聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统及其应用

摘要

本发明涉及一种聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统及其应用，所述系统中包含一种或多种缓冲剂、非极性氨基酸、极性氨基酸以及糖，由水溶解。相较于传统方法，本缓冲系统在蛋白质的电泳分离中具有分辨率高、兼容性好、分子量检测范围广以及电泳速度快等优点，同时也提高了缓冲体系的稳定性，极大地提高了实验操作者的安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及属于生物检测分析领域，具体涉及一种聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统及其应用。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electropHoresis,PAGE)是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的三维网状结构物质。主要应用于对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离和鉴定。该方法是当前使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术。在科研工作中一个好的凝胶电泳不仅能反映科研工作者的基本科研素质，也是许多新技术方法的基石，比如目前蛋白质组学研究技术如2-D蛋白电泳，质谱分析等研究工作都需要有更稳定、更精确的凝胶电泳技术。

自1964年Orenstein和Davis分别建立了不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳体系以来，蛋白电泳凝胶系统主要是以Tris-HCl为主的不连续缓冲体系。对于具有丰富实验经验的操作者来说，该系统能够较好的完成蛋白质的分离、分析工作，但是其凝胶的制备操作较为繁琐，特别是对于<10kd的小分子蛋白肽和>150kd的大分子蛋白时，往往不能得到很好的分离效果。因此蛋白电泳凝胶系统的改进一直没有停止。特别是近年来随着分子生物学研究向蛋白组学的延伸，蛋白电泳凝胶系统的研究工作取得了众多的成果，如美国专利No7422670；6783651；6143154；6059948；6 096182；6162338；5922185和5578180描述了凝胶和不连续缓冲系统，其中分离在中性pH下发生，且其中所述蛋白质基本上保持在还原状态。所述凝胶系统由pH 5.5～7.5的聚丙烯酰胺凝胶和pH 6～8的凝胶缓冲剂构成。但是，其运行均需要特定的电泳缓冲液。在使用非特定缓冲液时，凝胶制品的分辨率明显下降。欧洲专利EP1533612B1提出了基于DMSO的高分辨率缓冲系统，能够明显提高蛋白电泳的分辨率，但是由于其凝胶的基础缓冲体系为Tris-tricine体系，价格较为昂贵，同时对于其运行条件未做明确说明，因此其通用性未知。美国专利US2014/0008226A1也描述一种基于三乙醇胺的凝胶缓冲体系，其低廉的价格是Tris很好的替代品，但是其制备的凝胶电泳分辨率较传统Tris-HCl系统还存在一定的差距。美国专利US006090252公开了一种基于Tris-牛磺酸的凝胶缓冲体系，虽然具有较好的分辨率但是由于其使用时要求分别配制阴极电泳液和阳极电泳液，大大的增加了实验操作的复杂性，因此不适用于广泛、大规模的开展实验。我国专利201410098646.8也公布了一种基于Tris-甘氨酸的凝胶缓冲体系，虽然具有较好的经济性，但是长达120-180min的运行时间使其应用前景大打折扣。

发明内容

本发明的目的是提供一种分辨率更高、分子量检测范围更宽、更耐高压、兼容性更优、稳定性和安全性也更高的聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统及其应用，克服现有技术的缺陷，可广泛用于分离胶、浓缩胶和一体胶等凝胶体系。

本发明所采用的技术方案为：

聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统，其特征在于：

所述系统中包含一种或多种缓冲剂、非极性氨基酸、极性氨基酸以及糖，由水溶解。

所述缓冲剂为有机缓冲剂，选自三羟甲基氨基甲烷、三乙醇胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、一水吗啉乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸。

所述非极性氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸。

所述极性氨基酸选自天冬酰胺、谷氨酰胺。

所述糖选自麦芽糖、木糖、核糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、蔗糖、菊糖、木糖醇、葡萄糖、三氯蔗糖、聚葡萄糖。

所述缓冲剂在缓冲系统中的最终质量百分比为0.1％-10％；

所述非极性氨基酸在缓冲系统中的最终质量百分比为0.1％-10％；

所述极性氨基酸在缓冲系统中的最终质量百分比为0.1％-10％；

所述糖在缓冲系统中的最终质量百分比为0.1％-50％。

所述缓冲系统的pH为5-9。

所述水选自双蒸水和去离子水。

如所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统的应用，其特征在于：

所述缓冲系统作为电泳缓冲液，用于生物大分子的分离和鉴定。

本发明具有以下优点：

本发明涉及的聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统由一种或多种缓冲剂、非极性氨基酸、极性氨基酸以及糖溶液共同组成，具有良好的兼容性作用，能够适用于各种蛋白样品的检测和在各种电泳缓冲液中运行，改善繁琐的蛋白电泳实验操作，成倍的加速实验操作时间，提高蛋白电泳的分辨率。

