一种检测母猪妊娠及怀胎数量的方法

摘要

本发明涉及一种检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括：在母猪配种后的第7‑‑14天，采集猪血或尿液；将猪的促类人绒毛膜性腺激素HCG‑‑LIKE检测试纸插入血清或者尿液中5‑‑10秒，于15‑18分钟后，质控线C及检测线T都显色，与HCG‑‑LIKE比色卡进行对比，即可检测母猪是否怀孕，再依据HCG‑‑‑LIKE水平，检测出怀胎数量，解决了现有技术仅能判断猪是否妊娠，但却不能反应胚胎是否存活及怀胎数量，从而带来假妊娠或空怀胎，以及怀胎数量极低所造成的经济损失等问题。以便尽早淘汰问题母猪，同时对正常的妊娠母猪进行对应的饲养和管理，提高猪的繁殖效率和养殖效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，属于动物检测方法技术领域。

背景技术

目前，猪的妊娠检测主要通过公猪试情法来完成，即在母猪配种后18至24天，用性欲旺盛的成年公猪试情，若母猪拒绝公猪接近，并在公猪试情后3-4天不出现发情，可初步确定母猪妊娠，此法的判断准确率为90.34%，但未妊娠的判断准确率较低，仅36.07%。

现有技术中的：1）超声波检测是利用超声波的物理特性，与动物组织结构的声学特点密切结合进行的检测，在配种22天后进行早孕诊断，准确率可达100%，但由于超声波检测价格较高，在猪妊娠诊断中应用不多。2）D型超声波诊断法又称超声多普勒探查法，是利用物体在运动时声波的频率会发生改变的物理特性进行的检测，准确率达100%。3）直肠触诊法是选择身材矮小的女性操作，把手伸入大型的经产母猪直肠，掏出粪便，触摸子宫，妊娠母猪子宫内有羊水，子宫动脉搏动有力，而未妊娠母猪子宫动脉无羊水，弹性差，子宫动脉搏动很弱，容易判断是否妊娠，可在母猪配种后25天内诊断妊娠，准确率达95-100%，但是只适用于大白、长白等大型品种的经产母猪，操作者手掌须小，体力消耗较大，目前多数猪场并未采用此法。4）阴道检查法是母猪配种后3-4周，一直未返情，用阴道开膣器打开阴道，观察阴道内膜的颜色、质地、粘液等变化，妊娠母猪的阴道苍白、干涩，子宫口紧闭，有极强的胶状物密封；而未妊娠母猪的阴道内膜在临近卵泡期表现湿润，有浅红或潮红，分泌物稀薄，由此可以分辨是否妊娠，但此法对阴道炎、子宫炎和假孕母猪的诊断，往往准确性很低，所以在生产中应用不多。5）放射免疫测定法（RIA）是一种将同位素的放射测量与免疫反应原理相结合的微量分析方法，母猪在妊娠12天开始产生雌激素，主要是雌酮，在胎儿体内转变为结合状态的硫酸雌酮（E1S），并进入母体血液循环，据此可用RIA于配种后25-30天采血测定E1S 含量进行猪的早期妊娠诊断，放射免疫测定法（RIA）的局限性是用同位素3H标记，必须用液闪仪器测量，易受放射性物质的污染，仪器要求高，实验室要求严格，无法在生产现场进行，不能当日看到结果。6）酶免疫测定法（EIA）是用酶标记孕酮，根据肉眼观察酶作用于底物产生颜色反应的深浅进行定性试验，也可通过分光光度计或酶标读数器读取底物液的光密度值，然后计算P4浓度进行定量诊断，还可测定血清中E1S 含量进行妊娠诊断，EIA没有放射性危害，所用主要仪器是离心机和分光光度计，试剂便宜，方法简单，灵敏度和特异性很高，但仅限于实验室中应用，无法应用于生产现场。7）生殖激素诊断法，母猪体内占主导地位的激素是孕酮，它可以拮抗适量的外源性生殖激素，使之不起反应，在配种后的第1个发情周期即将来临之前，注射适量外源性生殖激素，根据妊娠母猪对某些外源性生殖激素有无特定反应来判断是否妊娠：妊娠母猪不表现发情症状，未孕母猪在外源性激素和卵巢激素共同作用于靶器官，发情的外部表现更为明显，受各种因素的限制（如仪器、药品等），还不能有效地在生产实践中推广应用，目前还处于研究阶段，有待进一步验证其可靠性和准确率。

