菠萝农杆菌转化受体的制备方法及其在菠萝转化中的应用

摘要

本发明公开了菠萝农杆菌转化受体的制备方法及其在菠萝转化中的应用，制备方法包括：取菠萝植株作为外植体，将菠萝植株消毒处理后，通过不定芽诱导培养基诱导不定芽的产生，使不定芽产生的过程中，菠萝植株的基部产生组织块，然后取组织块，将其切成小块后，置于菠萝愈伤组织诱导培养基中，制得菠萝愈伤组织，即菠萝农杆菌转化受体；该方法与传统菠萝愈伤组织诱导和转化相比，通过优化外植体消毒方法得到无菌植株，并在组织块的基础上诱导菠萝愈伤组织，缩短了菠萝愈伤组织诱导时间，并且诱导得到的菠萝愈伤组织状态较好，利于转化，提高了菠萝的转化效率。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程及植物培育技术领域，尤其涉及菠萝农杆菌转化受体的制备方法及其在菠萝转化中的应用。

背景技术

菠萝(Ananas comosus)又称凤梨、菠萝皮、草菠萝、地菠萝等。原产美洲热带地区，俗称菠萝，为著名热带水果之一。菠萝与香蕉、番木瓜并称为热带三大草本果树，是人们喜爱的果蔬兼药用的热带水果，菠萝除鲜食外，还可加工成菠萝罐头、菠萝果汁；此外，菠萝加工成副产品，可制糖、制酒精、制味精、柠檬酸等。菠萝营养丰富，尤其以维生素C含量最高，菠萝味甘、微酸，性微寒，有清热解暑、生津止渴、利小便的功效，可用于伤暑、身热烦渴、腹中痞闷、消化不良、小便不利、头昏眼花等症。而且在果汁中，还含有一种跟胃液相类似的酵素，可以分解蛋白，帮助消化。

菠萝是一种具有很高经济价值和药用价值的植物。然而目前在菠萝生产中遇到了实际性迫切需要解决的问题:菠萝寒害问题，菠萝喜温暖，忌寒冷。冬暖，次年菠萝产量易获高稳产；相反，冬寒，次年产量明显下降，表现出产量高低不稳的趋势。越冬的温度条件对菠萝的生产影响很大，是发展菠萝生产的主要气象因素。因此，通过转基因技术培育具有抗寒能力的新品种是发展菠萝生产的当务之急，是提高菠萝产量的根本途径。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种实施可靠、制备便利且所需设备简单和利于转化的菠萝农杆菌转化受体的制备方法及其在菠萝转化中的应用。

为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：

一种菠萝农杆菌转化受体的制备方法，其包括：取菠萝植株作为外植体，将菠萝植株消毒处理后，通过不定芽诱导培养基诱导不定芽的产生，使不定芽产生的过程中，菠萝植株的基部产生组织块，然后取组织块，将其切成小块后，置于菠萝愈伤组织诱导培养基中，制得菠萝愈伤组织，即菠萝农杆菌转化受体。

作为一种可能的实施方式，进一步，所述菠萝植株为幼嫩菠萝植株，其经流水冲洗干净后，转入无菌环境中进行消毒处理，且消毒处理过程均维持无菌环境。

作为一种可能的实施方式，进一步，所述菠萝植株的消毒处理包括：利用75％的酒精消毒30秒，然后用无菌水清洁，再用0.1％HgCl

作为一种可能的实施方式，进一步，经消毒处理后的菠萝植株还通过经高压灭菌的无菌滤纸将多余的水分吸干，然后使用经无菌处理的镊子和刀，将外植体切成0.4-0.8cm左右的大小，且接种于菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N上，然后将其置于光照条件下进行诱导分化产生不定芽，在处理20～30天后，获得不定芽。

作为一种可能的实施方式，进一步，在不定芽长成植株时，菠萝植株的基部产生组织块，其用于诱导菠萝愈伤组织；

待不定芽生长出菠萝植株后，对其去除叶片和组织块褐化的部分，取菠萝植株基部状态符合预设要求的组织块，切成0.5cm的小块，在将其置于菠萝愈伤组织诱导培养基2B0.2N5D中进行黑暗培养，然后一个月进行一次扩繁转接，此过程中，将发生褐变及出现的白色不定芽组织去除，在扩繁4～5个月后，获得符合预设状态的菠萝愈伤组织，将其作为菠萝农杆菌转化受体。

作为一种可能的实施方式，进一步，所述菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N包括如下质量浓度的组分：

MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶3g/L、6-BA 3mg/L、NAA 0.2mg/L；

其pH为5.6～5.8；

其中，菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N的成分混合方案之一如下：将含有MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后加入6-BA3mg/L(母液浓度1mg/mL)、NAA 0.2mg/L(母液浓度1mg/mL)。

