一种香椿愈伤组织的石蜡切片制作方法

摘要

本发明公开了一种香椿愈伤组织的石蜡切片制作方法，包括材料固定、酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、粘块和切片、展片和烘片、脱蜡和透明、复水染色、封片和观察等步骤。本发明根据香椿愈伤组织幼嫩、易碎等特性，在工艺方面进行了创新，提供一种操作流程简单，特别适于香椿愈伤组织的石蜡切片制作方法，得到的香椿愈伤组织石蜡切片效果好、操作流程简单、制作效率高，同时为其他植物愈伤组织的石蜡切片制作提供了借鉴。本发明具有良好的应用价值。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种石蜡切片的高效制作方法，尤其涉及一种香椿愈伤组织的石蜡切片制作方法。

【背景技术】

香椿[Toona sinensis(A.Juss)Roem]属楝科(Meliaceae)多年生落叶乔木，喜光照，在昼夜温差大且肥沃的沙质土壤中生长较好。香椿不仅作为极好的速生材，还是美味的木本蔬菜，具有极高的营养和药用价值。在自然条件下，香椿的繁殖主要通过播种、扦插育苗、分蘖等无性繁殖方式进行，然而这些方法通常繁殖系数低，且速度较慢。传统的栽培方式难以满足生产需要，也不利于香椿良种的培育和推广。因此，植物组织培养成为一种重要的繁殖途径。

近年来，随着生物技术的发展，基因工程育种为香椿品种改良开辟了新的途径。高效转基因体系建立的前提是高效再生体系的建立，植物不同再生体系对转基因效率有直接影响。因此，深入研究香椿的再生体系及其再生方式，将为香椿转基因研究提供理论基础和技术支持。利用石蜡切片技术，对香椿再生过程产生的愈伤组织进行细胞学观察，是研究其再生方式的重要方法。

目前，制作石蜡切片的技术有很多，这些技术根据组织自身的特性不同，石蜡切片制作过程中所用的试剂、处理时间等工艺流程也各不相同。中国专利CN106769315B公开了一种大麻愈伤组织的石蜡切片制作方法，包括取材与固定、整体染色、脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、展片及粘片、脱蜡、封片等步骤，该方法能够得到组织结构完整、清晰的大麻愈伤组织石蜡切片；中国专利CN 102175482B公开了一种厚革质叶片石蜡切片方法，包括固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、脱蜡、染色及封片等步骤，该方法进行了固定剂的选择、脱水程序的确定、透明程序的确定、透蜡程序的确定、染色及封片方法的改进，该方法同样适用于其它不同厚度及性质的叶片。但是，至今为止没有专门应用于香椿组织植物切片的技术。由于香椿愈伤组织具有幼嫩、易碎的特性，造成使用常规的石蜡切片方法效果不佳、耗时低效。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是，克服现有植物技术的不足，根据香椿愈伤组织幼嫩、易碎等特性，提供一种操作流程简单，特别适于香椿愈伤组织的石蜡切片制作方法。

本发明提供的一种香椿愈伤组织的石蜡切片制作方法，其特征在于包括如下步骤：

1)材料固定：常温下，将香椿愈伤组织置于改良后的FAA固定液中固定24h后，于真空抽气机中抽气10～20min，得到固定愈伤；

所述改良后的FAA固定液为质量浓度37％的甲醛溶液：冰醋酸：质量浓度70％的乙醇溶液以体积比1：1：18混合而成；

2)酒精脱水：将步骤1)得到的固定愈伤经质量浓度70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇(含质量浓度1％伊红)逐级脱水，每级30min；无水乙醇处理两次，每次30min，得到脱水愈伤；

3)透明：将步骤2)得到的脱水愈伤移至装有无水乙醇的瓶中，静置1h；随后吸走1/4体积的溶液，补入与所吸走溶液同体积的氯仿，静置1h；然后吸走1/2体积的溶液，补入与所吸走溶液同体积的氯仿，静置1h；然后吸走3/4体积的溶液，补入与所吸走溶液同体积的氯仿，静置1h；最后吸走全部溶液，补入与所吸走溶液同体积的氯仿，静置1h，得到透明愈伤；

