来自短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)的甲醛脱氢酶faldh转基因在转化的烟草植物中的表达使甲醛去除增加了三倍。然而，迄今为止，尚未在室内植物中表达解毒基因。

因此，需要可以作为室内植物在室内生长并通过代谢VOC对室内空气进行有效植物修复的植物。

发明内容

提供本发明内容以简化形式呈现概念的选择，其将在以下具体实施方式中进一步描述。本发明内容不旨在确定要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定要求保护的主题的范围。

在一些实施方案中，表达盒进一步包括编码视觉选择标记的第二多核苷酸序列、编码阳性选择标记的第三多核苷酸序列、编码醛脱氢酶的第四多核苷酸、或其组合。在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四多核苷酸序列中的每一个与在转基因室内植物中有功能的合适启动子可操作地连接。

在一些实施例中，转基因室内植物是转基因绿萝(Epipremnum aureum)。

在一些实施方案中，哺乳动物细胞色素蛋白是细胞色素P450或其变体或与其具有至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物，诸如兔细胞色素P450 2E1色素P450 2E1或其变体或与其具有至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。

在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四多核苷酸序列中的每一个针对植物(例如，单子叶植物)进行密码子优化。

在一些实施方案中，视觉选择标记是荧光蛋白，诸如mGFP-ER、eGFP、或其变体或与其具有至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。在一些实施方案中，阳性选择标记是潮霉素B磷酸转移酶或其变体或与其具有至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。在一些实施方案中，第四多核苷酸序列编码醛脱氢酶诸如甲醛脱氢酶或其变体或与其具有至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。

在一些实施方案中，转基因室内植物能够去除选自由以下项组成的组的挥发性有机化合物：1,4-二氯苯、苯、1,3-丁二烯、甲醛、乙醛、萘、丙烯腈、四氯化碳、二氯溴甲烷、二溴氯甲烷、溴仿、三氯乙烯、氯乙烯、甲基氯仿、顺-1,2-二氯乙烯、氯仿及其组合。

在第二方面，本文年提供了一种植物修复方法，包括将本文公开的转基因室内植物与包括挥发性有机化合物蒸气的空气接触，从而使挥发性有机化合物从空气中去除。在一些实施方案中，将包括挥发性有机化合物(VOC)蒸气的空气与本文公开的转基因室内植物接触导致空气中VOC浓度降低。

在第三方面，本文提供了一种空气净化生物过滤器，包括一种或更多种本文公开的转基因室内植物。在一些实施方案中，空气净化生物过滤器包括：(a)种植结构，其包括一种或更多种本文公开的转基因室内植物，和(b)空气流动设备，其与该种植结构联接并且适于保持植物周围的空气流量。在一些实施方案中，该种植结构是绿墙。在一些实施方案中，空气净化生物过滤器系统进一步包括围绕一种或更多种转基因室内植物的外壳。在一些实施方案中，空气净化生物过滤器进一步包括用于自灌溉的装置、光源或其组合。

附图说明

本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易理解，因为当结合附图时，通过参考以下详细描述可以更好地理解这些优点，其中：

图1显示了用于转化绿萝(pothos ivy)的双元载体pRCS2-2E1-EGFP的结构。在该图中，T35s是CaMV 35s基因的终止子；hpt是潮霉素磷酸转移酶基因，提供潮霉素抗性；OsActin是稻(Oryza sativa)肌动蛋白基因的启动子；Tmas是manopine合酶基因的终止子；2e1是兔细胞色素P450 2E1基因；ZmUbi是玉米(Zea mays)泛素的启动子；PvUbi是柳枝稷(Panicum virgatum，柳枝稷)泛素基因的启动子；egfp是增强型绿色荧光蛋白；Trbc是rubisco小亚基基因的终止子；LB是T-DNA区的左边界；RB是T-DNA区的右边界。

图2A-2D显示了绿萝通过农杆菌(Agrobacterium)感染用2e1基因转化。绿萝叶盘和叶柄片段用带有pRCS2-2E1-EGFP的EHA105感染。外植体在含20mg L