作为一种可能的实施方式，进一步，所述菠萝愈伤组织诱导培养基2B0.2N5D包括如下质量浓度的组分：

MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶3g/L、6-BA 2mg/L、NAA 0.2mg/L和2,4-D 5mg/L；

其pH为5.6-5.8；

其中，菠萝愈伤组织诱导培养基2B0.2N5D的成分混合方案之一如下：将含有MS4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后加6-BA 2mg/L(母液浓度1mg/mL)，NAA 0.2mg/L(母液浓度1mg/mL)，2,4-D 5mg/L(母液浓度5mg/mL)。

作为一种实施整合，本方案菠萝农杆菌转化受体的制备方法通过以下步骤实现：

(1)菠萝无菌植株的获得以及不定芽诱导体系的建立

①选择相对幼嫩的菠萝植株作为外植体，先用流水冲洗干净，然后在超净工作台中先用无菌水再次清洗干净后，再然后进行消毒处理；

②将外植体放入高压灭菌的组培瓶中，加入75％的酒精(确保淹没外植体)，消毒30秒后倒掉酒精，用无菌水清洗3-5次；

③使用0.1％的HgCl

④用高压灭菌的滤纸吸干多余的水分，使用无菌的镊子和刀将外植体切成0.4-0.8cm左右的大小，接种于菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N上，置于光照培养基上进行诱导分化，20-30天可得到不定芽。

(2)菠萝愈伤组织的诱导体系的建立

待步骤(1)的不定芽长出大量的菠萝植株，去除部分叶片和褐化的部分，切取菠萝植株基部的组织块，切成0.5cm左右的小块置于愈伤组织诱导培养基2B0.2N5D中进行黑暗培养，一个月进行一次扩繁转接，在此过程中将发生褐变及可能出现的白色不定芽的组织等去除，扩繁4-5个月，得到状态较好的菠萝愈伤组织。

基于上述所述制备方法制得的菠萝农杆菌转化受体的农杆菌介导的菠萝转化方法，其包括如下步骤：

(a)预培养：将菠萝愈伤组织周边发生褐变及出现的白色不定芽组织去除，然后切成小块，再放置于菠萝愈伤诱导培养基2B0.2N5D上预培养24h；

(b)侵染：取1/2MS液体培养基且在其中悬浮含有标记基因的农杆菌，将其作为浸染液，然后把预培养的菠萝愈伤组织放入侵染液进行侵染，侵染后的菠萝愈伤组织先用无菌滤纸吸干，然后在超净台里吹干；

(c)共培养：将步骤(b)侵染过的菠萝愈伤组织置于CM培养基上培养3天；

(d)生长培养：将步骤(c)的处理后的菠萝愈伤组织置于RM培养基上进行光照培养，诱导分化不定芽，且在30天后进行筛选，获得不定芽；

(e)筛选：将步骤(d)培养的不定芽转接到SM培养基上置于光照下筛选20～40天，经筛选后，获得存活的绿芽；

(f)再生：将步骤(e)存活的绿芽作为植株转接至MS培养基中，且按照预设条件根据植株生长情况进行培养基的更换，待植株生长至预设状态时，移入组培瓶中培养，其中，在MS培养基中进行培养时，植株会有根长出，待植株长至3-5cm进行PCR验证；

(g)通过农杆菌的浸染标记，筛选出菠萝抗性植株，然后对菠萝抗性植株进行PCR鉴定验证，获得阳性植株；

(h)炼苗：将步骤(g)得到的阳性植株放入培养土中，于培养箱里光照培养；待植株生长至预设状态后，转移至大棚。

作为一种可能的实施方式，进一步，步骤(a)中，所述预培养中的培养基2B0.2N5D包括如下质量浓度的组分：

MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶3g/L，6-BA 2mg/L、NAA 0.2mg/L、2,4-D 5mg/L；

其pH为5.6～5.8；

步骤(b)所述侵染液的OD值为0.6-0.8；

其侵染方法为：在73KPa的抽真空处理压力下，对菠萝愈伤组织进行处理5min；然后令菠萝愈伤组织在侵染液中浸泡30-60min后，倒掉菌液，用无菌滤纸把菠萝愈伤组织表面的菌液吸干，然后将其置于超净台里吹20～30min。

作为一种可能的实施方式，进一步，步骤(c)所述CM培养基包括如下质量浓度的组分：

MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶3g/L、AS 200μM、葡萄糖4g/L；

其pH为5.8；

CM培养基的成分混合方案之一如下：将含有MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.8左右的混合液经高压灭菌后加AS 200μM，葡萄糖4g/L。

步骤(d)所述RM培养基包括如下质量浓度的组分：

MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶3g/L、6-BA 1mg/L、NAA 0.1mg/L；

