一种无外源发光体的电致化学发光材料及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种无外源发光体的电致化学发光材料及其制备方法与应用，属于传感器材料技术领域。本发明在传统水热法的基础上，加入适当比例的乙二醇和尿素，合成了一种3D枝状TiO2纳米材料。通过该方法制备得到的3D枝状TiO2纳米材料具有巨大的表面积和边界空腔结构，可以实现金纳米颗粒的大量固载；还能够吸附溶液中的溶解氧(极大的增大了溶解氧对该反应体系ECL信号的增强效应)；同时3D枝状TiO2纳米材料作为过硫酸跟/单线态氧体系的共反应促进剂，极大的提高了过硫酸根体系的ECL信号，进一步提高了传感器的灵敏度。因此制备的3D枝状TiO2纳米材料，可以作为一种理想的固态发光平台，用于电致化学发光传感器界面的构建。

说明书

技术领域

本发明属于传感器技术领域，涉及一种无外源发光体的电致化学发光材料及其制备方法与应用。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)发病率在不断增高，死亡率整体呈上升趋势。急性心肌梗死(AMI) 导致死亡的主要原因之一是血栓的形成，形成的血栓阻止了血液循环到心脏，急性心肌梗死发作期间的死亡率非常高。在临床上，急性心肌梗死(AMI)生物标志物的检测比心电图更重要，是“液体活检”的首要方法。目前已发现心肌肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶mb等与急性心肌梗死(AMI)密切相关，其中心肌肌钙蛋白被认为是急性心肌梗死(AMI)的黄金标记，它不仅具有较高的特异性和敏感性，而且诊断窗口较长。因此需要实现心肌肌钙蛋白的灵敏检测，则能够提高早期AMI的检出率。

众所周知，荧光(PL)、表面等离子体共振(SPR)、电化学(EC)或电致化学发光(ECL)免疫传感器已被设计并用于cTnI的检测，其中ECL分析技术具有背景信号低、灵敏度高、线性范围宽、成本低等优点。ECL是电化学、化学发光、生物分析、微电子技术以及传感器技术相结合的最新产物。在电致化学发光生物传感器的应用中，提高ECL信号是提高传感器灵敏度的最佳手段之一。过硫酸根体系作为常见的ECL体系，根据过硫酸根体系ECL反应机理，溶解氧作为其共反应试剂，在检测底液中浓度较低，因此ECL信号较低。通常用作共反应试剂，故可以通过提升底液中溶解氧的浓度或者引入一种共反应促进剂，促使过硫酸根溶液产生很强的ECL信号。

纳米材料具有很好的生物相容性和导电性，近年来受到越来越多的关注。二氧化钛由于其宽带隙宽、环境友好和成本低，已被公认为光催化和传感应用最具发展前景的光电半导体材料之一。基于TiO

因此，需要在制备以后一种具有巨大的表面积和边界空腔结构的3D枝状TiO

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种3D枝状TiO

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种3D枝状TiO

(1)将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液加入到四异丙醇钛(TTIP)盐酸溶液中，搅拌形成透明的凝胶；

(2)将所述凝胶与乙二醇混合，加入尿素溶解后搅拌使其混合均匀；

(3)将步骤(2)中混合均匀的溶液置于高压反应釜中在150℃下反应20h，冷却后过滤得到沉淀；

(4)将步骤(3)中反应结束后得到的沉淀用乙醇和PBS缓冲液交替洗涤至洗液为无色，得到的固体即为3D枝状TiO

优选的，步骤(1)中所述十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和水的摩尔比为10:0.05；

所述四异丙醇钛(TTIP)盐酸溶液中四异丙醇钛(TTIP)和盐酸的质量体积比为0.35:25， g:ml。

优选的，步骤(1)中所述十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与四异丙醇钛(TTIP)的质量比为40:35。