因此，有必要研究能快速、准确并能在生产现场易于操作的猪是否妊娠检测技术正向着方向发展。产生出一种理想、高效的早期妊娠诊断方法，从而提高母猪繁殖力和养猪业的经济效益，推动养猪业的迅速发展。是猪生产高质量发展的必然趋势。

因此，有必要对现有技术加以改进。

发明内容

本发明正是为解决现有技术存在的上述不足，提供一种检测检测猪早期妊娠的方法，以准确掌握猪是否妊娠以及其胚胎是否存活，与胚胎的数量，减少猪假妊娠、空怀胎所造成的经济损失，缩短母猪的非繁殖天数，及时对妊娠母猪进行合理的饲养和管理，提高繁殖效率，促进猪的集约化管理，提高猪的生产效益。

本发明通过下列技术方案完成：一种检测猪早期妊娠的方法，其特征在于包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第7--14天，采集1--10 ml母猪血于阴凉处静置1-2小时，分离出血清，或者收集母猪在上次小便后1-2小时再小便的尿液1-10ml；

2）将猪的类人促绒毛膜性腺激素HCG--LIKE检测试纸插入步骤1）的血清或者尿液中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效，需要重新检测；

试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母猪的促类人绒毛膜性腺激素HCG--LIKE水平低下，需要隔日进行检测；

试纸质控线C及检测线T都显色，将该显色与促类人绒毛膜性腺激素HCG--LIKE比色卡进行下列对比；

31）当促类人绒毛膜性腺激素HCG—LIKE＜10mIU/ml，需要再次重复步骤1）-2），两次检测促类人绒毛膜性腺激素HCG—LIKE持续＜10mIU/ml,表明母猪没有怀孕或胚胎停育；

32）当促类人绒毛膜性腺激素HCG--LIKE≧10mIU/ml, 表明母猪可能怀孕，需要每隔一天重复步骤1）-2）进行一次检测，连续检测两次；当两次检测结果的促类人绒毛膜性腺激素HCG--LIKE在上升，且后一次的促类人绒毛膜性腺激素HCG--LIKE是前一次的促类人绒毛膜性腺激素HCG--LIKE的1-2倍，表明母猪怀孕，且为活胎，然后再按下列判断胎数；

当HCG---LIKE为 15—30mIU/ml，表明母猪怀单胎；

当HCG---LIKE为 35--60mIU/ml，表明母猪怀双胎；

当HCG---LIKE为 65 --125mIU/ml，表明母猪怀三胎；

当HCG---LIKE为 130 --250mIU/ml，表明母猪怀四胎；

当HCG---LIKE为 255 --500mIU/ml，表明母猪怀五胎，

当HCG---LIKE为 505 --1000mIU/ml，表明母猪怀六胎，

当HCG---LIKE为 1005 --2000mIU/ml，表明母猪怀七胎，

当HCG---LIKE为 2005 --4000mIU/ml，表明母猪怀八胎，

当HCG---LIKE>4000mIU/ml，表明母猪怀九胎或九胎以上。

所述步骤2）猪的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸经过下列方法制备：

21）按下列制备各组分：

金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml、加入到100ml质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液中，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；

封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；

样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；

胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；

HCG包被液：将100-200mg猪的类人促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCG—LIKEmAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG---LIKE包被液；

IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01MPBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；

22）在底板上划膜

22A）将NC膜贴在PVC板上表面的中部，得底板；

22B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将IgG包被液均匀地划在步骤22A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将HCG---LIKE包被液均匀地划在NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；

23）金垫制备

23A）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、1.5-2mg LH单克隆抗体LHmb2，搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀；

23B）将40ml胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm

24）样本垫制备

24A）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜SB06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；

25）贴板

25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；

25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；

25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；

26）将步骤25C）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得猪的类促绒毛膜性腺激素HCG--LIKE检测试纸。

本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可在母猪配种后的第7--14天，取血样或尿样，对猪是否妊娠以及怀胎数量进行简单、方便、快速、准确的检测，更早地知道母猪是否妊娠、胚胎是否存活以及怀胎数量，解决了现有技术仅能判断猪是否妊娠，但却不能反应胚胎是否存活及怀胎数量，从而带来假妊娠或空怀胎，以及怀胎数量极低所造成的经济损失等问题。以便尽早淘汰问题母猪，同时对正常的妊娠母猪进行对应的饲养和管理，提高猪的繁殖效率和养殖效益。