图3是使用定量RT PCR测量用2e1和egfp基因转化的绿萝株系上的转录物丰度图。y轴显示归一化为绿萝5.8s rRNA基因和相对于VD1水平的值(n＝3±SE)。字母表示不具有显著差异的含义(p＝0.05，ANOVA)。

图4A和4B显示了使用荧光显微镜观察绿萝克隆VD3的表皮细胞中的EGFP信号。在绿萝克隆VD3(4A)的叶表皮细胞的细胞质中观察到EGFP绿色荧光信号。野生型绿萝(4B)的发射光是由于自发荧光。

图5是在液体培养中生长的2e1-egfp转化的绿萝对苯的吸收图。显示了VD3(2e1)、野生型植物(WT)和无植物对照(NPC)8天培养期间的顶空苯浓度。N＝4。平均值±SE。

图6是在液体培养中生长的2e1-egfp转化的绿萝对氯仿的吸收图。显示了VD3、野生型植物(WT)和无植物对照(NPC)11天培养期间的顶空氯仿浓度。N＝4±SE。

图7是绿萝转基因克隆VD3分批培养中苯浓度时程的半对数图。R

图8是野生型绿萝分批培养中苯浓度时程的半对数图。R

图9是绿萝转基因克隆VD3分批培养中氯仿浓度时程的半对数图。R

图10是野生型绿萝分批培养中氯仿浓度时程的半对数图。R

图11显示了用于制备示例性转基因室内植物的示例性哺乳动物细胞色素的序列(SEQ ID NO:15)。

图12是示例性空气净化生物过滤器的照片。

图13显示了编码可用于制备示例性转基因室内植物的示例性FALDH的序列(SEQID NO:16)。

图14显示了示例性FALDH蛋白的序列(SEQ ID NO:18)。

图15显示了编码可用于制备示例性转基因室内植物的示例性ALDH1a1的序列(SEQID NO:16)。

图16显示了示例性ALDH1a1蛋白的序列(SEQ ID NO:18)。

具体实施方式

本公开内容涉及基因改造的室内植物、室内植物部分和室内植物细胞以及它们在挥发性有机致癌物(VOC)的生物修复中的用途。一方面，本文提供了基因改造的室内植物，即转基因室内植物，能够降低周围空气中VOC(诸如甲醛、苯和氯仿)的水平。该植物表达解毒转基因，例如，哺乳动物细胞色素P450 2e，并且对挥发性有机致癌物(诸如苯和氯仿)具有足够的解毒活性。

在一些实施方案中，本文公开的转基因室内植物用包括编码哺乳动物细胞色素蛋白的第一多核苷酸序列的表达盒稳定转化，其中该室内植物能够从空气中去除挥发性有机化合物，诸如致癌物。如本文所用，术语“基因改造的”和“转基因的”可互换使用。在一些实施方案中，哺乳动物细胞色素蛋白是细胞色素P450，其变体，或与其具有至少约80％、至少约85％、或至少约90％的氨基酸序列同源性的同源物。在某些实施方案中，哺乳动物细胞色素蛋白是细胞色素P450 2E1。

哺乳动物细胞色素P450 2E1(在本文中也称为2E1)可以氧化可在典型家庭空气中发现的广泛的重要VOC，诸如苯、氯仿、三氯乙烯和四氯化碳。CYP2e1(2e1)基因先前已成功引入树木，但尚未提出对室内植物进行此类改造。任何哺乳动物细胞色素P450 2E1均可用于产生本文公开的室内植物，例如，兔细胞色素P450 2E1。在一些实施方案中，哺乳动物细胞色素具有如图11所示的序列，其变体，或与其具有至少约80％、至少约85％、或至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。在一些实施方案中，哺乳动物细胞色素包括SEQ IDNO:15，其变体，或与其具有至少约80％、至少约85％、或至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。