本发明涉及的聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统，其原料均可通过工业化生产或采购获得，具有良好的经济性，可以满足大规模生产的需要。

附图说明

图1为本发明缓冲系统对各种电泳缓冲液的适用性。

图2为本发明缓冲系统与各种浓度SDS-PAGE的比较。

图3为本发明缓冲系统制备凝胶在各种不同电泳运行缓冲液中的运行速度分析。

图4本发明缓冲系统制备凝胶在电泳中的分辨率分析。

图5本发明缓冲系统的稳定性分析结果

图6本发明缓冲系统的分子量标准曲线具有更好的线性

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及的聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统，是由一种或多种缓冲剂、非极性氨基酸、极性氨基酸以及糖溶液共同组成的缓冲体系，其特点是具有良好的兼容性作用，能够适用于各种蛋白样品的检测和在各种电泳缓冲液中运行，改善繁琐的蛋白电泳实验操作，成倍的加速实验操作时间，提高蛋白电泳的分辨率，具有更宽分子量检测范围(1-500kd)，是一种耐高压的快速蛋白电泳缓冲体系，也是一种具有更好稳定性的四甲基乙二胺(TEMED)液相系统。

本发明所涉及到的一种或多种缓冲剂是指在反应或保存中逐渐释出盐中的酸或碱以保持溶液稳定的酸碱值的试剂，同时在本发明中缓冲剂的选择还会影响TEMED的稳定性。它包括无机盐类缓冲剂和有机缓冲剂。在本发明中主要涉及的是有机缓冲剂，包括：三羟甲基氨基甲烷、三乙醇胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、一水吗啉乙磺酸、3-吗啉丙磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸等Good"s试剂的一种或者几种，其中优选为三羟甲基氨基甲烷、三乙醇胺、三(羟甲基)甲基甘氨酸以及N,N-二羟乙基甘氨酸。其中最优选为三羟甲基氨基甲烷。

本发明所涉及到的氨基酸是指含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。氨基连在α-碳上的为α-氨基酸。其中非极性氨基酸主要是甘氨酸、和丙氨酸。其中最优选为甘氨酸。本发明所涉及到的极性氨基酸是指其侧链能够与水分子形成氢键的一类氨基酸，主要包含天冬酰胺和谷氨酰胺，其中最优选为天冬酰胺。

本发明所涉及的糖类包含单糖，双糖以及多糖。其作用是提供更优的样品分离环境，同时分离胶和分离胶的差异浓度有利于实现分离胶和浓缩胶的同步配液制造。其中糖类主要是麦芽糖、木糖、核糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、蔗糖、菊糖、木糖醇、葡萄糖、三氯蔗糖、聚葡萄糖等，优选为木糖、海藻糖、蔗糖和聚葡萄糖，其中最优选为木糖。

本发明说涉及的水是指双蒸水和去离子水，优选为去离子水。

本发明中所涉及到的组成物的中缓冲剂的比例为0.1％-10％，其中优选比例为0.5％-5％，进一步最优选比例为1％-3％。

本发明中在非极性氨基酸的比例为0.1％-10％，其中优选比例为1％-5％，进一步最优选比例为1％-3％。

本发明中极性氨基酸的比例为0.01％-5％，其中优选比例为0.05％-2％，进一步最优选比例为0.2％-1％。

本发明中糖的比例为0.1％-50％，其中优选比例为5％-40％，进一步最优选比例为20％-30％。

本发明说涉及的缓冲液的pH为5-9，其中优选范围为6-8.8，进一步优选范围为6.8-7.8。

实施例一、凝胶缓冲体系的制备

试剂A：分别称量三羟甲基氨基甲烷6.3g，甘氨酸2.2g，天冬酰胺0.2g和木糖40g溶解到去离子水，调整pH到6.3后定溶至100ml。

试剂B：分别称量丙烯酰胺29g和甲叉双丙烯酰胺1g定溶到100ml。

试剂C：10％过硫酸铵

试剂D：TEMED(四甲基乙二胺)

