一种碳酸盐矿化菌联合羟基磷灰石固化重金属的方法

摘要

本发明公开了一种碳酸盐矿化菌联合羟基磷灰石固化重金属的方法。该方法主要利用微生物施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、巴氏芽孢杆菌Bacillus pasteurii代谢产生的脲酶，水解尿素，进而提高体系pH和产生碳酸盐离子，在其形成方解石、球霰石的过程中，从而将重金属离子固化稳定化，可实现水体和土壤环境中重金属离子的去除。该方法反应条件温和，生物矿化时间短，高效环保，成本低廉，能够显著降低水体或土壤中重金属的含量，可以扩大化推广使用。

说明书

技术领域

本发明属于地下水环境生态修复和重金属污染土壤修复技术领域，具体涉及一种微生物诱导碳酸盐沉积固化重金属的方法。

背景技术

近年来由于矿物的开采和冶炼过程对周围土壤环境产生了巨大的影响，如重金属的积累、土壤pH值的降低、有机质和养分的缺乏、土壤团聚结构的恶化等。重金属的毒性对暴露在这些污染物中的生物构成严重威胁。其中重金属镉作为一种环境中普遍存在且具有较高毒性的重金属元素，不仅会导致生态环境问题，还可以在农作物中积累，通过食物链对人体健康产生巨大威胁。与传统的化学和物理修复方法相比，生物修复利用天然的或人工的生物转化方法将环境污染物整体或分组处理，具有投资少、效率高、在环境治理中可以原位处理低浓度污染物的特点，表现出了巨大的潜力，正逐渐成为一种受欢迎的水体或土壤重金属修复技术。

微生物诱导碳酸盐沉淀(MICP)是微生物诱导成矿的延伸，是指在环境中有Ca

NH

利用微生物诱导碳酸盐沉淀技术可以将有效态重金属镉转化为结构稳定、不易活化的生物矿物晶体，而且由于该技术具有生态友好、成本低和无二次污染的特点，因而可以被广泛用于地下水环境和土壤的重金属污染修复。但是，关于微生物诱导碳酸盐沉淀去除重金属的机理研究，结合酶反应动力学和结晶热动力学研究含重金属方解石或球霰石形成过程仍需要得到加强，多种碳酸盐矿化菌混合修复的钝化机制及与化学材料相结合的重金属去除机制仍需进一步探索。

发明内容

针对现有重金属污染传统修复技术方面成本较高、适用性较弱、易产生二次污染的不足，本发明提供了一种微生物诱导碳酸盐沉积固化镉、铅的方法。

本发明的技术方案为：

一种微生物诱导碳酸盐沉积固化重金属的方法，包括以下步骤：

(1)高密度碳酸盐矿化菌液的制备：在无菌条件下，将碳酸盐矿化菌接种到固体培养基中活化培养，再将碳酸盐矿化菌转移至已灭菌的含尿素液体培养基中培养，培养完成后离心，用水冲洗菌体，得到高密度菌液；所述碳酸盐矿化菌分别为为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巴氏芽孢杆菌(Bacilluspasteurii)。

(2)将步骤(1)中得到的三种高密度菌液混合后接种到含重金属离子的水体中，同时投加尿素和钙化物，搅拌培养进行固化反应即可沉积固化重金属。

进一步地，步骤(1)中，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为ATCC 17588，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为ATCC 6633、巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)为ATCC 11859。

进一步地，步骤(1)中，固体培养基成分质量比例：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏浸出粉、0.5％氯化钠、1％琼脂，余量为水，pH为7.0±0.2；含尿素液体培养基成分质量比例：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏浸出粉、0.5％氯化钠、2％尿素，余量为水，pH为7.0±0.2。

进一步地，步骤(1)中，培养pH和温度分别为5.0～8.0和25～40℃，最适范围6.5～7.5和30～35℃；菌体培养时间24～48h。

进一步地，步骤(1)中，培养24h后以4000r/min离心10min，并用无菌0.9％生理盐水冲洗2～3次，重复离心冲洗3次后，使菌体重悬于无菌生理盐水，细菌密度为1×10

进一步地，步骤(2)中，三种高密度菌液按体积比(0.5-2):(0.5-2):1的比例混合，优选为1:1:1混合。

进一步地，步骤(2)中，所述重金属离子为Cd

进一步地，步骤(2)中，尿素、钙化物的添加顺序为：先添加尿素，后添加钙化物。

进一步地，步骤(2)中，钙化物为羟基磷灰石、乙酸钙、氯化钙或硝酸钙等可溶性钙盐，培养体系中钙盐投加量为为1.0～5.0g/L。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