优选的，步骤(2)中所述凝胶和乙二醇的体积比为25:25，ml:ml；

所述凝胶和尿素的体积质量比为25:0.3，ml:g。

2.根据上述制备方法制备的3D枝状TiO

3.一种无外源发光体的电致化学发光传感器界面，所述界面通过将上述3D枝状TiO

优选的，所述氯金酸的浓度为1mM，所述沉积的条件为：-0.5V下沉积20S。

4.一种无外源发光体的电致化学发光传感器，所述传感器包括底液过硫酸钾溶液为、氧化铟锡(ITO)电极和上述传感器界面。

5.上述传感器的制备方法，所述传感器按照如下方法制备：

(1)向经过预处理的氧化铟锡(ITO)电极表面滴加上述3D枝状TiO

(2)将步骤(1)所得的修饰电极置于氯金酸溶液中进行沉积形成，得到修饰界面；

(3)将95℃下退火形成的标记有二茂铁的Y形四联体DNA结构通过Au-S配位键组装在步骤(2)所得的修饰界面(ECL信号呈“off”状态)上；

(4)在37℃下用质量分数为1％巯基己醇(HT)封闭步骤(3)所得界面的非特异性吸附位点，封闭40min后用去离子水趟洗即可得到无外源发光体的电致化学发光传感器，在 4℃下存储备用。

优选的，步骤(1)中所述预处理具体为：将等体积的水和乙醇混合形成混合溶剂，加入 NaOH溶解，将氧化铟锡(ITO)电极置于其中超声5min取出，然后再分别在丙酮和超纯水中超声15～30min后取出，室温下静置晾干；

所述混合溶剂和NaOH的体积摩尔比为10:1，ml:mol；

所述氧化铟锡(ITO)电极的电阻R＝8Ω。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了一种3D枝状TiO

2、本发明公开了3D枝状TiO

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为实施例2中制备的传感器的稳定性检测结果；

图2为实施例2中制备的传感器的选择性检测结果；

图3为ECL响应值与不同心肌肌钙蛋白浓度的检测结果。

图4为ECL响应值与心肌肌钙蛋白浓度的对数值的标准曲线；

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

一种3D枝状TiO

(1)将0.35g四异丙醇钛(TTIP)加入到25g浓盐酸中搅拌形成A溶液，将0.4g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入到49ml去离子水中形成B溶液(其中十六烷基三甲基溴化铵((CTAB)和水的摩尔比为10:0.05)，将所得的B溶液加入A溶液中，室温搅拌1h，形成透明的凝胶；

(2)取25ml所得的凝胶与25ml乙二醇混合，再加入0.3g尿素，室温搅拌10min溶解，得到C溶液；

(3)取所得的C溶液于50ml高压反应釜中，在150℃下反应20h，冷却后过滤得到沉淀；

(4)将步骤(3)中的到的沉淀用乙醇和PBS缓冲液交替洗涤，直至洗涤液变为无色，得到的固体即为3D枝状TiO

实施例2

将实施例1中制备的3D枝状TiO

(1)氧化铟锡(ITO)电极预处理：将ITO电极(R＝8Ω)置于10mL体积比为1:1的水和乙醇混合液中，加入1mol氢氧化钠溶解，超声5min后取出，然后分别在丙酮和超纯水中超声15～30min，室温下静置晾干；

(2)制备修饰电极：向经过预处理的氧化铟锡(ITO)电极表面滴加10μL实施例1中制备的3D枝状TiO

(3)制备修饰界面：在修饰电极的表面进行电沉积金纳米粒子(静电位沉积时所用的氯金酸浓度为1mmol/L，静电位采用的条件为-0.5V，20S)，并在室温下晾干得到修饰界面；

(4)制备表面修饰Y形DNA结构的电极：将Y形DNA结构(将5'修饰巯基的CP链、 ST链、AP链和5'修饰二猝灭物质二茂铁的DNA在PCR中加热到95℃，保持约10min，再在4℃下快速冷却后，形成Y形DNA结构)滴在所得的修饰界面上，Y形DNA结构通过Au-S配位键组装在所得的修饰界面得到表面修饰Y形DNA结构的电极；

