一种促进肩袖腱骨愈合和抑制肌肉脂肪浸润的电纺膜支架及其制备方法

摘要

本发明提供了一种促进肩袖腱骨愈合和抑制肌肉脂肪浸润的电纺膜支架及其制备方法。该电纺膜支架的制备方法包括如下步骤：步骤一，将MSNs超声分散在乙醇中，加入三乙氧基硅烷后搅拌，离心收集纳米颗粒，在硫酸中重分散，加热收集最终产物，洗涤，冷冻干燥，制得MSN‑COOH纳米颗粒；步骤二，将锂盐和MSN‑COOH加入去离子水中，搅拌，然后离心，去掉上清液；沉淀在真空下干燥40‑50h，得到Li+@MSNs；步骤三，将高分子材料和Li+@MSNs溶解在HFIP中，搅拌制得均一溶液，接着采用静电纺丝技术制备成单根纤维呈“豇豆样”结构的电纺膜支架。该电纺膜支架可以促进肩袖腱骨界面的骨愈合及抑制肩袖肌肉的脂肪浸润，同时提供术后即刻力学支持作用，可为临床上修复陈旧性肩袖损伤提供新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及外科修复手术材料技术领域，具体涉及一种促进肩袖腱骨愈合和抑制肌肉脂肪浸润的电纺膜支架及其制备方法。

背景技术

肩袖撕裂是肌肉骨骼系统的常见问题。研究发现，这种疾病的患病率在15％到51％之间，在50岁以上的人群中发病率最高。修复后愈合不良通常会导致复发或其他不好的临床结果。这一领域的大多数研究都集中在骨-肌腱界面上，研究改变和加强骨-肌腱界面的方法，但是生理变化越来越引起人们的兴趣，包括肩袖撕裂后结构附着点处的肌肉、肌腱和骨骼的变化。特征性的退行性改变包括肌肉和肌肉细胞中的脂肪堆积、纤维化和肌肉萎缩、肌腱组织丢失和骨密度降低。特别是脂肪浸润和骨密度降低的问题，是通过肩袖修复手术进行解剖重建后恢复生理和生物力学功能的两个关键挑战。针对这些问题，研究人员提出了不同的生物材料来抑制脂肪浸润和促进骨再生。然而，由于脂肪和骨属于两个不同的谱系，没有一种单一的生物支架能够同时解决这两个问题。

锂，一种被批准用于人类的药物，已经成为双相情感障碍的一线治疗药物。研究表明，Li

导电生物材料对组织再生非常重要。豇豆(Vigna unguiculata)有一个长的条状外壳，类似于静电纺丝中的纤维结构，内部由均匀排列的种子组成。当种子被剥开时，它们起着孕育下一代的作用。受这些结构和功能特征的启发，本发明人在先设计了一种类似于“壳&籽”结构的电纺纤维和介孔二氧化硅纳米球的组合。介孔硅纳米颗粒(MSNs)是一种纳米材料，具有良好的生物相容性、高比表面积、孔结构、可调节的粒径和高载药量等优点。MSNs本身对宿主的影响或作用很小，但是，当对颗粒表面进行改性时，他们被认为是一种理想的载药工具。为了原位释放，优选与水凝胶或静电纺丝膜结合的MSNs。嵌段聚氨酯由于其灵活的力学特性、可加工性和良好的生物相容性，在各种应用中被用作弹性生物材料。以往的研究在多嵌段聚醚氨酯脲(PEUU)为电纺材料的血管组织工程的开发和应用方面取得了进展。

结合上述物质的特性，本发明拟提供一种持续释放锂离子的生物膜，能够通过单一介质时促进腱骨界面骨再生以及抑制肩袖肌肉组织的脂肪浸润，同时在术后即刻提供一定的力学支持作用。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种促进肩袖腱骨愈合和抑制肌肉脂肪浸润的电纺膜支架及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种促进肩袖腱骨愈合和抑制肌肉脂肪浸润的电纺膜支架的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，合成MSNs-COOH纳米颗粒：将MSNs超声分散在乙醇中，加入三乙氧基硅烷后搅拌，离心收集纳米颗粒，在硫酸中重分散，加热收集最终产物，洗涤，冷冻干燥，制得MSN-COOH纳米颗粒；

步骤二，制备Li

步骤三，制备电纺膜支架：将高分子材料和Li

进一步地，步骤一中加入三乙氧基硅烷后搅拌的时间为18-30h。

进一步地，步骤一中的加热温度为130-160℃，加热时间为2-6h。

进一步地，步骤一中采用的硫酸的浓度为40-60％v/v。

进一步地，MSNs通过以下方法进行合成制备：将NaOH溶液、十六烷基三甲基溴化铵和正硅酸乙酯缓慢依次加入水中搅拌，然后在80℃条件下大力搅拌10-20min；然后继续常规搅拌4-8h，用ddH

