一种肝癌肿瘤标志物及其应用

摘要

本发明涉及一种肝癌肿瘤标志物及其应用，所述肝癌肿瘤标志物氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，肝癌肿瘤标志物可应用在肝癌诊断领域中；本发明还涉及上述肝癌肿瘤标志物的检测引物对，具有如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列和如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列，可作为肝癌诊断试剂应用在肝癌诊断领域中。本发明能够简便快速准确地检测肝癌肿瘤标志物，提高肝癌早期诊断水平，适于大规模推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝癌肿瘤标志物及其应用。

背景技术

全球肝癌的发病率一直在上升。至2018年，原发性肝癌已经上升为全球第五大最常见的癌症，因原发性肝癌预后不佳，死亡率有所增加，占全部癌症的死亡率为8.2％。当前，无创性肝硬度检测，肝脏彩色多普勒超声、血清甲胎蛋白、血清高尔基体蛋白73、包括肝脏CT、MRI成为目前肝癌早期诊断、治疗随访的主要手段。但肝细胞癌恶性度高，起病相对隐匿，大多数病例首次确诊时已经存在肝内多发转移、血管和淋巴结侵犯，其他脏器多发转移甚至恶液质等相关情况，在初次就诊时就已错过了最佳手术时机，而符合肝癌切除标准的一些少数病例即便已经成功的切除了肿瘤，但是还需要辅助多次介入治疗、射频消融治疗、分子靶向药物、传统中医中药等综合治疗。即使经过多学科综合治疗，肝细胞癌患者的长期预后仍然很差。而且肝癌术后复发早，一旦复发则进展快，缺少特异性的治疗方法。上述情况需要我们能够对于肝细胞癌出现和进展期癌有关基因的调控和信号转导通路里起到的作用给予深入研究，希望及早对肝细胞癌进行诊断，在初次确诊、预测生存期的同时，找到改善预后的相关方法。基于此，本发明提出一种肝癌肿瘤标志物，其能够使得肝癌诊断简便准确快速，提高肝癌早期诊断水平。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种肝癌肿瘤标志物，使得肝癌诊断简便准确快速,提高肝癌早期诊断水平，适于大规模推广应用。

本发明的第二目的是提供上述肝癌肿瘤标志物的检测引物对，其能够简便快速准确地检测肝癌肿瘤标志物，提高肝癌早期诊断水平。

本发明的第三目的是提供上述肝癌肿瘤标志物的应用。

本发明的第四目的是提供上述肝癌肿瘤标志物的检测引物对的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种肝癌肿瘤标志物，所述肝癌肿瘤标志物氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，上述肝癌肿瘤标志物，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

二、根据上述的肝癌肿瘤标志物在作为肝癌诊断试剂中的应用。

三、一种肝癌肿瘤标志物的检测引物对，所述肝癌肿瘤标志物的检测引物对具有如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列和如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列。

四、根据上述的肝癌肿瘤标志物的检测引物对在作为肝癌诊断试剂中的应用。

采用上述技术方案的积极效果：

(1)本发明提供一种肝癌肿瘤标志物，可作为肝癌诊断试剂应用在肝癌诊断领域中，其能够使得肝癌诊断简便准确快速，提高肝癌早期诊断水平，适于大规模推广应用；

(2)本发明还提供上述肝癌肿瘤标志物的检测引物，可作为肝癌诊断试剂应用在肝癌诊断领域中，其能够简便快速准确地检测肝癌肿瘤标志物，提高肝癌早期诊断水平，适于大规模推广应用。

附图说明

图1是采用定量RT-PCR检测HOXB13基因在50例肝癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图；

图2是肝细胞癌Hep3B，Huh-7细胞系以及HL-7702正常肝细胞系进行细胞培养后，进行WB表达定性以及定量示意图；

图3是表达HOXB13的慢病毒表达质粒Hep3B细胞组(Lenti-HOXB13)、空载体对照组(Lenti-con)以及空白组(Blank)中HOXB13表达水平示意图。