其pH为5.6～5.8；

RM培养基的成分混合方案之一如下：将含有MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后加6-BA 1mg/L(母液浓度1mg/mL)，NAA 0.1mg/L(母液浓度1mg/mL)。

步骤(e)所述SM培养基包括如下质量浓度的组分：

MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶3g/L、潮霉素15-20mg/L；

其pH为5.6-5.8；

SM培养基的成分混合方案之一如下：将含有MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后加入潮霉素15-20mg/L。

采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案所提供的菠萝农杆菌转化受体的制备方法及其在菠萝转化中的应用，操作简单易行，愈伤组织诱导所需培养基配方简单高效，标记基因转化效率高，可为菠萝的基因工程研究提供方法。

该方法在菠萝生物技术相关领域包括菠萝基因工程、细胞工程、代谢工程以及菠萝的分子育种等方面具有广泛的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中切好的放置在菠萝诱导愈伤组织培养基2B0.2N5D上的组织块的图。

图2是本发明实施例中放置菠萝诱导愈伤组织培养基2B0.2N5D上一个月后的组织块的图。

图3是本发明实施例中放在2B0.2N5D培养基上四个月后准备进行侵染的菠萝愈伤组织的图。

图4是本发明实施例中农杆菌侵染后置于RM培养基上的愈伤组织的图。

图5是本发明实施例中愈伤组织在RM培养基上分化出的不定芽的图。

图6是本发明实施例中愈伤组织分化出的不定芽置于筛选培养基上的图。

图7是本发明实施例中筛选出的不定芽长大成植株的图。

图8是本发明实施例中构建好的过表达重组载体pCAMBIA1305.2-XY13(MYB24)的图。

图9是本发明实施例中标记基因片段扩增与过表达重组载体构建过程的图。

图10是本发明实施例中菠萝转基因抗性植株PCR鉴定结果图，其中1-23为菠萝植株样品，24号为阳性对照(引物HYG扩增)。

图11是本发明实施例中菠萝转基因抗性植株PCR鉴定结果图，其中1-23为菠萝植株样品，第一排为XY13-VF1+XY13-VR1引物扩增，第二排为XY13-VF2+XY13-VR2引物扩增。

图12是本发明实施例中菠萝转基因阳性植株GUS染色验证结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

下面以XS菠萝为例，进一步说明本发明所提供的菠萝农杆菌转化受体的制备及菠萝农杆菌转化方法。

一种菠萝农杆菌转化受体的制备方法，其包括如下步骤：

(1)菠萝无菌植株的获得以及不定芽诱导体系的建立

①选择相对幼嫩的菠萝植株作为外植体，先用流水冲洗干净，然后在超净工作台中先用无菌水再次清洗干净后，再然后进行消毒处理；

②将外植体放入高压灭菌的组培瓶中，加入75％的酒精(确保淹没外植体)，消毒30秒后倒掉酒精，用无菌水清洗3-5次；

③使用0.1％的HgCl

④用高压灭菌的滤纸吸干多余的水分，使用无菌的镊子和刀将外植体切成0.4-0.8cm左右的大小，接种于菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N上，置于光照培养基上进行诱导分化，20-30天可得到不定芽。

(2)菠萝愈伤组织的诱导体系的建立

待步骤(1)的不定芽长出大量的菠萝植株，去除部分叶片和褐化的部分，切取菠萝植株基部的组织块，切成0.5cm左右的小块置于愈伤组织诱导培养基2B0.2N5D中进行暗培养，一个月进行一次扩繁转接，在此过程中将发生褐变及可能出现的白色不定芽的组织等去除，扩繁4-5个月，得到状态较好的菠萝愈伤组织，其培养变化过程可以参考图1至图3之一所示。

在本方案中，所述菠萝的品种包括MD2，XS。在本方案中，所述菠萝优选采用XS品种。

在步骤(1)所述菠萝不定芽诱导培养基3B0.2N的组分为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，6-BA 3mg/L(母液浓度1mg/ml)，NAA 0.2mg/L(母液浓度1mg/mL)，植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间。

在步骤(2)所述菠萝愈伤组织诱导培养基2B0.2N5D的组分为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间，高压灭菌后加6-BA 2mg/L(母液浓度1mg/mL),NAA 0.2mg/L(母液浓度1mg/mL)，2,4-D 5mg/L(母液浓度5mg/mL)。

基于上述的菠萝农杆菌转化受体的制备方法，本实施例在其基础上，还进一步提供了一种标记基因载体的构建方法。

将需要转化的标记基因XY13(MYB24)进行载体构建，标记基因与载体构建的图谱如图8。

使用的植物表达载体名称为载体pCAMBIA1305.2，载体带有抗性基因HYG，载体上的报告基因为GUS，载体pCAMBIA1305.2中所用启动子为XY13(MYB24)基因自身启动子，其大小为3416bp，该标记基因的全基因组大小为5254bp，该标记基因可以与GUS基因进行融合表达，此启动子的功能是启动所转入的XY13(MYB24)基因序列，进而启动GUS基因的表达，便于观察该标记基因在菠萝转化植株的表达情况，进而确定菠萝中农杆菌介导的转化方法的可行性和有效性。

