一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a结合的生物传感器及其检测方法和应用

摘要

本发明公开了一种指数扩增反应和CRISPR‑Cas 12a结合的生物传感器及其检测方法和应用，该传感器的DNA模板由两段相同的序列，通过Nt.BstNI的酶切位点连接而成；其中，DNA模板的5’端复制出来的反义链，其临近3’端附近可以与CRISPR‑Cas12a的crRNA互补配对；当样品中含有Let‑7a的序列，DNA模板与Let‑7a序列互补成双链，在聚合酶的作用下启动整个体系的扩增反应，接着在Nt.BstNI的作用下，切割出能够与CRISPR‑Cas12a的crRNA互补的单链DNA，从而激活CRISPR‑Cas12a的切割荧光团标记的单链DNA的能力；反之，若样品中没有Let‑7a，则整个反应不会发生。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物传感器及其检测方法和应用，涉及一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器及其检测方法和应用。

背景技术

microRNA，简写miRNA，是一类内源性、非编码的较短的RNA分子(19-23nt)。其可通过与目标mRNA结合，介导转录的抑制、mRNA的降解，在调控基因表达中扮演了重要的角色。它们在生物样品中的稳定性，对不利贮存环境的抵抗性等，使得其可作为一种生物标记物。microRNA在广泛的生物过程中发挥重要作用，包括增殖、发育、代谢、免疫反应、肿瘤发生和病毒感染。为了更好地了解这些生物分子的功能，必须对其进行检测，这对于人类疾病的早期诊断以及通过使用这些分子作为靶点发现新药具有巨大的潜力。RNA印迹技术被认定为检测microRNA的标准方法。但是该方法涉及到大量的人工操作，此外该方法耗时、耗量，非常不适合现场快速检测。Let-7a作为一种microRNA，在肿瘤等疾病的发生过程中发挥重要的调控作用，与肿瘤发生密切相关。但是该microRNAs本身的含量很低。因此，需要开发出一种具有高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测方法。

等温酶扩增技术利用独特的DNA和RNA聚合酶，例如Phi29、Bst、Vent exo-DNA聚合酶以及T7 RNA聚合酶，最终可产生包含数十至数百个串联重复序列的单链DNA或者RNA。这种强大的扩增技术已成为生物医学研究和纳米生物技术中优良的工具。等温指数扩增技术(EXPAR)，是一种结合单链剪切和聚合酶延伸的等温扩增技术，这种技术具有很高的扩增效率。其特点在于利用特殊的切刻内切酶识别特异的碱基序列并且只剪切双链DNA中的一条链，但是EXPAR的背景信号较强。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于通过设计一种指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器，从而放大检测信号，以提高整个检测方法的灵敏度与特异性。本发明设计的模板，包含两个对称的部位和一个缺口酶酶切位点，从而使得信号呈指数倍放大。本发明的另一个目的是提供该生物传感器的检测方法以及应用。

技术方案：本发明所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器，该传感器的DNA模板由两段相同的序列，通过Nt.BstNI的酶切位点连接而成；其中，DNA模板的5’端复制出来的反义链，其临近3’端附近可以与CRISPR-Cas12a的crRNA互补配对；当样品中含有Let-7a的序列，DNA模板与Let-7a序列互补成双链，在聚合酶的作用下启动整个体系的扩增反应，在Nt.BstNI的作用下，切割出能够与CRISPR-Cas12a的crRNA互补的单链DNA，从而激活CRISPR-Cas12a的切割荧光团标记的单链DNA的能力；反之，若样品中没有Let-7a，则整个反应不发生。

所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器，模板序列：5‘-AACTATAC AACC TACT ACCT CAAA CAGA CTC AAAC TATA CAAC CTAC TACC TCAA-3’；

Let-7a序列：5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’；

crRNA序列：5’-UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU AAC UAU ACA ACC UAC UAC CUCA-3’。

所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法，包括如下步骤：

(1)加入样品；目标物存在的情况下，在DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的作用下将启动整个扩增反正反应，以实现放大信号的目的；

(2)加入与模板互补的适配体，适配体和模板的5’端附近通过碱基互补配对结合；

(3)加入DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶，适配体将沿着模板进行扩增，得到可以激活CRISPR-Cas12a的DNA片段；由于Nt.BstNBI切刻内切酶的切割，将新扩增出的DNA片段从模板上脱落下来，这使得扩增结果呈现出指数级的扩增；

