一种提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法

摘要

本发明公开了一种提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法，包括如下步骤：(1)外植体的选择：选择曼地亚红豆杉1‑2年生半木质化健壮枝条，剪取3‑5cm长的带腋芽茎段，去掉基部针叶，作为外植体；(2)外植体的处理：外植体清洗消毒后，使用ABT1溶液、NAA溶液或IBA溶液浸泡5‑30min；(3)生根培养：将经步骤(2)浸泡后的外植体接种于添加有0.08g/L代森锰锌的无糖1/2MS琼脂培养基中于25±2℃下进行明暗交替培养，光照强度2000‑2800Lx，光照时长12h/d。本发明方法操作简单可控，对曼地亚红豆杉根系促生效果显著，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及植物繁殖技术领域，更具体的说是涉及一种提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法。

背景技术

曼地亚红豆杉为东北红豆杉与欧洲红豆杉的天然杂交品种；在全世界11种红豆杉品种中，曼地亚红豆杉根茎叶等部位的紫杉醇含量较高，并且其树形优美，四季常青，抗寒能力较强，市场前景广阔。

目前曼地亚红豆杉的繁殖研究以瓶外传统扦插方法为主，生根率可达90％以上。然而，传统的扦插方法培养过程费时费力，且需要较大的繁育空间，不适于工厂化育苗；此外，倘若对曼地亚红豆杉进行遗传转化或良种培育的研究，有可能发生供试材料极为有限，传统扦插方法较为浪费材料，不利于遗传转化体系成苗生根研究。

瓶内组培的繁育方法条件可控，无需经常进行水分管理，且用材较省，适于稀有植物材料的快速繁殖；然而目前对于曼地亚红豆杉的组培研究较少，主要由于其瓶内组培极难生根，生根率通常不足30％，且生长速度缓慢，限制了相关推广和应用。

因此，亟待提供一种提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法，其操作简单，易于控制，为曼地亚红豆杉的快速繁殖研究提供了良好基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法，包括如下步骤：

(1)外植体的选择：

选择曼地亚红豆杉1-2年生半木质化健壮枝条，剪取3-5cm长的带腋芽茎段，去掉基部针叶，作为外植体；

(2)外植体的处理：

外植体清洗消毒后，使用ABT1溶液、NAA溶液或IBA溶液浸泡5-30min；

(3)生根培养：

将经步骤(2)浸泡后的外植体接种于添加有0.08g/L代森锰锌的无糖1/2MS琼脂培养基中于25±2℃下进行明暗交替培养，光照强度2000-2800Lx，光照时长12h/d。

本发明使用3-5cm长的带腋芽茎段进行曼地亚红豆杉的无性繁殖，节省空间及用料，并且结合培养前外植体浸泡处理、培养基质的选择、培养条件的控制，可解决曼地亚红豆杉组培难于生根的问题，提高生根率。

培养前使用ABT1溶液、NAA溶液或IBA溶液对外植体进行浸泡处理，可促进生根，并且培养过程中无需对培养基成分进行调整，操作更为方便。

培养基质中加入特定浓度的代森锰锌，使外植体的生长过程中基部始终处于抑菌环境中，代森锰锌不断渗入外植体内部，可有效抑制内生菌；且该浓度代森锰锌对外植体伤害较小，在降低外植体污染率、褐化率的同时能够保持较高的存活率；此外，代森锰锌的添加不会影响培养基的软硬程度。

生根培养过程中培养温度、光照强度及时间对生根率影响较大，若光照强度低、时间短，容易引起叶片黄化和脱落，植株不能充分进行光合作用，影响碳水化合物的积累及内源生长激素的合成，生根率非常低；若温度过高，光照过强、时间过长，叶片蒸腾加剧、失水萎蔫，甚至会造成灼伤；本发明通过对培养温度、光照强度及时间进行控制，以维持外植体水热、蒸腾作用、光合作用以及激素调控的平衡，从而保持活力促进生根。