设计引物，PCR扩增包括MYB24启动子和全长基因的片段，大小为8.7kb，其引物名称和序列如下：

PCR扩增得到一条约8kb的目的条带，与XY13(MYB24)的基因组大小相符(如图9A)。将目的带回收纯化后，用用内切酶BamH I和Sal I分别对表达载体pCambia1305.2和目的条带进行酶切(如图9B)。将线性化的载体和双酶切后的标记基因用T4连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌，菌落PCR验证结果正确(如图9C)。同时将PCR阳性的菌落送到公司测序，比对测序结果显示重组载体pCambia1305.2-1XY13(MYB24)构建成功。

将构建成功的重组载体转化到农杆菌中，筛选阳性克隆进行摇菌，并保存菌液用于转化。转化的农杆菌使用LB液体培养基进行摇菌，其中卡那霉素的终浓度为50mg/L、利福平的终浓度为50mg/L。将菌液于50mL离心管中18℃，3500rpm条件下离心10min，加入1/2MS重悬液(液体MS培养基，配方：1/2MS即2.215g/L，蔗糖30g/L，pH 5.8左右，高压灭菌后放至常温)重悬，使其最终OD600值在0.5-0.8左右即可进行侵染。本发明实施例使用的农杆菌有GV3101、LBA4404、EHA105三种菌株。

基于上述所述制备方法制得的菠萝农杆菌转化受体，及农杆菌侵染方案，本实施例还提供基于上述方案的菠萝农杆菌转化受体的农杆菌介导的菠萝转化方法，参考图4至图7之一所示，其包括如下步骤：

1.预培养：将菠萝愈伤组织周边发生褐变及可能出现的白色不定芽状组织等去除，切成小块，放置于菠萝愈伤诱导培养基2B0.2N5D上，预培养24h。

2.侵染：1/2MS液体培养基悬浮含有标记基因的农杆菌，用侵染液把OD值调整为0.6-0.8，用侵染液将权利要求1所述制备方法得到的菠萝愈伤组织进行73KPa，5min的抽真空，再浸泡30-60min。倒掉菌液，侵染过的愈伤组织用无菌滤纸吸干，在超净台里吹约20-30min。

3.共培养：将步骤2侵染过的菠萝愈伤组织置于CM培养基上培养3天。

4.生长培养：将步骤3共培养的菠萝愈伤组织置于RM培养基上进行光照培养，诱导分化不定芽，约30天后进行筛选。

5.筛选：将步骤4培养的不定芽转接到SM培养基上(Hygr15-20mg/L))置于光照下筛选20-40天。

6.再生：将步骤5筛选存活的绿芽转接至MS培养基中，根据植株生长情况进行更换培养基，植株稍大一些可移入组培瓶中培养，在MS培养基中植株会有根长出，待植株长至3～5cm可进行PCR验证。

7.将抗性菠萝植株进行PCR验证。

(1)引物设计

设计的引物序列如下：

(2)转基因菠萝抗性植株的PCR验证

对本发明实施例所获得的转基因菠萝阳性植株，使用3对引物进行验证。首先使用潮霉素基因验证(验证结果如图10)，得到有潮霉素基因的植株；然后用标记基因的另外两对引物扩增标记基因(验证结果如图11)。通过PCR验证，21,22号植株为转基因阳性植株。

(3)转基因菠萝阳性植株GUS染色验证

通过载体上的报告基因进行GUS染色，结果显示21,22号阳性植株的叶片均能染色(如图12)

8.炼苗：将得到的阳性植株放入培养土中，于培养箱里光照培养。待植株生长的健壮，即可转移至大棚。

其中，步骤1所述预培养培养基2B0.2N5D的成分为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后加6-BA 2mg/L(母液浓度1mg/mL)，NAA 0.2mg/L(母液浓度1mg/mL)，2,4-D 5mg/L(母液浓度5mg/mL)。

步骤3所述CM培养基的成分为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.8左右的混合液经高压灭菌后加AS 200uM，葡萄糖4g/L。

步骤4所述RM培养基的成分为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后加6-BA 1mg/L(母液浓度1mg/mL)，NAA 0.1mg/L(母液浓度1mg/mL)。

步骤5所述SM培养基的成分为：MS 4.43g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶(phypagel)3g/L，pH 5.6-5.8之间的混合液经高压灭菌后，加入潮霉素15-20mg/L。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可做很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。