附图说明

图1为HCG---LIKE检测试纸条的结构示意图；

图2为HCG---LIKE比色卡图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

猪的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸经过下列方法制备：

1）按下列制备各组分：

11）金溶液：将质量浓度为1%的氯金酸溶液2ml，加入到100ml质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液中，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；

12）封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul医用级碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；

13）样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；

14）胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；

15）HCG---LIKE包被液：将100-200mg猪的类人促绒毛膜性腺激素单克隆α亚级抗体HCG-----LIKE mAbCoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得HCG---LIKE包被液；

16）IgG包被液：将羊抗鼠IgG抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01M PBS缓冲液100ml中，混合均匀，得IgG包被液；

上述各组分的量是用于5块6cm×30cm的PVC板，每块PVC板切为100条6cm× 3mm的试纸条；

2）在底板上划膜

2A）将NC膜贴分别贴在5块PVC板上表面的中部，得底板；

2B）用XYZ3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将步骤16）的IgG包被液均匀地划在5块步骤2A）底板上的NC膜的上端作为质控线C，将步骤15）的HCG---LIKE包被液均匀地划在5块步骤2A）底板上的NC膜的下端作为检测线T，质控线C与检测线T相距6mm±1mm，质控线C距离NC膜上端8mm±1mm，检测线T距离NC膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；

3）金垫制备

3A）在100ml步骤11）的金溶液中加入1.2ml 碳酸钾溶液、2mg LH单克隆抗体LHmb2，搅拌40min，滴加330ul步骤12）的封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 步骤14）的胶体金结合物稀释液混匀，得45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液；

3B）将45.3ml胶体金结合物稀释液的混合液均匀铺在5块玻璃纤维素膜RB65上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为6mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；

4）样本垫制备

4A）按30ml/张的量，将步骤13）的样本垫处理液均匀铺在5块玻璃纤维素膜SB06上，每块玻璃纤维素膜RB65尺寸为20mm×30cm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；

25）每一块贴板的制备

25A）将步骤23）的金垫贴于步骤22B）划膜板的NC膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在NC膜上；

25B）将步骤24）的样本垫贴于步骤25A）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于PVC板前端；

25C）将吸水垫贴于25B）的PVC板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在NC膜后端；

26）将步骤5C）的每一块贴板切割成100条6cm×3mm的试纸条，装盒，共得500条类人促绒毛膜性腺激素HCG--LIKE检测试纸，每一条类人促绒毛膜性腺激素HCG--LIKE检测试纸的结构如图1。

实施例2

检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第7天，利用采血针与抗凝血管从母猪颈脖静脉处采集1ml母猪血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；

2）将一条实施例1的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸插入步骤1）的血清中5秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C未显色、检测线T显色，表明检测结果无效；

当即重复步骤1）-2），观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色，显色结果如下：

试纸质控线C显色，检测线T未显色，表明母猪的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE水平低下，母猪没有怀孕，等待下一个发情期再配种。

实施例3

检测检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第8天，利用采血针与抗凝血管从母猪颈脖静脉处采集1ml母猪血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；

2）将一条实施例1的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸插入步骤1）的血清中5秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C显色，检测线T未显色，仅表明猪的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE水平正常，二天后重复步骤1）-2）进行检测，结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG---LIKE比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）连续两次检测类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE＜10mIU/ml,表明母猪胚胎停育，等待下一个发情期再配种。

实施例4

检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第12天，收集母猪在上次小便后2小时再小便的尿液5ml；

2）将一条实施例1的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸插入步骤1）的尿液中9秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG---LIKE比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE大于10mIU/ml, 表明母猪可能怀孕，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测，连续检测两次，且后一次的HCG---LIKE为40 mIU/ml是前一次的HCG---LIKE为20 mIU/ml的2倍，表明母猪怀孕，且为活胎，因HCG---LIKE为40mIU/ml，表明母猪怀双胎，只能淘汰。

实施例5

检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第10天，收集母猪在上次小便后1小时再小便的尿液5ml；