在一些实施方案中，编码哺乳动物细胞色素蛋白(例如，兔细胞色素P450 2E1)的多核苷酸序列针对植物进行密码子优化。在某些实施方案中，编码哺乳动物细胞色素蛋白的多核苷酸序列针对单子叶植物进行密码子优化。在一些实施方案中，编码哺乳动物细胞色素的第一多核苷酸序列与在室内植物中有功能的第一启动子可操作地连接。在本文公开的室内植物中有功能的任何合适的启动子可用于本文公开的转基因室内植物。在一些实施方案中，第一启动子是在绿萝(Epipremnum aureum)中有功能的启动子。在某些实施方案中，第一启动子是Zhao等人(Zhao,J.T.；Li,Z.J.T.；Cui,J.；Henny,R.J.；Gray,D.J.；Xie,J.H.；Chen,J.J.,Efficient somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediatedtransformation of pothos(Epipremnum aureum)'Jade'.Plant Cell Tiss Org 2013,114,(2),237-247)公开的启动子，其通过引用并入本文。适合包括在本文公开的转基因室内植物的表达盒中的示例性启动子在以下实施例中描述。

在一些实施方案中，室内植物是绿萝(Epipremnum aureum)，通常称为绿萝(pothos ivy)。它的其他常见名称包括石柑(pothos)、魔鬼常春藤(devil's ivy)和杂色蔓藤(variegated philodendron)。绿萝提供了优于其他室内植物或用于产生本文公开的转基因室内植物的其他植物的几个优点：它茁壮易活，在弱光下生长良好，并且在美国或加拿大的室内栽培或室外不开花，这是关于转基因植物释放到环境中的生物安全考虑方面的优势。

在本文公开的转基因室内植物、室内植物部分和室内植物细胞的一些实施方案中，表达盒进一步包括编码视觉选择标记的第二多核苷酸序列。可以使用任何合适的视觉选择标记。在某些实施方案中，视觉选择标记是荧光蛋白。适合包括作为视觉标记物的示例性荧光蛋白包括绿色荧光蛋白，诸如mGFP-ER和eGFP，其变体，和与其具有至少约80％、至少约85％、或至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。

包括视觉选择标记实现将植物与野生型区分，从而通过观察标记的独特荧光特征来提供额外的生物安全保证。可以使用任何合适的可视化方法。例如，本文公开的转基因植物可以通过简单的视觉观察或通过使用检测设备进行监测。用于检测和定量植物中的视觉标记(诸如荧光蛋白)的仪器和方法是本领域已知的，例如，Reginald J.Millwood,HongS.Moon,and C.Neal Stewart Jr.Fluorescent Proteins in Transgenic Plants,Reviews in Fluorescence,387-403(2008)中公开的仪器和方法，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，编码视觉标记(例如，绿色荧光蛋白)的多核苷酸序列针对植物进行密码子优化。在某些实施方案中，编码视觉标记的第二多核苷酸序列针对单子叶植物进行密码子优化。在一些实施方案中，第二多核苷酸序列与在室内植物中有功能的第二启动子可操作地连接。在本文公开的室内植物中有功能的任何合适的启动子(诸如上述那些)可用于本文公开的转基因室内植物。

在某些实施方案中，表达盒进一步包括编码阳性选择标记的第三多核苷酸序列。阳性选择标记是赋予对杀死野生型室内植物的药剂抗性的基因。可以使用任何合适的阳性选择标记。例如，在某些实施方案中，阳性选择标记是赋予室内植物抗生素抗性的蛋白。在某些实施方案中，阳性选择标记是潮霉素B磷酸转移酶，其赋予室内植物(例如，绿萝)对潮霉素的抗性。在其他实施方案中，阳性选择标记是赋予对除草剂抗性的基因，例如，hompsonCJ,Movva NR,Tizard R,et al.Characterization of the herbicide-resistance genebar from Streptomyces hygroscopicus.EMBO J.1987；6(9):2519-23中所述的基因，其公开内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，编码阳性选择标记(例如，潮霉素B磷酸转移酶)的多核苷酸序列针对植物(例如，单子叶植物)进行密码子优化。在一些实施方案中，第三多核苷酸序列与在室内植物中有功能的第三启动子(诸如上述启动子)可操作地连接。