蛋白电泳操作：

1、按照下表分别取试剂混合均匀后灌入蛋白电泳制胶模具中，检查无泄露后插入制胶梳。室温放置5-60min。

2、观察凝胶凝固后将其转移至电泳槽中，拔去制胶梳并加入TGS/MES/MOPS/TAS等电泳缓冲液后加入蛋白样品并接通电源。约30min后完成电泳。

3、拆卸凝胶，蛋白染色及脱色。

4、本发明缓冲系统制备电泳凝胶对TGS、MES、TAS、MOPS以及Genshare系统等各种电泳缓冲液的适用性分析，见图1。通过图1可以看到，应用本发明方法的电泳缓冲系统具有良好的兼容性，对于蛋白电泳常用的各种工作液(TGS buffer、MES buffer、TAS buffer、MOPS buffer)和本单位特有的Genshare buffer均有良好的适应能力，电泳条带清晰，锐利，符合生物技术研究的需要。

实施例二、凝胶缓冲体系的制备

试剂A：分别称量三羟甲基氨基甲烷1.6g，甘氨酸2.5g，天冬酰胺0.3g，TEMED 50μl，丙烯酰胺9.67g，甲叉双丙烯酰胺0.33g和木糖40g溶解于去离子水，调整pH到6.5后定溶至100ml。

试剂B：10％过硫酸铵

蛋白电泳操作：

1、按照下表分别取试剂混合均匀后灌入蛋白电泳制胶模具中，检查无泄露后插入制胶梳。室温放置5-60min。

2、观察凝胶凝固后将其转移至电泳槽中，拔去制胶梳并加入等电泳缓冲液后加入蛋白样品并接通电源。约30min后完成电泳。

3、拆卸凝胶，蛋白染色及脱色。

4、本发明缓冲系统制备的凝胶与传统SDS-PAGE各种浓度凝胶的比较，见图2。通过图2可以看到，本发明的电泳缓冲系统与传统SDS-PAGE各种浓度(8％、10％、12％、15％)凝胶相比较，本发明的电泳缓冲系统能够使电泳条带分布更为清晰、均匀，在应用单一浓度的条件下，其条带分布特点与梯度凝胶(4-20％)相类似，但是便捷性和经济性有了极大的提高。

实施例三、凝胶缓冲体系的制备

试剂A：称量三羟甲基氨基甲烷3.6g，甘氨酸1.5g，天冬酰胺0.2g，TEMED 50μl，丙烯酰胺3.87g，甲叉双丙烯酰胺0.13g和木糖10g溶解于去离子水，调整pH到6.7后定溶至100ml。

试剂B：称量三羟甲基氨基甲烷3.6g，甘氨酸2.5g，天冬酰胺0.3g，TEMED 50μl，丙烯酰胺9.67g，甲叉双丙烯酰胺0.33g和木糖40g溶解于去离子水，调整pH到6.7后定溶至100ml。

试剂C：10％过硫酸铵

蛋白电泳操作：

1、按照下表分别取试剂混合制备分离胶和浓缩胶。

2、按上表分别配制分离胶和浓缩胶，灌入分离胶后立即将浓缩胶灌入蛋白电泳制胶模具中，检查无泄露后插入制胶梳。室温放置5-60min。

3、观察凝胶凝固后将其转移至电泳槽中，拔去制胶梳并加入电泳缓冲液后加入蛋白样品并接通电源。约30min后完成电泳。

4、拆卸凝胶，蛋白染色及脱色。

5、本发明缓冲系统制备凝胶在TGS、MES、TAS、MOPS等4种不同电泳运行缓冲液中的电压、电流、温度、pH、运行速度等指标的变化，见图3。本发明缓冲系统制备凝胶在TGS、MES、TAS、MOPS等4种不同电泳运行缓冲液中的电压、电流、温度、pH、运行速度等指标的变化，可以看到在同样电压条件下，本发明的电泳缓冲系统电流较大，因而电泳速度较快，同时电泳槽内的pH和温度的变化相对较小。有利于提高更稳定的电泳运行条件。

