一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法，属于食品技术领域。本发明公开的一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法，通过常规酸沉淀方法，自初乳获得乳清，内含有乳铁蛋白等多种蛋白成分；通过级联的两级滤膜超滤，获得了具有较高纯度的乳铁蛋白。本发明还采用不同的pH值构成的生理缓冲液冲洗两级滤膜，除了防止堵膜以外，还便于自动化集成组装两级超滤设备，便于分离去除免疫球蛋白复合物，同时避免了外加入强碱等洗涤液对分离成分的影响；且分离的免疫球蛋白复合物能够回收利用，避免浪费，提高经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及食品技术领域，更具体的说是涉及一种利用超滤法自哺乳动物初乳中获取乳铁蛋白的方法。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种多功能蛋白质，既可作为人体营养来源，补充铁和氨基酸，又可作为预防和治疗人类多种疾病的药物，用于维持肠道内菌群平衡，防止感染和抵抗病毒，抑制肿瘤发生与转移，阻碍体内产生自由基损伤机体。因此，乳铁蛋白已被认为是一种安全的生物源蛋白质，没有显著副作用，可作为添加剂广泛应用于食品、医疗和化妆品领域。

乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中；在人初乳中，含量高达7g/L，而成熟乳汁中含量维持在大约1g/L。另外，乳铁蛋白还少量存在于胆汁、胰液、小肠液、唾液和泪液等分泌液中。乳铁蛋白呈单一多肽链，两端各折成环状，铁离子伴随着2个碳酸氢根离子(HCO

初乳是母体分娩后一周内分泌的乳汁，除了乳铁蛋白，还富含多种功能因子，如免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶、核苷酸和各种生长因子。科学家Montreuil.J和Johanson.B等于1960年从母乳乳汁分离得到了乳铁蛋白，接下来进行了大量的科学研究，并逐渐发现了多种分离纯化方法。目前主要有以下几种分离方法包括盐析和有机溶剂沉淀法，离子交换色谱法，固定化单克隆抗体亲和吸附法，金属离子螯合分离法，以及超滤法。

但是，目前建立的超滤方法，存在多方面的问题：(1)超滤膜容易堵，清洗方法中引入含有强碱的洗涤液；(2)从小孔径滤膜开始，使得乳铁蛋白截留在膜的上层，不便于转移到下一级滤膜过滤，难以实现自动化多级过滤；(3)由于没有采取pH值调节等手段，排除免疫球蛋白聚合物，导致分离的乳铁蛋白中混杂大量的免疫球蛋白。

因此，提供一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法，通过级联的两级滤膜超滤，获得了具有较高纯度的乳铁蛋白。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法，具体步骤如下：

(1)脱脂：将初乳离心，弃去上层脂肪，收集脱脂乳；

(2)酸沉淀法获取乳清蛋白样品；将脱脂乳pH调节至4.6；

(3)二次超滤纯化乳铁蛋白：

①先将乳清蛋白样品用生理盐水冲洗，获得混合液；再将混合液用1mol/L NaOH(食品级)pH调至6.8-7.4；用截留90-120kDa分子量的滤膜过滤混合液，获得一次滤液，截留液中蛋白分子量小于90kDa；生理盐水添加量为乳清蛋白样品体积的0.5-3.0倍，膜两侧压力差参数0.04-0.15Mpa；目的是过滤去除免疫球蛋白聚合物等大分子蛋白；

②将一次滤液用生理盐水冲洗，获得混合液，再将混合液pH调至7.0-8.5，再经过截留分子量为60-80KDa的滤膜过滤，得到经过浓缩的截留液；截留液中蛋白分子量范围集中在80±5kDa；生理盐水添加量为一次滤液体积的0.5-2.0倍，膜两侧压力差参数0.04-0.10Mpa；目的是去除小分子量的乳清蛋白；

(4)乳铁蛋白冷冻干燥：将经过浓缩的截留液，用冷冻干燥机在-40℃～10℃条件下干燥，获得乳铁蛋白。

进一步，步骤(1)所述离心条件为4℃条件下3000-5000r/min离心15-20min。

进一步，步骤(2)所述酸沉淀法获取乳清蛋白样品的具体步骤如下：将脱脂乳用1mol/L HCl(食品级)调节pH至4.6，于4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，即为酸沉淀法所得乳清蛋白样品。

进一步，步骤(3)中①用截留100kDa分子量的滤膜过滤混合液，获得一次滤液。

进一步，步骤(3)中②用截留分子量为70KDa的滤膜过滤，得到经过浓缩的截留液。

超滤法分离原理：在特定的pH条件下，乳铁蛋白的分子量范围维持在80±5kDa，以区分开其它蛋白组成。基于此，可以使液体通过连续不同孔径的滤膜，分离获取乳铁蛋白。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法，通过常规酸沉淀方法，自初乳获得乳清，内含有乳铁蛋白等多种蛋白成分；通过级联的两级滤膜超滤，获得了具有较高纯度的乳铁蛋白。本发明主要改进了以往首先经过小孔径滤膜，获得截留成分，然后再从截留成分中获取乳铁蛋白的方法。本发明创新性地首先通过大孔径滤膜，获取滤过成分，再从滤过液中获取乳铁蛋白，便于工艺上两步过滤级联，以形成工业化生产的自动化。