(5)制备无外源发光体的电致化学发光传感器：在37℃条件下用质量分数为1％巯基己醇(HT)封闭所得的表面修饰了Y形DNA结构的电极，封闭40min，取出并水洗，去掉非特异性结合位点，制得无外源发光体的电致化学发光传感器。

实施例3

实施例2中制备的无外源发光体的电致化学发光传感器的选择性检测：

为了进一步研究无外源发光体的电致化学发光传感器(含有基于3D枝状TiO

(1)将9个实施例2中制备的传感器分别放入到含有各干扰蛋白(干扰蛋白包括干扰蛋白包括淀粉样蛋白(aβ)、癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)，其浓度均为1ng/mL)的溶液中(每个干扰蛋白三组)，在37℃的条件下反应90min，反应完成后用去离子水清洗；

(2)将6个实施例2制备的传感器分别放入到含有100pg/mL cTnI的溶液、混合蛋白(混合蛋白中含有目标蛋白(cTnI)和干扰蛋白(粉样蛋白(aβ)、癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP))，其中混合后目标蛋白cTnI的浓度为100pg/mL)中(cTnI和混合蛋白(Mixture) 各三组)，在37℃的条件下反应90min，反应完成后用去离子水清洗；

(3)另外将3个实施例2制备的传感器分别放入未添加任何蛋白的溶液中作为空白组 (blank)；

(4)电致化学发光检测采用三电极体系(干扰蛋白反应的传感器或与cTnI溶液反应的传感器分别为工作电极、铂丝电极作为对电极、Ag/AgCl(饱和KCl溶液)作为参比电极)，在含有过硫酸钾的PBS缓冲溶液中对工作电极进行连续ECL扫描，电位扫描速度为100mV/s，光电倍增高压管设为750V，扫描电压范围为-1.2～0V(vs.Ag/AgCl)，并记录下稳定扫描得到的ECL响应值，其结果如图1所示；

(4)各干扰蛋白的ECL信号分别被测定，重复测定三次，将三次ECL信号强度求平均值，具体结果如图2所示。由图2中选择性测试结果可知，即使在干扰蛋白溶液浓度比cTnI溶液浓度大的情况下，本发明制备的的无外源发光体的电致化学发光传感器对cTnI的ECL响应值也更高，说明本发明无外源发光体的电致化学发光传感器具有良好的选择性。

实施例4

实施例2中制备的无外源发光体的电致化学发光传感器的实际样品检测：

无外源发光体的电致化学发光传感器(含有基于3D枝状TiO

(1)将实施例2制备好的传感器分别在用人血清稀释的不同浓度cTnI溶液(cTnI的浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100ng/mL)在37℃下孵育90min，反应完成后用去离子水趟洗；

(2)电致化学发光检测采用三电极体系(ITO为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl (饱和KCl溶液)作为参比电极)，在含有过硫酸钾的PBS缓冲溶液中对工作电极进行连续 ECL扫描，电位扫描速度为100mV/s，光电倍增高压管设为750V，扫描电压范围为-1.2～0V (vs.Ag/AgCl)，并记录下稳定扫描得到的ECL响应值；

(3)检测到的ECL信号随着cTnI浓度的增加而增加，如图3所示，并且和cTnI浓度的对数值成正比，绘制成cTnI标准曲线如图4所示；

(4)重复检测三次，将三次ECL连续扫描得到的稳定ECL强度值求平均值，对照cTnI标准曲线(图4)可计算出对应的cTnI浓度和回收率，具体结果如表1所示。由表1的回收率结果表明本发明无外源发光体的电致化学发光传感器的灵敏度高，能够较好的用于实际样品检测分析。

表1实际样品检测

综上所述，本发明提供了一种3D枝状TiO

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。