在一些实施方案中，具有表达能够从家庭空气中去除VOC的多于一种解毒酶的转基因室内植物是有利的，例如，用于去除多于一种化学类别的VOC。因此，在一些实施方案中，本文所述的转基因室内植物表达哺乳动物细胞色素(诸如2e1)和一种或更多种其他解毒基因。例如，如以下实施例中所述，faldh基因可以与2e1和/或其他解毒基因在载体中叠加，该载体用于对室内植物(诸如绿萝)进行基因改造，从而产生可以降解最重要的室内空气VOC之一的甲醛的室内植物。因此，在本文公开的转基因室内植物、室内植物部分或室内植物细胞的某些实施方案中，表达盒进一步包括编码甲醛脱氢酶的第四多核苷酸序列，其变体，或与其具有至少约80％、至少约85％、或至少约90％氨基酸序列同源性的其同源物。在一些实施方案中，第四多核苷酸序列与在室内植物中有功能的第四启动子可操作地连接。在本文公开的室内植物中有功能的任何合适的启动子(诸如上述那些启动子)可用于本文公开的转基因室内植物。

在一些实施方案中，本文提供了用表达盒稳定转化的室内植物细胞或室内植物部分，该表达盒包括编码哺乳动物细胞色素蛋白的第一多核苷酸序列和编码视觉选择标记的第二多核苷酸序列，该第一多核苷酸序列与在室内植物中有功能的第一启动子可操作地连接，该第二多核苷酸序列与在室内植物中有功能的第二启动子可操作地连接。

在又一方面，本文公开了一种植物修复方法，包括将本公开内容的转基因室内植物与包括挥发性有机化合物蒸气或挥发性有机致癌物质蒸气的空气接触，从而导致挥发性有机化合物从空气中去除。在某些实施方案中，空气是室内空气，诸如家庭空气。

在一些实施方案中，本文公开的转基因室内植物可以去除或降低空气中可被哺乳动物细胞色素氧化的任何挥发性有机致癌物或挥发性有机化合物(VOC)的浓度。如本文所用，术语“去除”污染物(诸如VOC)包括部分去除，例如，浓度降低，和完全去除，例如，低于通常用于分析此类VOC的方法可检测的水平。在一些实施方案中，适合使用本文公开的方法去除的VOC包括芳族化合物、不饱和烃、酮、醛和卤代烃。此类VOC的非限制性实例包括1,4-二氯苯、苯、1,3-丁二烯、乙醛、萘、丙烯腈、四氯化碳、二氯溴甲烷、二溴氯甲烷、溴仿、三氯乙烯、氯乙烯、甲基氯仿、顺-1,2-二氯乙烯、氯仿及其组合。

在又一实施方案中，本文提供了一种空气净化生物过滤器，包括一种或更多种本公开内容的转基因室内植物，例如，用包括编码上述哺乳动物细胞色素的多核苷酸序列的表达盒稳定转化的转基因室内植物。在一些实施方案中，转基因植物是用包括编码上述哺乳动物细胞色素的多核苷酸序列的表达盒稳定转化的绿萝。

为了最大化本文公开的转基因室内植物的植物修复潜力，在一些实施方案中，有利的是构建或增加转基因室内植物周围的空气质量传递，例如，在本文公开的室内植物的叶面上方移动空气。在某些实施方案中，空气净化生物过滤器进一步包括用于增加转基因室内植物叶面上方的质量空气流量的装置，即空气流动设备。在一些实施方案中，空气净化生物过滤器包括：(a)植物容器，其包括一种或更多种本文公开的转基因室内植物，和(2)空气流动设备，其与植物容器联接并且适于保持植物周围的空气流量。

在本文公开的空气净化单元或生物过滤器中可以包括用于增加质量空气流量的任何合适的装置，其包括机械装置(诸如通过操作电动或手动风扇)。在一些实施方案中，该装置可以产生压力或温度差，并且空气流量的增加可以被动地发生，例如，作为转基因室内植物周围环境中存在的压力差或温度梯度的函数。