此外，本发明将脱脂乳的pH调至4.6，对于后期超滤分离获得乳铁蛋白至关重要；本发明还采用不同的pH值构成的生理缓冲液冲洗两级滤膜，除了防止堵膜以外，还便于自动化集成组装两级超滤设备，便于分离去除免疫球蛋白复合物，同时避免了外加入强碱等洗涤液对分离成分的影响；且分离的免疫球蛋白复合物能够回收利用，避免浪费，提高经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1初乳中分离乳铁蛋白的工艺流程图；

图2附图为本发明初乳乳清中蛋白的组成与超滤分离方案。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法(工艺流程参见图1)，具体步骤如下：

(1)脱脂：将牛初乳于4℃条件下3000r/min离心20min，弃去上层脂肪，收集脱脂乳；

(2)酸沉淀法获取乳清蛋白样品：将脱脂乳用1mol/L HCl调节pH至4.6，于4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，即为酸沉淀法所得乳清蛋白样品；

(3)二次超滤纯化乳铁蛋白：

①先将乳清蛋白样品用生理盐水冲洗，获得混合液；再将混合液pH调至6.8；用截留100kDa分子量的滤膜过滤混合液，获得一次滤液；生理盐水添加量为乳清蛋白样品体积的0.5倍，膜两侧压力差参数0.04Mpa；

②将一次滤液用生理盐水冲洗，获得混合液，再将混合液pH调至7.0，再经过截留分子量为70KDa的滤膜过滤，得到经过浓缩的截留液；生理盐水添加量为一次滤液体积的0.5倍，膜两侧压力差参数0.04Mpa；初乳乳清中蛋白的组成与超滤分离方案见图2；

(4)乳铁蛋白冷冻干燥：将经过浓缩的截留液，用冷冻干燥机在-40℃条件下干燥，获得乳铁蛋白。

其中，每升牛初乳免疫球蛋白的得率以及每升牛初乳乳铁球蛋白的得率分别见表1和表2。

表1每升牛初乳免疫球蛋白的得率

表2每升牛初乳乳铁球蛋白的得率

实施例2

一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法，具体步骤如下：

(1)脱脂：将牛初乳于4℃条件下5000r/min离心15min，弃去上层脂肪，收集脱脂乳；

(2)酸沉淀法获取乳清蛋白样品：将脱脂乳用1mol/L HCl调节pH至4.6，于4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，即为酸沉淀法所得乳清蛋白样品；

(3)二次超滤纯化乳铁蛋白：

①先将乳清蛋白样品用生理盐水冲洗，获得混合液；再将混合液pH调至7.4；用截留90kDa分子量的滤膜过滤混合液，获得一次滤液；生理盐水添加量为乳清蛋白样品体积的2.0倍，膜两侧压力差参数0.1Mpa；

②将一次滤液用生理盐水冲洗，获得混合液，再将混合液pH调至8.0-，再经过截留分子量为60KDa的滤膜过滤，得到经过浓缩的截留液；生理盐水添加量为一次滤液体积的1.0倍，膜两侧压力差参数0.08Mpa；

(4)乳铁蛋白冷冻干燥：将经过浓缩的截留液，用冷冻干燥机在-20℃条件下干燥，获得乳铁蛋白。

实施例3

一种利用超滤法自初乳中获取乳铁蛋白的方法，具体步骤如下：

(1)脱脂：将牛初乳于4℃条件下4000r/min离心18min，弃去上层脂肪，收集脱脂乳；

(2)酸沉淀法获取乳清蛋白样品：将脱脂乳用1mol/L HCl调节pH至4.6，于4℃条件下5000r/min离心20min，收集上清液，即为酸沉淀法所得乳清蛋白样品；

(3)二次超滤纯化乳铁蛋白：

①先将乳清蛋白样品用生理盐水冲洗，获得混合液；再将混合液pH调至7.1；用截留120kDa分子量的滤膜过滤混合液，获得一次滤液；生理盐水添加量为乳清蛋白样品体积的3.0倍，膜两侧压力差参数0.15Mpa；

②将一次滤液用生理盐水冲洗，获得混合液，再将混合液pH调至8.5，再经过截留分子量为80KDa的滤膜过滤，得到经过浓缩的截留液；生理盐水添加量为一次滤液体积的2.0倍，膜两侧压力差参数0.10Mpa；

(4)乳铁蛋白冷冻干燥：将经过浓缩的截留液，用冷冻干燥机在10℃条件下干燥，获得乳铁蛋白。

实施例1-3分离得到的乳铁蛋白(LF)样品的抑菌作用

采用牛津杯法。将斜面菌株接种肉汤蛋白胨培养液扩增16～20h，营养琼脂培养基平板计数，调整菌悬液浓度为10

乳铁蛋白试液的配制：分别称取50mg实施例1-3分离得到的乳铁蛋白样品，用50mlPBS缓冲液(磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L)，pH7.4溶解，配成母液(浓度为1mg/ml)；做抑菌试验时，用去离子水稀释为一定的待测最高浓度，即200g/ml，然后2倍等比依次稀释。

实施例1-3分离得到的乳铁蛋白(LF)样品的抑菌作用结果见表3-表5。

表3实施例1分离得到的LF对不同微生物抑菌效果产生的抑菌圈直径(mm)

注：MIC为最低抑菌浓度；对照组抑菌圈直径8mm。

表4实施例2分离得到的LF对不同微生物抑菌效果产生的抑菌圈直径(mm)

注：MIC为最低抑菌浓度；对照组抑菌圈直径8mm。

表5实施例3分离得到的LF对不同微生物抑菌效果产生的抑菌圈直径(mm)

注：MIC为最低抑菌浓度；对照组抑菌圈直径8mm。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。