2）将一条实施例1的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸插入步骤1）的尿液中8秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE大于10mIU/ml, 表明母猪可能怀孕，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测，连续检测两次，且后一次的HCG---LIKE为1000 mIU/ml是前一次的HCG---LIKE为500 mIU/ml的2倍，表明母猪怀孕，且为活胎，因HCG---LIKE为1000 mIU/ml，表明母猪怀六胎，考虑经济效益，只能淘汰。

实施例6

检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第14天，收集母猪在上次小便后1小时再小便的尿液5ml；

2）将一条实施例1的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸插入步骤1）的尿液中8秒，取出，于17分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE大于10mIU/ml, 表明母猪可能怀孕，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测，连续检测两次，且后一次的HCG---LIKE为4000 mIU/ml是前一次的HCG---LIKE为2000 mIU/ml的2倍，表明母猪怀孕，且为活胎，因HCG---LIKE为4000 mIU/ml，表明母猪怀八胎，按常规对母猪进行妊娠饲养，直至115天后产小猪头8头。

实施例7

检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第10天，收集母猪在上次小便后1小时再小便的尿液5ml；

2）将一条实施例1的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸插入步骤1）的尿液中8秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE大于10mIU/ml, 表明母猪可能怀孕，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测，连续检测两次，且后一次的HCG---LIKE为5000 mIU/ml是前一次的HCG---LIKE为2500 mIU/ml的2倍，表明母猪怀孕，且为活胎，因HCG---LIKE为5000 mIU/ml，表明母猪怀九胎以上，按常规对母猪进行妊娠饲养，直至115天后产小猪头12头。

实施例8

检测母猪妊娠及怀胎数量的方法，包括下列步骤：

1）在母猪配种后的第10天，收集母猪在上次小便后1小时再小便的尿液5ml；

2）将一条实施例1的类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE检测试纸插入步骤1）的尿液中8秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线C与检测线T是否显色：

3）显色结果如下：

试纸质控线C及检测线T都显色，用该显色与HCG比色卡如图2所示，进行下列对比；

31）类人促绒毛膜性腺激素HCG---LIKE大于10mIU/ml, 表明母猪可能怀孕，每隔一天重复步骤1）、2）进行一次检测，连续检测两次，且后一次的HCG---LIKE为8000 mIU/ml是前一次的HCG---LIKE为4000 mIU/ml的2倍，表明母猪怀孕，且为活胎，因HCG---LIKE为1000 mIU/ml，表明母猪怀九胎以上，因HCG---LIKE为8000 mIU/ml，表明母猪怀九胎以上，按常规对母猪进行妊娠饲养，直至115天后产小猪头15头。

上述HCG---LIKE比色卡均为常规产品。

下面通过对比实验证明本发明的效果：

采用实施例2-8的方法，分别对210头母猪进行检测，其中将210头猪分为七组，每组30头，分别用与实施例2-8相同的方法进行检测，检测结果如下：

第一组有28头怀孕，淘汰2头没有怀孕的母猪，28头怀孕母猪虽为活胎，但怀胎数量低于8的母猪为4头，只能淘汰，余下的24头母猪共产仔264头，平均产仔11头；

第二组有24头怀孕，淘汰6头没有怀孕的母猪，怀孕母猪虽为活胎，但怀胎数量低于8的母猪为6头，只能淘汰，余下的18头母猪共产仔216头，平均产仔12头；

第三组有25头怀孕，有20头活胎，5头胚胎停育、 5头没有怀孕，均淘汰，20头母猪共产仔200头，平均产仔10头；

第四组有27头怀孕，有25头活胎，2头胚胎停育，3头没有怀孕，淘汰，25头母猪产仔255头，平均产仔10.2头。

第五组29头怀孕，且为活胎，1头未怀孕，3头母猪怀胎数量不足8，淘汰，26头母猪共产仔263头，平均产仔10.11头。

第六组29头怀孕，28头活胎，1头未怀孕、1头胚胎停孕、3头怀胎数量不足8胎，均淘汰，25头母猪共产仔276头，平均产仔11.04头。

第七组26头怀孕，且为活胎，4头未怀孕，5头怀胎数量不足8胎，均淘汰，21头母猪共产仔236头，平均产仔11.23头。

通过本发明可对怀孕母猪的胎数进行检测，胎数量不足8胎的，可选择淘汰，以确保养殖场的经济效益，解决胎数过少增加养殖成本的问题。