图4是应用沉默RNA技术敲低HOXB13基因Huh7细胞系，空白组、对照组、siRNA1、siRNA2的Huh7细胞中HOXB13的表达水平示意图；

图5是过表达HOXB13基因的肝癌细胞系Hep3B，和敲低HOXB13的Huh-7细胞系生长变化示意图；

图6是过表达HOXB13基因的肝癌细胞Hep3B细胞系增殖能力示意图；

图7是敲低HOXB13基因的Huh-7细胞系的增殖能力示意图；

图8是过表达HOXB13基因的Hep3B细胞系侵袭能力变化示意图；

图9是敲低HOXB13基因的Huh-7细胞系侵袭能力变化示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

为了使得肝癌诊断简便准确快速，提高肝癌早期诊断水平，本发明提供了一种肝癌肿瘤标志物，所述肝癌肿瘤标志物氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，上述肝癌肿瘤标志物的核苷酸序列可以根据需要确定，较佳地，所述肝癌肿瘤标志物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因即为HOXB13基因，homeobox B13。

本发明还提供了上述肝癌肿瘤标志物的检测引物对，所述肝癌肿瘤标志物的检测引物对具有如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列和如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述的肝癌肿瘤标志物在作为肝癌诊断试剂中的应用。

本发明还提供了上述的肝癌肿瘤标志物的检测引物对在作为肝癌诊断试剂中的应用。

实施例1

本实施例说明定量RT-PCR检测HOXB13基因在肝癌组织中的表达情况。

1、组织分离：实验用组织来源于原发性肝细胞癌的手术病人。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。

2、核糖核酸(RNA)的抽提：用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，提取方法参照Trizol试剂盒说明书。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。

3、cDNA的合成：

(1)冰浴离心管里面加入模板RNA4μL(0.5μg/μL)，20pmol/μL的随机引物2μL，去离子水5μL，混匀，离心3-5秒；

(2)70℃水浴5分钟，冰浴30秒；

(3)加入5×M-MLV逆转录酶反应液4μL，RNase抑制剂1μL，dNTP2μL(100mM)，混匀；

(4)37℃水浴5分钟，加入1μL M-MLV反转录酶(200酶活性单位/μL)，混匀；

(5)37℃水浴1小时；

(6)70℃，10分钟结束反应，产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70℃保存。

4、定量RT-PCR的引物设计及扩增

根据SEQ ID NO:1所示的HOXB13基因序列设计引物对，所述肝癌肿瘤标志物的检测引物对具有如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列和如SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列，具体参见表1。另外，以GAPDH作为内对照，其扩增引物对分别如表1所示的核苷酸序列。

表1.Real time PCR引物序列

实验仪器及试剂：Thermal Cycler DiceTM Real Time System TP800，Takara；Premix Ex TaqTM，Takara。

PCR的反应体系：总体积20μL，SYBR Premix Ex Taq 10μL，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，cDNA1μL，ddH

5、实验结果：实验结果参见图1，由图1可以看出，HOXB13基因在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织中的表达水平，经t检验，p值小于0.05(有统计学意义)。

实施例2

本实施例说明采用定量RT-PCR检测HOXB13基因在过表达肝癌细胞系Hep3B中的表达情况。

选取肝细胞癌Hep3B，Huh-7细胞系以及HL-7702正常肝细胞系，进行细胞培养后，进行WB表达定性以及定量。其中所述细胞株来源于中国科学院上海细胞库。

按照实施例1的方法提取不同肝癌细胞株RNA，反转录合成cDNA，以GAPDH作为内对照，以合成的不同肝癌细胞株cDNA为模板，按照实施例1所述方法进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图2。