实施例四、凝胶缓冲体系的制备

试剂A：称量三羟甲基氨基甲烷7.2g，甘氨酸3.0g，天冬酰胺0.4g，TEMED 100μl和木糖20g溶解于去离子水，调整pH到7.0后定溶至100ml。

试剂B：丙烯酰胺7.74g，甲叉双丙烯酰胺0.26g，定溶至100ml。

试剂C：称量三羟甲基氨基甲烷7.2g，甘氨酸5g，天冬酰胺0.6g，TEMED 100μl和木糖50g溶解于去离子水，调整pH到7.0后定溶至100ml。

试剂D：丙烯酰胺19.34g和甲叉双丙烯酰胺0.66g定溶至100ml。

试剂E：10％过硫酸铵

蛋白电泳操作：

1、按照下表分别取试剂混合制备分离胶和浓缩胶。

2、按上表分别配制分离胶和浓缩胶后，灌入分离胶胶混合液后立即将浓缩胶灌入蛋白电泳制胶模具中，检查无泄漏后插入制胶梳。室温放置5-60min。

3、观察凝胶凝固后将其转移至电泳槽中，拔去制胶梳并加入TGS/MES/MOPS/TAS等电泳缓冲液后加入蛋白样品并接通电源。约15-30min后完成电泳。

4、拆卸凝胶，蛋白染色及脱色。

5、本发明缓冲系统制备凝胶在电泳中的分辨率分析。标准品选择Proteinladder：Thermo spectraTM Prestained protein ladder Part No.26616，分析软件为image J，分析结果见图4。通过对传统电泳缓冲系统和本发明所涉及电泳缓冲系统电泳结果图片扫描分析，可以看到，本发明所涉及电泳缓冲系统电泳条带的扫描峰更为清晰、锐利，明显优于传统电泳缓冲系统。

实施例五、凝胶缓冲体系的制备

试剂A：称量三羟甲基氨基甲烷4.2g，甘氨酸3.0g，N,N-二羟乙基甘氨酸2g，天冬酰胺2g，TEMED 100μl和木糖20g溶解于去离子水，调整pH到7.5后定溶至100ml。

试剂B：丙烯酰胺7.74g和甲叉双丙烯酰胺0.26g，定溶至100ml。

试剂C：称量三羟甲基氨基甲烷5.0g，甘氨酸5g，N,N-二羟乙基甘氨酸2g，天冬酰胺2g，TEMED 100μl和木糖40g溶解于去离子水，调整pH到7.5后定溶至100ml。

试剂D：丙烯酰胺19.34g和甲叉双丙烯酰胺0.66g定溶至100ml。

试剂E：10％过硫酸铵。

蛋白电泳操作：

1、按照下表分别取试剂混合制备分离胶和浓缩胶。

2、按上表分别配制分离胶和浓缩胶，灌入分离胶胶混合液后立即将浓缩胶灌入蛋白电泳制胶模具中，检查无泄露后插入制胶梳。室温放置5-60min。

3、观察凝胶凝固后将其转移至电泳槽中，拔去制胶梳并加入TGS/MES/MOPS/TAS等电泳缓冲液后加入蛋白样品并接通电源。约15-30min后完成电泳。

4、拆卸凝胶，蛋白染色及脱色。

5、本缓冲系统制备电泳凝胶的稳定性分析，分别将本发明缓冲系统与传统的SDS-PAGE缓冲系统放置于37℃和60℃环境中保存24-576小时，观察凝胶时间。参见图5，通过对比本发明电泳缓冲系统与传统电泳缓冲系统的稳定性可以看出，在分别采用37℃和60℃的破坏实验中，本发明所涉及的缓冲系统具有更好的凝胶稳定性。

实施例六、凝胶缓冲体系的制备

试剂A：称量三乙醇胺6ml，甘氨酸3.0g，N,N-二羟乙基甘氨酸2g，一水吗啉乙磺酸1g，天冬酰胺2g，TEMED 100μl和木糖20g溶解于去离子水，调整pH到8.8后定溶至100ml。

试剂B：丙烯酰胺7.74g和甲叉双丙烯酰胺0.26g，定溶至100ml。

试剂C：称量三乙醇胺7.2ml，甘氨酸5g，N,N-二羟乙基甘氨酸3g，一水吗啉乙磺酸1.5g，天冬酰胺2g，TEMED 100μl和木糖40g溶解于去离子水，调整pH到8.8后定溶至100ml。

试剂D：丙烯酰胺19.34g和甲叉双丙烯酰胺0.66g定溶至100ml。

试剂E：10％过硫酸铵

蛋白电泳操作：

1、按照下表分别取试剂混合制备分离胶和浓缩胶。

2、按上表分别配制分离胶和浓缩胶，灌入分离胶胶混合液后立即将浓缩胶灌入蛋白电泳制胶模具中，检查无泄露后插入制胶梳。室温放置5-60min。

3、观察凝胶凝固后将其转移至电泳槽中，拔去制胶梳并加入TGS/MES/MOPS/TAS等电泳缓冲液后加入蛋白样品并接通电源。约15-30min后完成电泳。

4、拆卸凝胶，蛋白染色及脱色。

5、本发明缓冲系统在分子量标准曲线的线性分析中的应用；标准品选择Proteinladder：Thermo spectraTM Prestained protein ladder Part No.26616，分析软件为EXCEL，分析结果见图6。比较本发明电泳缓冲系统和传统电泳缓冲系统的分子量标准曲线，可以看到在本发明电泳缓冲系统制备的凝胶中，标准蛋白的分布更符合线性，其相关系数明显优于传统电泳缓冲系统。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。