进一步优选地，外植体清洗消毒后，使用IBA溶液浸泡15-30min。

优选地，步骤(1)中，由带腋芽茎段的基部去除茎段上1/3-1/2的针叶。

优选地，步骤(2)中清洗消毒为：

使用洗涤溶液浸泡清洗茎段5-10min，流水冲洗30-60min；

再使用质量分数75％的酒精处理20-30s，无菌水冲洗3-5次；

再使用质量分数0.1％的升汞处理6-12min，之后用无菌水冲洗5-8次。

外植体生根培养前进行清洗消毒，配合生根培养过程中通过代森锰锌抑菌，可有效降低污染率，提高存活率。

进一步地，使用酒精或升汞处理茎段时，将茎段完全浸泡于酒精或升汞中。

优选地，步骤(2)中，

ABT1溶液浓度为100mg/L；

NAA溶液浓度为50mg/L；

IBA溶液浓度为300mg/L。

有研究表明，外植体长度对生根率有显著影响，外植体较长时其根原始体的数量或养分含量较多，能促进生根；传统的曼地亚红豆杉扦插插条长度为10-25cm，而本申请中采用3-5cm长的带腋芽茎段作为外植体，二者对于外源植物生长调节剂的响应存在较大差异；本发明通过对植物生长调节剂种类、浓度、处理方式、处理时间进行限定，控制植物生长调节剂适量渗入植物内部，进而促进外植体生根。

优选地，步骤(3)中，于开放的环境中进行接种，接种后于光照培养箱中进行培养。

优选地，步骤(3)中，所述添加有0.08g/L代森锰锌的无糖1/2MS琼脂培养基制备方法如下：

于无糖的1/2MS液体培养基中加入4-4.5g/L琼脂，煮至透明后调节pH

5.8-6.0，降温至45-55℃后加入0.08g/L代森锰锌，分装至组培瓶中。

通过琼脂的用量调节培养基的软硬程度，保证其既能起到支撑外植体的作用，又不会使外植体在插入过程中出现弯曲或基部表面破损等现象。

优选地，1/2MS(大量元素的1/2)液体培养基组分如下：

进一步地，步骤(3)中接种后根据生长情况转接到新的添加有0.08g/L代森锰锌的无糖1/2MS琼脂培养基中。

进一步优选地，接种后每隔40-48d转接一次。

将上述提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法应用于曼地亚红豆杉无性繁殖，操作简单，条件可控，适于工厂化育苗。

将上述提高曼地亚红豆杉组培苗生根率的方法应用于曼地亚红豆杉生根机制的研究中(如根系生长相关基因的遗传转化等)，可节省材料，便于观察，提高实验效率；进一步地，传统扦插基质如蛭石、泥炭等成分复杂，对实验的干扰无法控制，而本发明使用的培养基质成分简单明确，可降低不可控因素对实验的干扰。

由上述技术方案可知，本发明方法操作简单可控，对曼地亚红豆杉根系促生效果显著，应用前景广阔。

附图说明

图1所示为第40天不同种类抑菌剂自然落菌试验结果。

图2所示为污染的曼地亚红豆杉外植体。

图3所示为全部褐化的曼地亚红豆杉外植体。

图4所示为基部褐化的曼地亚红豆杉外植体。

图5所示为第6组曼地亚红豆杉生根过程；

其中，A.外植体；B.外植体切口处膨大，有白色根点突出；C.不定根从外植体切口处长出；D.多条不定根长出；E、F.皮部生根型。

图6所示为第6组曼地亚红豆杉根系生长状态；

其中，A为组培第70天生根情况；B为组培第112天生根情况。

图7所示为曼地亚红豆杉生根茎段移栽至花盆中的生长状态。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所用研究材料为采自6年生曼地亚红豆杉植株上的健壮枝条；所用的植物生长调节剂NAA和IBA，购自保定市万科生物科技有限公司，ABT1号生根粉购自北京艾比蒂生物科技有限公司。

实施例1开放式组培抑菌条件研究

1.自然落菌试验

在开放的环境中配置培养基，不经过高温高压灭菌：

于无糖的1/2MS液体培养基(表1)中加入8g/L琼脂，煮沸至透明后调节pH 5.8-6.0，降温至约50℃后加入抑菌剂，充分搅拌培养基，定量分装至洁净的组培瓶中，在空气中暴露1h后，封口置于培养箱25℃培养。

抑菌剂分别为：次氯酸钠溶液、70％代森猛锌可湿性粉剂、50％多菌灵可湿性粉剂、山梨酸钾和75％百菌清可湿性粉剂；每种抑菌剂设置0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5g/L6个浓度，加空白对照(CK)共31个处理，每个处理设5个样本，3次重复，根据污染情况，判断抑菌效果，如有抑菌作用，则培养基不会出现污染现象。40d后观察结果，统计污染率，结果如表2及图1所示。