在一些实施方案中，空气净化单元包括容纳一种或更多种转基因室内植物的外壳。在一些实施方案中，空气净化单元是绿墙，其包括一种或更多种本公开内容的转基因室内植物和用于增加一种或更多种植物周围质量空气流量的装置。在一些实施方案中，绿墙是有目的地被植被覆盖的垂直建筑结构，并且也可以被称为活墙或垂直花园。

在一些实施方案中，生物过滤器符合家用电器制造商协会(AHAM)使用的标准，例如，微粒生物过滤器的评级标准或“2/3规则”：即假设天花板为8ft，清洁空气输送速率(CADR、ft

因此，在一些实施方案中，本文公开的生物过滤器能够使房间中的微粒减少约75％或更多、约80％或更多、约85％或更多、或约90％或更多，该房间每小时与外部空间的交换等于一个房间体积的空气变化。在一些实施方案中，在通过空气净化生物过滤器的过程中，基本上所有平均尺寸为2μm或更大的颗粒被从空气中去除。

提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。

从零售园艺商店获得的黄金葛(Golden pothos ivy)植物在50μE m

为了对绿萝进行基因改造，构建含有转基因2e1、egfp和hpt的基因载体，每个基因的侧翼有适合绿萝的启动子和终止子序列。hpt基因编码潮霉素B磷酸转移酶，其赋予潮霉素抗性。潮霉素用于选择转化细胞，因为它杀死野生型绿萝。这三个基因被整合到基于含有与特定限制酶一起使用的插入位点的被称为pSAT的克隆载体系统的转化载体(“双元载体”)中(Chung,S.M.；Frankman,E.L.；Tzfira,T.,A versatile vector system formultiple gene expression in plants.Trends in Plant Science 2005,10,(8),357-361)。然后将双元载体引入改造的农杆菌菌株EHA105，用于感染绿萝愈伤组织培养物。

兔细胞色素P450 2e1基因从质粒pSLD50-6(引物序列，SEQ ID NO 1-14在表1中列出)通过聚合酶链反应(PCR)扩增，该质粒由S.L.Doty(华盛顿大学)馈赠并经限制酶HindIII和KpnI双重消化。

表S1.用于制备示例性载体的引物的DNA序列

然后将2e1 DNA插入克隆载体pNSAT3a以产生pNSAT3a-2E1。插入pNSAT3a后，2e1基因被整合到启动子和终止子序列之间，以产生驱动2e1在植物细胞中的表达的表达盒。egfp基因通过PCR从载体pGH00.0126克隆(如Maximova,S.et al.,Stable transformation ofTheobroma cacao L.and influence of matrix attachment regions on GFPexpression.Plant Cell Rep 2003,21,(9),872-83所述)并以HindIII-PstI片段插入pNSAT6a以产生pNSAT6a-EGFP。hpt、2e1和egfp基因的表达盒分别使用限制酶AscI、I-PpoI和PI-PspI从pNSAT1a-HPT切下(如Zhang,L.；et al.,Expression in grasses ofmultiple transgenes for degradation of munitions compounds on live-firetraining ranges.Plant Biotechnol J 2017,15,(5),624-633所述)、pNSAT3a-2E1和pNSAT6a-EGFP载体切下并插入pRCS2双元载体中以产生pRCS2-2E1-EGFP。

通过冻融方法将双元载体pRCS2-2E1-EGFP转移到农杆菌菌株EHA105中(Chen,H.；Nelson,R.S.；Sherwood,J.L.,Enhanced recovery of transformants of Agrobacteriumtumefaciens after freeze-thaw transformation and drug selection.Biotechniques1994,16,(4),664-8,670)，并且所得菌株EHA105(pRCS2-2E1-EGFP)在含有50mg L

以下用于转化绿萝的方法改编自Zhao等人(Zhao,J.T.,et al.,Efficientsomatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation of pothos(Epipremnum aureum)'Jade'.Plant Cell Tissue and Organ Culture,2013.114(2):p.237-247)。将来自无菌绿萝植物的叶盘和叶柄段在25℃下浸入农杆菌培养物中20分钟，然后转移到在培养皿中用含有100μM AS的液体E培养基润湿的双层滤纸上，在25℃下共培养5天。叶盘和叶柄片段用无菌水洗涤，并转移到含有100mg L