由图2可见，HOXB13基因蛋白在Hep3B，Huh-7细胞系中高表达，在HL-7702正常肝细胞系仅有较弱的表达。

实施例3

构建针对HOXB13的SiRNA，具体序列见表2，对肝癌细胞株进行敲减，设置空载体(vector)作为阴性对照。

表2 HOXB13 siRNA序列

利用脂质体(Lipofectamine 2000)转染试剂分别将2种HOXB13 siRNA、阴性对照(NC)siRNA、空慢病毒表达载体(Lenti-con)、表达HOXB13的慢病毒表达质粒(Lenti-HOXB3)按终浓度50nmol/L分别转染进Huh-7细胞以及Hep3B细胞中，用含10％胎牛血清的DMEM培养。按照实施例1所述方法提取不同肝癌细胞株RNA，反转录合成cDNA，以GAPDH作为内对照，以合成的不同肝癌细胞株cDNA为模板，按照实施例1所述方法进行定量RT-PCR实验检测HOXB13基因在肝癌细胞株Hep3B细胞以及Huh7细胞中的表达，结果见图3以及图4。

图3是表达HOXB13的慢病毒表达质粒Hep3B细胞组(Lenti-HOXB13)、空载体对照组(Lenti-con)以及空白组(Blank)中HOXB13表达水平。

图4是应用沉默RNA技术敲低HOXB13基因Huh7细胞系，空白组(Blank)、对照组(siRNA-con)、siRNA1(转染siRNA1)组、siRNA2(转染siRNA2)组的Huh7细胞中HOXB13的表达水平示意图。

96孔板中每孔接种3×10

由图5结果可见，与对照组(NC)相比，过表达HOXB13基因的慢病毒组(lenti-HOXB13)细胞生长数量增多，过表达HOXB13基因促进Hep3B细胞系生长，沉默HOXB13基因够抑制肝癌细胞系Huh7细胞系细胞的生长，结果表明人HOXB13基因的表达上调能在一定程度上促进肝癌细胞生长，而敲低HOXB13基因抑制肝癌细胞生长。

实施例4

通过荧光免疫染色的方法，对细胞分别进行Ki67染色，DAPI染色，然后合并对比Ki67与DAPI染色。Ki67是一种在细胞核内表达的蛋白，虽然其确切的生物学作用目前尚不清楚，但其表达有个特点，即只有在进入细胞周期(G1,S,G2和M)才表达，在G0期不表达或者极低水平表达，由于Ki67表达与细胞进入周期有严格的对应关系，被认为是细胞进入细胞周期的一个理想标记物，因此广泛应用于鉴定细胞周期，但Ki67染色只能区分G0期和已经进入细胞周期的细胞，并不能区分已经进入细胞周期的各个时相(G1,S,G2和M)。而DAPI是与DNA有较强亲和力的荧光染料，能区分DNA合成前(G0和G1,2CDNA)、合成时(G2和2C-4CDNA，)与合成后(G2和M，4C DNA)的细胞，因此，利用ki67与DAPI双染色能区分细胞不同周期。具体见表3，能简单高效的分别G0/G1期。

表3

具体步骤：

1)石蜡切片脱蜡：烘烤切片后按如下顺序在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各放20min,100％乙醇Ⅰ、100％乙醇Ⅱ、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各放3分钟，流水冲片明亮为止。

2)抗原水煮修复：准备柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.0)0.01mol/l，在95℃水温中放置15-20min，随后令其自然冷却。

3)先后置于PBS(pH＝7.2－7.4)中清洗三次，清洗时间6－9min。

4)滴加一抗(Santa ki67 G-a-R 1:50)，组织面完全覆盖，整个过程确保组织湿润，免疫组化湿盒中加水，然后将切片放入水中，放入冰箱，温度控制在4℃，过夜。

5)次日将此盒放于37℃环境回温20分钟，置于PBS中清洗三遍，清洗时间6－9min。

6)加入二抗(Jacson M-a-G Cy3 1:400)，置于37℃环境2h。

7)置于PBS(pH＝7.2－7.4)中清洗三次，清洗时间6－9min。

8)滴加DAPI染核，37℃5-10min。

9)清洗掉DAPI，滴入10μl抗荧光衰减封片剂，使用无菌盖玻片封片，最后做镜检。

通过荧光免疫染色的方法，对过表达HOXB13基因的Hep3B细胞以及沉默HOXB13基因的Huh-7细胞组分别进行Ki67染色，DAPI染色，然后合并对比，见图6以及图7。由图6结果可见过表达HOXB13的肿瘤细胞处于增殖期的细胞明显增多，图7结果可见敲低HOXB13肿瘤细胞处于增殖期的细胞明显减少。