污染率(％)＝(产生污染的瓶数/接种的瓶数)×100％。

表1无糖1/2MS液体培养基组分

表2第40天不同种类抑菌剂自然落菌试验结果

由上述结果可知，添加山梨酸钾和多菌灵的培养基里，污染率达到100％；抑菌剂浓度在0.1-1.5g/L范围内，次氯酸钠具有抑菌效果，但抑菌效果低，在1.5g/L时仍有33.3％的污染率；随着抑菌剂浓度升高，代森锰锌浓度在0.1g/L时污染率已经为0％，百菌清浓度为0.5g/L时污染率达到0％。由此可知，抑菌效果由高到低分别是代森锰锌>百菌清>次氯酸钠；代森锰锌抑菌有效浓度为0.1-1.5g/L之间，百菌清抑菌有效浓度为0.5-1.5g/L之间。

2.最佳抑菌剂种类及浓度筛选

根据自然落菌试验方法及其获得的最佳抑菌剂及有效浓度范围，分别配置含有如下抑菌剂的培养基：75％百菌清(配置0.2、0.4、0.6、0.8g/L，4个浓度)、70％代森锰锌(配置0.08、0.1、0.2、0.3g/L，4个浓度)，以及未添加抑菌剂的对照组培养基，各组培养基定量分装至洁净的组培瓶中，封口备用。

取曼地亚红豆杉1-2年生健壮枝条，用软毛刷刷去表面尘土，剪取3-5cm长的带腋芽茎段，由基部去除茎段上1/3-1/2的针叶，作为外植体。

外植体放入烧杯中，滴入几滴洗涤灵，搅拌后浸泡10min，流水冲洗1h；再完全浸泡于质量分数75％的酒精中处理30s，无菌水冲洗5次；随后完全浸泡于质量分数0.1％的升汞中灭菌处理10min，之后用无菌水冲洗5次。消毒完成后，剪除外植体两端浸入升汞的部分，取中间部分扦插于培养基质中(不使用超净工作台，直接在实验室操作台上接种)，25℃培养45天后对外植体生长情况进行统计，结果如表3、4所示。

污染率(％)＝污染数÷接种数×100％

褐化率(％)＝褐化数/接种数×100％

存活率(％)＝存活数/接种数×100％

表3抑菌剂代森锰锌对曼地亚红豆杉外植体的影响

注：表中数据为平均值±标准误差；同列不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。

表4抑菌剂百菌清对曼地亚红豆杉扦插外植体的影响

注：表中数据为平均值±标准误差；同列不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。

从表3、4中可以看出，与代森锰锌组相对比，百菌清组外植体污染率更高(图2)，存活率低。但随着浓度的升高，代森锰锌组外植体褐化率逐渐增加(图3)，存活率也显著降低；并且代森锰锌浓度为0.1g/L时，污染较为严重，污染率为20.61％。综合比较，代森锰锌浓度在0.08g/L时，外植体存活率最高，为96.67％；因此，选择0.08g/L代森锰锌为后续实验的抑菌剂。

进一步地验证代森锰锌的使用浓度，设置0.06g/L、0.07g/L、0.09g/L浓度组，每组30个样本，重复三次，结果显示0.06g/L组死亡率7.78％，褐化率15.56％；0.07g/L组死亡率15.56％，褐化率13.33％；0.09g/L组死亡率7.78％，褐化率16.67％；由此可见，0.08g/L代森锰锌效果最好。

实施例2培养基琼脂浓度的筛选

在无糖1/2MS培养基液体中加入琼脂粉(2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6g/L，共7个浓度)，使用玻璃棒搅拌均匀，逐渐煮至透明，调节pH至5.8-6.0，不经高温高压灭菌，将熬制好的各个浓度培养基均分成两部分，一部分加入0.08g/L代森锰锌，一部分不加抑菌剂，后分装倒入洁净的组培瓶中，每个处理5个重复样本，冷却2h，观察记录培养基的凝固状态以及软硬程度。

结果如表5所示，琼脂浓度在2.5-3g/L时，培养基会有流动和粘壁现象，不能起到支撑外植体的作用；浓度在5-6g/L时培养基偏硬，外植体插入过程中，会出现弯曲或基部表面破损等现象，对外植体生长不利；当琼脂浓度在4-4.5g/L时可对插条起到支撑和保护作用。进一步地，培养基中加入代森锰锌与不加代森锰锌，其凝固程度无明显区别，说明了抑菌剂代森锰锌不会影响培养基的软硬程度。