选择2-3个月后，将在选择培养基上从外植体发育的体细胞胚转移到新鲜培养基中再培养一个月，然后转移到含有100mg L

对于聚合酶链反应(PCR)分析，使用DNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)从潮霉素抗性植物中纯化DNA。PCR反应使用2e1和egfp盒特异的引物进行(如表1所示)。

使用RNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)从植物的叶子中提取总RNA。对于实时定量RT-PCR分析，使用M-MLV逆转录酶(Promega，Madison，WI，USA)将1μg总RNA转录为cDNA。使用SensiFAST SYBR No-ROX试剂盒(Bioline，Memphis，TN，USA)在荧光热循环仪Light Cycler(Roche)上进行实时定量PCR，并使用Light Cycler 3软件(Roche)分析数据。标准曲线由prcs2-2e1-egfp的质粒DNA构建。使用RT-qPCR测量的转录物值被归一化为绿萝5.8S基因，并相对于克隆VD1中的转录物水平呈现。

将绿萝(1g)的无菌幼苗在用隔膜阀(

使用气密玻璃注射器将苯气体注入小瓶中，以达到1850±160mg m

类似地，使用气密玻璃注射器将氯仿从氯仿的密封水性稀释液(Acros Organics，423550010)中引入VOA小瓶中。转化的幼苗、野生型(WT)和无植物对照重复四份培养，并且取出顶空样品用于通过带有电子捕获检测器(GC-ECD)(Perkin Elmer AutoSystem XL)和VOCOL毛细管柱60m×0.53mm(Sigma)的气相色谱分析氯仿水平。色谱参数是：检测器温度为325℃，氮气载气为1.76ml min

使用LSM 5PASCAL系统(ZEISS)通过荧光显微镜观察绿萝叶表皮细胞的EGFP信号。EGFP信号由蓝光激发，并使用FITI滤光片采集荧光。使用Axiocam 503单目相机和软件ZEN2.3lite拍摄图片。

使用Microsoft Excel软件(Microsoft Excel 2016MSO)中的ANOVA分析数据的统计显著性。当ANOVA分析得出显著差异时，进行Fisher最小显著差异(LSD)方法来比较平均值。具有统计显著差异的分组(p＜0.05)在图中用字母标记。

本公开内容的生物过滤器按照AHAM使用的用于微粒生物过滤器评级的标准(2/3规则)设计：即，假设天花板为8ft，清洁空气输送速率(CADR、ft

为了计算GM植物生物过滤器的尺寸和运行参数，使用一级模型，该模型假设污染物去除率是污染物浓度的函数。该模型的推导如下。整个生物过滤器的质量平衡可以表示为

QC

其中Sink表示生物过滤器中污染物去除率，μg h

Q＝通过生物过滤器的空气流量，m

C

C

假设污染物的去除与污染物浓度有关，与植物生物量成正比，并且生物过滤器完全混合，生物过滤器中的浓度等于流出物浓度。

Sink＝V

V

K＝一级动力学速率常数，h

M

因此，

Q(C

定义

E＝一次通过生物过滤器的去除效率，

因此，本公开内容的转基因植物诸如示例性绿萝克隆vD3对苯和氯仿的吸收的分批实验中浓度时程呈指数分布。

在生物过滤器尺寸计算中，选择氯仿而不是苯的吸收，因为苯被2E1氧化成苯酚，苯酚在这些实验所用的浓度下可能对植物有毒。氯仿几乎立即被氧化成无毒产物CO

转化绿萝中2e1基因表达的水平不依赖于苯或氯仿浓度。因此，污染物降解的动力学参数预期随污染物浓度保持不变。

污染物吸收速率在含有重约1g的植物的40mL小瓶中测定。VD3绿萝吸收氯仿的一级速率如表2所示。这些速率用于示例性生物过滤器设计。这是一种保守假设，因为由于生物过滤器中的对流和湍流，强制空气生物过滤器的吸收速率可能大于40mL小瓶中的吸收速率。示例性绿萝VD3去除氯仿的一级速率常数为0.522d