实施例5

此实验是在培养板中放入Transwell小室，Transwell小室底部是一层特殊的具有通透性的滤膜，滤膜带有微孔，微孔的孔径从0.1um到12um不等，实验不同滤膜孔径也不尽相同，滤膜材质也可视情况而定，不过通常选用聚碳酸酯膜。在培养板中放置Transwell小室，小室外及培养板内称下室，其外称为上室，Tanswell的上下室内盛装相对应的培养液，上下层用聚碳酸酯膜分割开来。把即将研究的细胞种于上室内，因聚碳酸酯膜通透性强，使得下层培养液的成分能够通过滤膜影响上室细胞，故此能够研究由下层培养液中的物质成分对上层细胞的生长、迁移、侵袭等造成的影响。根据滤膜的不同孔径及不同处理的聚碳酸酯膜，则能够实现细胞的共培养实验并且能够延伸出细胞迁移、趋化、侵袭等多种方面的研究方向。

以下为本实验使用的Transwell方法检测肿瘤细胞的侵袭具体步骤：

1)按转染的操作步骤在六孔板中转染处于对数期的肝癌细胞Hep3B以及Huh-7细胞系，设计分为转染组及对照组。

2)转染24小时后用胰酶消化各组细胞，通过培养基把细胞从培养板吹落，做成单细胞悬液，将细胞计数以便调整其浓度，在Transwell的上室铺入5*10

3)连续在培养箱内培养24小时后，用移液器除去培养基，加入细胞后用PBS轻轻摇晃，之后在去掉PBS，并重复上述步骤一遍。

4)微量加样器向细胞培养板孔中加500ul的多聚甲醛，同时加入200ul在Transwell小室内，注意多聚甲醛浓度控制在4％，常温固定细胞20分钟。

5)慢慢把上述加入的多聚甲醛吸净，用PBS将使用细胞清洗两遍，使用棉球擦去Transwell小室内部上层的细胞。

6)在细胞培养板内加入500ul 2％的结晶紫溶液，培养孔内再一次放入Transwell小室，令Transwell小室底部滤膜上的细胞完全浸入结晶的紫色溶液内，常温静置15分钟。吸出结晶紫溶液，用PBS仔细清洗两遍，常温静置使小室完全干燥，最后用显微镜观察，同时拍照，共计4-5个视野左右。

参见图8以及图9。

由图8结果可见，过表达HOXB13的慢病毒颗粒转染至肝癌细胞后，肝癌细胞的侵袭能力增强，由图9结果可见，敲低HOXB13水平的癌细胞穿过transwell能力明显下降。

由上述实验结果可以得出结论：1、HOXB13在Hep3B以及Huh-7肝癌细胞系中表达明显高于普通肝癌细胞。2、过表达HOXB13基因对于肝癌细胞的生长、增殖以及侵袭均有促进作用。敲低HOXB13对于肝癌细胞的生长、增殖以及侵袭均有减弱作用。HOXB13基因是促癌基因，可促进肝癌细胞的生长、增殖以及侵袭。

因此，HOXB13基因及其表达产物适合作为诊断肝癌的标志物，使肝癌诊断更加准确、快速，本发明的HOXB13基因及其表达产物作为制备治疗肝癌药物的靶基因为治疗肝癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。

综上所述，本发明的肝癌肿瘤标志物能够使得肝癌诊断简便准确快速，提高肝癌早期诊断水平，适于大规模推广应用。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京市第二医院 南京鼓楼医院