表5琼脂浓度对应的凝固程度

实施例3组培生根实验

在开放的环境中配置培养基，不经过高温高压灭菌：

于无糖的1/2MS液体培养基中加入4g/L琼脂，煮沸至透明后调节pH5.8-6.0，降温至约50℃后加入0.08g/L代森锰锌，充分搅拌培养基，定量分装至组培瓶，封口待用。

取曼地亚红豆杉1-2年生健壮枝条，用软毛刷刷去表面尘土，剪取3-5cm长的带腋芽茎段，由基部去除茎段上1/3-1/2的针叶，作为外植体。

外植体放入烧杯中，滴入几滴洗涤灵，搅拌后浸泡10min，流水冲洗1h；再完全浸泡于质量分数75％的酒精中处理30s，无菌水冲洗5次；随后完全浸泡于质量分数0.1％的升汞中灭菌处理10min，之后用无菌水冲洗8次。消毒完成后，剪除外植体两端浸入升汞的部分，取中间部分，分别进行如下处理：

1组：使用50mg/LNAA浸泡外植体5min，然后将外植体接种于组培瓶内培养基上，封口，置于25℃光照培养箱中，光照强度2500Lx，光照时长12h/d，进行生根培养；

2组：使用300mg/LNAA浸泡外植体30min，然后将外植体接种于组培瓶内培养基上，封口，置于25℃培养箱中，24h全黑暗培养；

3组：使用100mg/LABT1号浸泡外植体30min，然后将外植体接种于组培瓶内培养基上，封口，置于25℃光照培养箱中，光照强度2500Lx，光照时长12h/d；

4组：使用300mg/LABT1号浸泡外植体5min，然后将外植体接种于组培瓶内培养基上，封口，置于25℃光照培养箱中，光照强度2500Lx，光照时长12h/d，并于组培瓶上覆盖50％遮阳网；

5组：使用50mg/L IBA浸泡外植体30min，然后将外植体接种于组培瓶内培养基上，封口，置于25℃光照培养箱中，光照强度2500Lx，光照时长12h/d，并于组培瓶上覆盖50％遮阳网；

6组：使用300mg/L IBA浸泡外植体15min，然后将外植体接种于组培瓶内培养基上，封口，置于25℃光照培养箱中，光照强度2500Lx，光照时长12h/d；

CK：使用清水浸泡外植体，然后将外植体接种于组培瓶内培养基上，封口，分为3组，CK1置于25℃光照培养箱中，光照强度2500Lx，光照时长12h/d，进行生根培养；CK2置于25℃光照培养箱中，光照强度2500Lx，光照时长12h/d，并于组培瓶上覆盖50％遮阳网；CK3置于25℃培养箱中，24h全黑暗培养。

上述试验均在开放的环境中进行，即不使用超净工作台，直接在实验室操作台上接种；每组24个平行，重复3次；接种后每天进行观察，每45d转接一次(转至新的添加有0.08g/L代森锰锌的无糖1/2MS琼脂培养基)。接种第112d统计各组不定根数，最长不定根长度，生根率以及根系效果指数，结果如表6所示。

生根率(％)＝生根外植体数/存活数×100％；

根系效果指数＝平均根长×平均生根数/总外植体数。

表6

注：表中生根率、生根数、最长不定根长为各处理的平均值。

由上表可知，6组生根率最高，为45.83％，生根数为4.75，根长4.43，根系效果指数为1.741；其次为空白处理(CK1)，生根率达33.33％，生根数3.50，根长4.09，根系效果指数为1.260。

进一步地，曼地亚红豆杉外植体生根属于皮部生根型，不定根从外植体基部的切口处长出。不同处理组尽管在生根率上有差异，但整个生根过程表现基本一致，可分为3个阶段：外植体基部膨大期(33～50d)、不定根发生期(50～73d)、不定根形成期(73～82d)；其中，部分处理组曼地亚红豆杉外植体出现基部褐化现象(图4)；6组(图5、6)相较于其他组生根速度更快，褐化程度更低：在第33天时外植体基部切口处皮层开始膨大；第50d时，外植体切口处产生白色点状突起(图5B)。之后愈伤组织逐渐消失，基部进一步膨大开裂，73d时在外植体基部有白色根点长出，有的长至1.0cm(图5C)；在108d时，外植体基部已有3-9个不定根(图5D)，之后不定根主要进行伸长生长(图5E、5F)。

进一步地，将第6组生根茎段移栽到花盆中(图7)，25℃培养箱中继续培养，45d后统计移栽成活率为100％。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。