表2.基因改造和野生型绿萝植物吸收氯仿的一级动力学常数归一化为植物生物量和叶面积

*野生型氯仿吸收时程的半对数图的斜率较零线无显著差异(p＝0.22)。

如果选择生物过滤器的空气流速等于1150cfm(333m

绿萝每g生物量的叶面积约为29cm

用于转化绿萝的质粒pRCS2-2E1-EGFP的结构如图1所示。为了实现恒定、高水平的表达，所有转基因均由组成型单子叶植物启动子驱动。潮霉素抗性基因hpt由水稻(Oryzasativa)的肌动蛋白启动子驱动(McElroy,D.et al,Isolation of an efficient actinpromoter for use in rice transformation.The Plant cell 1990,2,(2),163-71)，2e1基因由玉米(Zea mays)的泛素启动子驱动(Cornejo,M.J.；et al.,Activity of a maizeubiquitin promoter in transgenic rice.Plant molecular biology 1993,23,(3),567-81)，并且egfp基因由柳枝稷(Panicum virgatum)的泛素启动子驱动(Mann,D.G.；etal.,Gateway-compatible vectors for high-throughput gene functional analysisin switchgrass(Panicum virgatum L.)and other monocot species.Plantbiotechnology journal 2012,10,(2),226-36)。

用含有载体pRCS2-2E1-EGFP的EHA105感染绿萝的外植体，然后在以潮霉素为选择剂的愈伤组织诱导培养基上筛选2-3个月。从叶盘和叶柄片段的切割边缘发育的头状体细胞胚胎(图2A)。在随后的培养过程中，愈伤组织在基部形成，并且从愈伤组织发育出更多簇状体细胞胚。培养3-4个月后，将潮霉素抗性愈伤组织转移至再生培养基以诱导幼苗。再培养2-3个月后，从体细胞胚发育出具有芽和根的幼苗。一些幼苗仅发育出嫩枝(图2B)。这些植物被转移到含有潮霉素的MS培养基中，以进一步生长和生根(图2C)。PCR和RT-qPCR阳性株系的叶盘在含有15mg L

通过退火至2e1和egfp盒的启动子和终止子区的引物对引发的PCR确认靶基因整合至绿萝的基因组中(数据未显示)。为了测量2e1和egfp基因的转录丰度，对八个转基因株系VD1-VD8进行RT-qPCR。egfp的表达水平低于2e1，并且分为两组，VD3和VD2或VD7之间存在显著差异(p＜0.01，图3)。2e1基因在不同转化株系之间的表达水平具有显著差异(p＝0.00001)。与其他株系相比，克隆株系VD3、VD7和VD8具有更高的2e1表达水平。与野生型相比，无转化的克隆株系在形态或生长方面具有可观察到的变化。

使用荧光显微镜，由于绿萝叶的表皮细胞中存在液泡，在质膜附近和细胞核周围观察到EGFP荧光(图4A)。发射光略大于野生型的发射光，但较弱。野生型细胞一般是微弱的自发荧光，但不是特定来自细胞质。在手持UV灯照射下，在转化的绿萝中无肉眼可见的绿色荧光。

为了确定2e1-egfp转化的绿萝吸收苯的能力，将植物在封闭的小瓶中与VOC一起培养。将苯(144μg)注入含有转化的和野生型绿萝的40mL VOA小瓶中，以达到2500mg m

将具有示例性转化绿萝VD3的小瓶中苯浓度的时程以半对数轴绘制，并通过线性回归拟合，一级速率常数等于(-0.249d

与示例性VD3植物培养的小瓶顶空中的氯仿浓度迅速下降，而与野生型幼苗和无植物对照培养的氯仿浓度没有显著变化(图6)。在含有示例性克隆VD3植物的小瓶中，氯仿浓度在前3天降低82％，并且在6天后未检出氯仿。氯仿数据的半对数图的线性回归产生等于-0.549d