4)浸蜡：往步骤3)的瓶中添加碎蜡，遵循少量多次的原则，每隔1h加入质量克数是瓶中溶液体积毫升数4.5～5.5％的碎蜡，直至加入的碎蜡使溶液饱和，37℃恒温箱中放2天；

5)包埋：将材料在氯仿：石蜡按照体积比为1：3的溶液中52℃保温30min，随后在纯石蜡中52℃保温30min，随后在纯石蜡中48℃保温30min，随后包埋；

6)修块、粘块和切片：对愈伤组织分别进行横向和纵向切片，厚度为6～10um，蛋清甘油作为粘片剂，蒸馏水展片；

7)展片和烘片：37℃展片后，在37℃恒温箱中烘2-3天；

8)脱蜡和透明：二甲苯脱蜡1h，再更换二甲苯透明1h；

9)复水染色：无水乙醇、质量浓度95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、蒸馏水处理，每级30s；0.5％的甲苯胺蓝染色1min；

10)封片和观察：将玻片依次放入蒸馏水、质量浓度为30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯中处理，每级30s，随后中性树胶封片；将封好的玻片置于通风处24h，即成为永久切片。

本发明的有益效果有：开发出了特别适用于香椿愈伤组织的石蜡切片制作技术，得到的香椿愈伤组织石蜡切片效果好、操作流程简单、制作效率高，同时为其他植物愈伤组织的石蜡切片制作提供了借鉴。

【附图说明】

图1是本发明实施例的香椿愈伤组织切片的显微图片。

【具体实施方式】

为了更好地理解本发明，下面结合附图，详细描述实施例。应理解，本实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的范围。

除特别说明外，本实施例所采用的技术手段为本领域的常规技术手段。

实施例1

1)材料固定：常温下，将香椿愈伤组织置于改良后的FAA固定液中固定24h后，于真空抽气机中抽气10min，得到固定愈伤；

所述改良后的FAA固定液为质量浓度37％的甲醛溶液、冰醋酸和质量浓度70％的乙醇溶液以体积比1：1：18混合而成；

2)酒精脱水：将步骤1)中的固定愈伤经质量浓度70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇(含质量浓度1％伊红)逐级脱水，每级30min；无水乙醇处理两次，每次30min，得到脱水愈伤；

3)透明：将步骤2)中的脱水愈伤移至4ml的无水乙醇中，静置1h；随后用移液枪吸走1ml溶液，加入1ml氯仿，静置1h；然后吸走2ml溶液，补入2ml氯仿，静置1h；然后吸走3ml溶液，补入3ml氯仿，静置1h；最后吸走4ml溶液，补入4ml氯仿，静置1h；至此瓶中溶液置换成纯氯仿，得到透明愈伤；

4)浸蜡：往步骤3)的瓶中添加碎蜡，遵循少量多次的原则，每隔1h加入0.18g的碎蜡，直至加入的碎蜡使溶液饱和，37℃恒温箱中放2天；

5)包埋：将材料在氯仿：石蜡按照体积比为1：3的溶液中52℃保温30min，随后在纯石蜡中52℃保温30min，随后在纯石蜡中48℃保温30min，随后包埋；

6)修块、粘块和切片：用LEICA2150切片机对愈伤组织分别进行横向和纵向切片，厚度为10um，蛋清甘油作为粘片剂，蒸馏水展片；

7)展片和烘片：在KD-H烘片机上37℃展片后，在37℃恒温箱中烘2-3天；

8)脱蜡和透明：二甲苯脱蜡1h，再更换二甲苯透明1h；

9)复水染色：无水乙醇、质量浓度95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、蒸馏水处理，每级30s；0.5％的甲苯胺蓝染色1min；

10)封片和观察：将玻片依次放入蒸馏水、质量浓度为30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯中处理，每级30s，随后中性树胶封片；将封好的玻片置于通风处24h，即成为永久切片。

实施例2

本实施例与实施例1工艺步骤相同，区别仅在于步骤1)抽气时间为20min、步骤4)每次加入0.22g的碎蜡、步骤6)切片厚度为6um。

实施例3

本实施例与实施例1或2工艺步骤相同，区别仅在于步骤1)抽气时间为16min、步骤4)每次加入0.2g的碎蜡、步骤6)切片厚度为7um。