(4)在步骤(3)得到的产物中加入CRISPR-Cas12a、crRNA、荧光标记的单链DNA以及反应缓冲液3，使用酶标仪测量其荧光强度；

(5)使用Real-Time PCR方法对步骤(1)中的样品进行检测，验证本发明的方法的准确性。

所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法，步骤(3)DNA聚合酶是在反应缓冲液1中，其中含有Tris-HCl、(NH

所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法，步骤(3)中Nt.BstNBI切刻内切酶的反应混合液、模板以及含有目标物的溶液，在50-65℃的条件下，反应30-60min。

所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器的检测方法，步骤(3)中的含Let-7a样品的浓度为0-100nM。

所述的指数扩增反应和CRISPR-Cas 12a相结合的生物传感器在制备Let-7a诊断试剂中的应用。

本发明通过特异性的设计，在模板的3’端用磷酸基团修饰，这样可有效避免非特异性扩增的发生。当含有Let-7a时，模板与Let-7a互补配对，在Vet DNA polymerase的作用下，使得不断扩增出许多Let-7a的片段。在缺口酶-Nt.BstNBI的作用下，扩增出来的模板不断被切割出来，使得激活CRISPR/Cas12a的单链DNA成指数增加。最终的荧光会明显增强。在没有目标物的情况下，由于扩增的引物不存在，使得扩增反应无法进行，最终得到较低的荧光强度。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：(1)本方法通过利用了核酸的可编程性，通过合理的设计扩增模板的序列，大大增加了检测信号，并降低了非特异性信号的影响。(2)本方法依赖了指数扩增技术作为信号扩增的手段，避免了传统扩增方法的繁琐，使得整个反应都在恒温下进行。对于实时定点的检测样品具有巨大的意义。(3)本发明采用对称扩增模板与恒温的扩增技术相结合形成检测痕量microRNA的传感方法。可用于人体中microRNA的检测，具有无需额外标记、变温处理、高灵敏、低成本、高通量检测的优势，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是该方法以及Real-Time PCR在含有不同浓度的Let-7a样品中的荧光强度的变化趋势；其中，系列1是该方法的荧光值，系列2是RT-PCR的荧光值；

图2是该方法的特异性检测分析。在相同条件下，检测其他microRNA与Let-7a的荧光值。

具体实施方式

药品和试剂：实验中所使用的的所有DNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。

实施例1

(1)分别取1μM的DNA模板溶液与10nM的Let-7a，以及酶的反应混合溶液，该混合溶液包含10×Vent DNA polymerase Buffer、10×Nt.BstNBI Buffer、10nM dNTPs、DNApolymerase以及Nt.BstNBI。在55℃反应30min，之后在80℃反应20min。进行孵育30min。

(2)分别取10μL的上述产物，加入500nM的CRISPR/Cas12a、100nM crRNA、含有RNA抑制酶的去离子水以及荧光团和淬灭基团的单链DNA于10×CRISPR/Cas12a的反应反冲液中。整个反应在37℃下孵育60min，65℃下孵育10min，对酶进行灭活。

(3)分别取80μL的上述得到的产物，放入酶标板中测量其荧光结果。

表1.所用到的模板序列

实施例2

灵敏度实验

选择Let-7a浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90以及100pM的样本溶液进行验证，结果如图1所示。确定了检测线性范围为0-100pM，检测限达到了0.04pM。

实施例3

选择性实验

重复实施实例1中的步骤，其它条件不变，本发明选择了Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f以及Let-7g作为干扰元素检测荧光，得到本方法的选择性结果图。在相同条件下，检测其他microRNA与Let-7a的荧光值如图2所示，从图中可以看出本发明所述方法对目标分子具有良好的选择性。

实施例4

本发明检测方法的回收率实验

将样品换成去离子水，并向样品中分别加入等量20、40以及60pM的Let-7a，获得本方法在实际样品检测目标分子中的回收率，结果见表2。

表2回收率实验

实施例5

本发明与基于Real-Time PCR的检测结果进行比较

由于该方法以最终荧光强度作为判断依旧来检测最终的目标物浓度，所以本发明使用了检测荧光强度的金标准方法Real-Time PCR进行验证试验。结果如图1所示。该方法比Real-Time PCR方法更加灵敏和节约时间。