进一步地，步骤二中采用的锂盐为LiCl或LiNO

进一步地，步骤三中，高分子材料选自PEUU、PCL、PLA中的一种或多种。

进一步地，静电纺丝的参数为：进样速度为1.0-1.4mL/h，纺丝电压为15kV，接收装置距离注射器针头的距离为14厘米，电纺时间延长至20～24h。

本发明的第二方面是提供上述制备方法制备的电纺膜支架。

本发明的第三方面是提供上述电纺膜支架在制备肩袖补片中的应用。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明为实现兼具促进肩袖腱骨界面的骨愈合及抑制肩袖肌肉的脂肪浸润，同时提供术后即刻力学支持作用：1)首先对纳米级介孔硅表面进行羧基修饰，通过多孔结构及表面带负电荷的羧基对氯化锂或硝酸锂进行吸附；2)通过静电纺丝技术结合具一定机械强度的高分子材料，将搭载锂盐的介孔硅包裹于电纺丝内，利用该体系在肩袖修复环境中原位释放锂离子；3)为提供力学保护，适当提高电纺膜的厚度(可达0.05mm)，一方面便于术者将支架缝合于肩袖肱骨头复合体表面，另一方面也在术后即刻提供了一定的力学支撑。

附图说明

图1是本发明一实施例中制备电纺膜支架的工艺流程图；

图2显示了本发明一实施例中制备的电纺膜的纤维形态、FTIR光谱(图2e)和Li+释放曲线(图2f)；其中，图2a-d分别为MSNs-COOH、Li

图3显示了本发明一实施例中Li

图4显示了本发明一实施例中细胞在电纺膜上的增殖效果；其中，图4a为活细胞计数结果，图4b为CCK-8测试结果；图4c为活/死细胞染色结果的荧光图像；**P<0.01；***P<0.001；#表示相对于Li

图5显示了本发明一实施例中的肌肉油红染色结果，可见实验组脂肪浸润程度明显改善；其中，图5a为油红O染色率的统计结果；图5b显示了健康肩袖无脂肪浸润；图5c为油红O染色结果，分别显示无膜、或使用PEUU纳米纤维膜、Li

图6显示了本发明一实施例中MicroCT结果示大结节骨质修复情况；其中，图6a-b分别显示了骨密度和骨体积分数；图6c显示了Micro-CT图像；与纯缝合(Simple repair)组相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01,***表示p<0.001；与PEUU组相比，#表示p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001；与Li

具体实施方式

本发明提供了一种促进肩袖腱骨愈合和抑制肌肉脂肪浸润的电纺膜支架及其制备方法，该电纺膜支架的主要结构为电纺丝纤维内包裹的搭载锂盐的纳米介孔硅。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供一种兼具促进肩袖腱骨愈合和抑制肌肉脂肪浸润功能的电纺膜支架，其具体的制备方法包括如下步骤(参考图1)：

1.合成MSNs-COOH纳米颗粒

将1.75mL NaOH溶液(2M)、0.5g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，98％)和5mL正硅酸乙酯(TEOS，98％)缓慢依次加入240mL水中搅拌，然后在80℃条件下大力搅拌15min。然后继续常规搅拌6h，然后用ddH

将50mg的MSNs超声分散在50mL的乙醇中，加入25μL的三乙氧基硅烷，搅拌24h，离心收集纳米颗粒，在50％v/v的硫酸中重分散，150℃加热4h，收集最终产物，洗涤，冷冻干燥，制得的MSN-COOH纳米颗粒。

2.制得Li

将10mg LiCl和200mg MSN-COOH加入10mL去离子水中，搅拌6h，然后在10000rpm下离心，去掉上清液。沉淀在真空下干燥48h，得到Li

3.制备电纺膜支架

将764.8mg PEUU和235.2mg Li

验证实施例

在实施例1(Li

(1)使用场发射透射电子显微镜TEM(FEI，JEM-2100F，JEOL，日本)观察MSNs-COOH、Li

如图2a-d所示，Li

如图2e所示，与MSNs和PEUU纳米纤维的光谱相比，Li

(2)为了检测纳米纤维膜的Li

由图2f可知，对于Li

(3)体外成骨抑脂实验

在融合之前，3T3-L1细胞以2×10

如图3a-c可知，Li

(4)生物相容性检测

在使用纳米纤维膜培养1、3和5天后，用活/死细胞染色试剂盒观察与纤维膜一起培养的MC-3T3-E1细胞的活力并进行了CCK-8细胞增殖试验，结果如图4所示。

图4a中的活细胞计数显示，盖玻片、PEUU纳米纤维膜、Li

由上述结果可知，细胞在含锂电纺膜上增殖较好。

(5)体内实验

采用144只体重为300-400g的雄性Sprague-Dawley大鼠，首先从肱骨插入部位分离右侧冈上肌腱(SSP)，并用2-0T肌腱缝合线标记，以创建肩袖肌腱损伤模型。然后闭合切口，将受伤的SSP放在一边。在手术后的前三天，给大鼠喂食安乃近并用青霉素治疗。分离SSP 6周后建立慢性损伤模型。144只大鼠随机分为4组进行肩袖修复手术。四组分别为：i)单纯修复组；ii)使用纯PEUU纤维膜组进行维修；iii)使用Li

在显微CT观察后，将标本(每组4只大鼠，每个时间点)从肌腱-骨端的大结节处与肌腱分离，并制成冰冻切片进行油红O染色，结果如图5所示。在第2、4和8周，对每组8只大鼠实施安乐死，并对其进行显微CT图像分析和组织学评估。试样在4％多聚甲醛中制备48小时。通过micro CT(SkyScan 1176，Bruker，German)观察骨密度和骨愈合情况，尤其是在大结节的原始端(其中大结节的插入部位已圈出)。扫描条件设置为80kV，450mA。在使用定制的5×5mm

与健康肩袖(图5b)相比，所有组均呈现不同程度的脂肪浸润。与纯缝合组和PEUU纳米纤维膜组相比，在第4周和第8周，Li

Micro-CT分析显示，与其他组相比，使用Li

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。