<120> 一种肝癌肿瘤标志物及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 854

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcccg gcaattatgc caccttggat ggagccaagg atatcgaagg cttgctggga 60

gcgggagggg ggcggaatct ggtcgcccac tcccctctga ccagccaccc agcggcgcct 120

acgctgatgc ctgctgtcaa ctatgccccc ttggatctgc caggctcggc ggagccgcca 180

aagcaatgcc acccatgccc tggggtgccc caggggacgt ccccagctcc cgtgccttat 240

ggttactttg gaggcgggta ctactcctgc cgagtgtccc ggagctcgct gaaaccctgt 300

gcccaggcag ccaccctggc cgcgtacccc gcggagactc ccacggccgg ggaagagtac 360

cccagccgcc ccactgagtt tgccttctat ccgggatatc cgggaaccta ccagcctatg 420

gccagttacc tggacgtgtc tgtggtgcag actctgggtg ctcctggaga accgcgacat 480

gactccctgt tgcctgtgga cagttaccag tcttgggctc tcgctggtgg ctggaacagc 540

cagatgtgtt gccagggaga acagaaccca ccaggtccct tttggaaggc agcatttgca 600

gactccagcg ggcagcaccc tcctgacgcc tgcgcctttc gtcgcggccg caagaaacgc 660

attccgtaca gcaaggggca gttgcgggag ctggagcggg agtatgcggc taacaagttc 720

atcaccaagg acaagaggcg caagatctcg gcagccacca gcctctcgga gcgccagatt 780

accatctggt ttcagaaccg ccgggtcaaa gagaagaagg ttctcgccaa ggtgaagaac 840

agcgctaccc ctta 854

<210> 2

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Pro Gly Asn Tyr Ala Thr Leu Asp Gly Ala Lys Asp Ile Glu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Gly Arg Asn Leu Val Ala His Ser Pro

20 25 30

Leu Thr Ser His Pro Ala Ala Pro Thr Leu Met Pro Ala Val Asn Tyr

35 40 45

Ala Pro Leu Asp Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro Lys Gln Cys His

50 55 60

Pro Cys Pro Gly Val Pro Gln Gly Thr Ser Pro Ala Pro Val Pro Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Gly Gly Gly Tyr Tyr Ser Cys Arg Val Ser Arg Ser Ser

85 90 95

Leu Lys Pro Cys Ala Gln Ala Ala Thr Leu Ala Ala Tyr Pro Ala Glu

100 105 110

Thr Pro Thr Ala Gly Glu Glu Tyr Pro Ser Arg Pro Thr Glu Phe Ala

115 120 125

Phe Tyr Pro Gly Tyr Pro Gly Thr Tyr Gln Pro Met Ala Ser Tyr Leu

130 135 140

Asp Val Ser Val Val Gln Thr Leu Gly Ala Pro Gly Glu Pro Arg His

145 150 155 160

Asp Ser Leu Leu Pro Val Asp Ser Tyr Gln Ser Trp Ala Leu Ala Gly

165 170 175

Gly Trp Asn Ser Gln Met Cys Cys Gln Gly Glu Gln Asn Pro Pro Gly

180 185 190

Pro Phe Trp Lys Ala Ala Phe Ala Asp Ser Ser Gly Gln His Pro Pro

195 200 205

Asp Ala Cys Ala Phe Arg Arg Gly Arg Lys Lys Arg Ile Pro Tyr Ser

210 215 220

Lys Gly Gln Leu Arg Glu Leu Glu Arg Glu Tyr Ala Ala Asn Lys Phe

225 230 235 240

Ile Thr Lys Asp Lys Arg Arg Lys Ile Ser Ala Ala Thr Ser Leu Ser

245 250 255

Glu Arg Gln Ile Thr Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Val Lys Glu Lys

260 265 270

Lys Val Leu Ala Lys Val Lys Asn Ser Ala Thr Pro

275 280

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctcccgtg ccttatggtt a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctggtagg ttcccggat 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcatttgcag gtacctcta 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcctccct tggttatta 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccttggttat taggactct 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagtacgga tcctttcta 19