第一，本发明选用的三种碳酸盐矿化菌，在高浓度尿素和钙离子的环境中对多种重金属离子均表现出一定抗性，在生长过程中培养体系碱性，在脲酶作用下诱导环境中的尿素水解，进而诱导环境中的钙离子形成碳酸钙，同时在此过程中固定重金属离子，或共沉淀重金属离子，从而达到生物矿化修复的目的，具有过程简单、容易控制、经济高效、适应性强、对环境友好的特点。

第二，三种不同类型的碳酸盐矿化菌混合后，增强了对环境的适应性及广谱性；混合后的菌群可在营养贫瘠的土壤泥浆中生存，无需外加钙源，便可完成碳酸盐矿化过程；混合后对不同pH的土壤泥浆中Cd

第三，碳酸盐矿化菌联合羟基磷灰石，菌株不仅被吸附在羟基磷灰石表面，同时可以羟基磷灰石为钙源完成碳酸盐矿化过程，对水体或土壤中的Cd

本发明利用碳酸盐矿化菌产生碳酸钙的同时，生物矿化产物分别为：施氏假单胞菌Pseudomonas stutzerii在生长过程中矿化产物主要是球霰石，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的矿化产物主要以方解石和球霰石为主、巴氏芽孢杆菌Bacillus pasteurii的矿化产物以方解石为主，矿化产物杂质少、结晶性好、比化学合成的碳酸钙稳定性更好，矿化产物在去除污染水体中重金属镉、铅时，表现出良好的效果，主要矿化产物碳酸钙中Ca

附图说明

图1为本发明实施例3中碳酸盐矿化菌对Cd

图2为本发明实施例4中羟基磷灰石联合碳酸盐矿化菌对Cd

图3为本发明实施例6中碳酸盐矿化菌矿化产物的SEM-EDS图；

图4为本发明实施例6中碳酸盐矿化菌矿化产物的FTIR图；

图5为本发明实施例6中碳酸盐矿化菌矿化产物的XRD图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实施例1高密度碳酸盐矿化菌液的制备

在无菌条件下，将保存的碳酸盐矿化菌接种到固体培养基中培养24h，再将碳酸盐矿化菌转移至已灭菌的含尿素液体培养基中，培养24h后以4000r/min离心10min，并用无菌0.9％生理盐水冲洗2～3次，重复离心冲洗3次后，使菌体重悬于无菌生理盐水，从而得到高密度菌液，细菌密度为1×10

碳酸盐矿化菌分别为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)。

本实施例中，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)保藏编号为ATCC 17588，由中国微生物菌种保存库提供，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)保藏编号为ATCC 6633、巴氏芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)保藏编号为ATCC 11859购买于北纳创联生物技术有限公司。均为市售商品化菌株。

实施例2三种碳酸盐矿化菌混合对水体中Cd

取2mL实施例1中三种碳酸盐矿化菌高密度菌液，按比例混合后分别接种到200mL初始浓度10mg/L的Cd

表1不同混合比例碳酸盐矿化菌对Cd

实施例3不同碳酸盐矿化菌对水体中的Cd

取2mL实施例1中碳酸盐矿化菌高密度菌液，分别接种到200mL初始浓度10mg/L的Cd

三种碳酸盐矿化菌对溶液中Cd

实施例4不同碳酸盐矿化菌联合羟基磷灰石对水体中Cd

取2mL实施例1中三种碳酸盐矿化菌高密度菌液，分别接种到200mL初始浓度10mg/L的Cd

三种碳酸盐矿化菌联合羟基磷灰石(HAP)对溶液中Cd

实施例5混合碳酸盐矿化菌联合羟基磷灰石对土壤泥浆中Cd

分别取100g Cd

表2碳酸盐矿化菌混合后对土壤泥浆中Cd

实施例6碳酸盐矿化菌固定Cd

取2mL步骤(1)中碳酸盐矿化菌高密度菌液，接种到200mL初始浓度10mg/L的Cd

三种碳酸盐矿化菌对Cd

根据FTIR和XRD分析，施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri在生长过程中产生的矿物主要是球霰石，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis形成的矿化产物主要以方解石和球霰石为主，而巴氏芽孢杆菌Bacillus pasteurii的矿化产物以方解石为主，矿化产物特征吸收峰尖锐，表明形成矿物中含杂质少，结晶性好。三种碳酸盐矿化菌均表现出对Cd

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。