室内空气中的VOC给弱势群体(诸如儿童)带来重大的癌症风险，但目前尚无实用的、可持续的技术可用于在家中将其去除。基于吸附剂和氧化方法的物理化学方法是能源密集型的，并且分别用于去除甲醛和氯仿的用途有限。各种室内植物被吹捧为具有从空气中去除VOC的能力，但植物吸收速率在一项研究与另一项研究之间呈指数变化。许多研究似乎受到高VOC浓度人为增强土壤细菌活动的影响。在本文中，在苯的情况下，通过将顶空样品手动注射到GC-FID上，使用高VOC浓度来促进分析，但测定在无菌条件下进行，没有细菌活性。从图5和图6中可以看出，含有野生型绿萝的小瓶中苯或氯仿的损失很少或没有损失，而具有表达2E1的示例性克隆VD3的小瓶中的大部分苯和所有氯仿在6天内被去除。这些结果表明，与野生型绿萝相比，基因改造绿萝具有去除VOC的有效性。

绿色荧光蛋白的表达旨在作为绿萝被转化的视觉指示，但转化的克隆VD3的荧光太弱，没有显微镜就无法看到。GFP的其他变体，诸如mGFP-ER和使用更强的单子叶植物启动子可以提供更强的荧光。

可以通过组合表达2e1与其他解毒基因来使本文所述的转基因室内植物从家庭空气中去除VOC。甲醛，另一种在家庭空气中构成最大风险的VOC，是最受关注的。烟草中短芽孢杆菌的faldh基因的过表达赋予植物对HCHO具有高耐受性，并提高吸收甲醛的能力比野生型植物快2-3倍。faldh基因可以与2e1和其他解毒基因在载体中叠加，用于对绿藤进行基因改造，从而产生可以降解大部分重要室内空气VOC的植物。因此，在本文公开的转基因室内植物的某些实施方案中，表达盒进一步包括编码醛脱氢酶(ALDH)(诸如FALDH或ALDH1a1)的多核苷酸序列。

因此，在一些实施方案中，本文公开的转基因室内植物包括多核苷酸序列SEQ IDNO:16或18。在一些实施方案中，醛脱氢酶包括SEQ ID NO:17或19的肽序列。

由于转化绿萝中的2e1基因表达是在组成型启动子下，2E1的表达水平不依赖于苯或氯仿浓度。因此，污染物降解的动力学参数预期岁污染物浓度保持不变。

封闭的强制空气生物过滤器的性能使用与氯仿分批实验中观察到的相同一级降解常数0.52d

与目前从室内空气中去除VOC的化学/物理方法相比，使用转基因植物的生物过滤器具有能耗低和维护需求低的优势。所有去除方法均需要使空气通过设备的装置，然而，与本文公开的生物过滤器不同，吸附方法需要大量能量消耗来再生介质，而光氧化方法需要高能量输入来氧化污染物，使得这些方法的可持续性较低。除了空气流动所需的能量外，转基因植物修复仅需要很少的额外能量。绿萝非常适合中等和低光照水平，因此通常不需要人工照明，使植物修复具有内在可持续性优势。

为方便起见，此处提供了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施方案，而不是为了限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。

权利要求和说明书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。

除非特别指出，否则在权利要求或说明书中与用语“包括”结合使用时，用语“a”和“an”表示一个或更多个。

除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求中，用语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”等应被解释为开放式和包含的含义，而不是封闭式、排他的或穷尽的含义。例如，术语“包括”可以被理解为表示“包括但不限于”。术语“基本上由……组成”或其语法变体表示所引用的主题可以包括权利要求中未引用的另外元素，但这些元素未实质上影响所要求主题的基本且新颖的特征。

如本文所用，用语“约”表示在所述参考数值之上或之下的微小变化范围内的数字。例如，“约”可以指在指定参考数值之上或之下10％范围内的数值。如本文所用，“植物部分”是指保留亲本植物的区别特征的组织、器官、种子和切断部分(例如，插条)。

尽管已经说明和描述了说明性实施方案，但是应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行各种变化。

序列表

<110> 华盛顿大学

L· 张

S·E·斯特兰德

<120> 基因改造植物对室内空气污染物的降解

<130> UWOTL-1-70586

<150> US 62/792,726

<151> 2019-01-15

<160> 15

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> 兔

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