一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用

摘要

本发明属于海藻分子遗传学领域，涉及一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用。浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记扩增引物；浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记为SEQ ID NO.1中碱基序列所示。本发明是通过PCR检测上述的特异性片段来完成，利用该特异性分子标记，可以快速、简单、准确地对引发黄海大规模绿潮的浒苔漂浮生态型进行分子鉴定，为黄海浒苔绿潮的早期预警、过程跟踪以及浒苔漂浮生态型向其他生境的扩散入侵监测提供重要的分子工具。

说明书

技术领域

本发明属于海藻分子遗传学领域，涉及一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用。

背景技术

绿潮（green tide）是大型海洋绿藻生物量暴发增殖的海洋生态现象，构成绿潮的海藻主要来自绿藻门（Chlorophyta）的石莼属（

为了开展黄海绿潮溯源、建立预警预报的科学方法，首先需明确绿潮藻优势种的组成规律。由于石莼属绿藻可用于形态分类的特征较少且很不稳定，因此常用分子方法开展物种鉴定。使用细胞核基因组编码的ITS（internal transcribed spacer）以及叶绿体基因组编码的

鉴于此，进一步开展了种下水平的群体遗传学研究，利用ISSR（inter-simplesequence repeat）方法，分析了连续多年的黄海绿潮漂浮样本、以及广泛地理来源的定生群体，结果表明，漂浮浒苔无论群体内还是年际间均具有高度的遗传均一性，提示很可能来自单一的群体；而定生样本在群体间有着不同水平的遗传距离，表现出不同程度的遗传隔离；尤其重要的是，漂浮群体与所有定生群体间存在明显差异，说明漂浮群体并非由沿海的定生群体脱离固着汇聚而成，而是有着特殊生活方式、占据特殊的生态位。

为了实现对漂浮群体进行快速准确地分子鉴定，选择漂浮群体特异的ISSR扩增条带，经测序、设计开发了特异性扩增引物，发展了SCAR（Sequence CharacterizedAmplified Region）分子标记，该标记仅在漂浮群体样本中呈现一条830bp的特征性扩增条带，而在浒苔岸基定生群体和近缘种中则表现阴性结果。与岸基定生群体相比，鉴于漂浮群体具有明显的种下基因型差异，独特的形态与生理表型特征，尤其占据特殊的生态位，研究者提出黄海绿潮是由浒苔一个新的“漂浮生态型”（floating ecotype）构成。

大量研究表明，远离海岸、位于苏北辐射沙洲的大面积条斑紫菜养殖筏架与绠绳，成为石莼属绿藻大量附生的重要基质；另外，伴随紫菜收获以及筏架、绠绳回收清理的生产活动，使得附生绿藻被集中清理入海，可能成为每年黄海绿潮的重要源头。利用SCAR标记，已证实漂浮生态型可在筏架绿藻中检出，并进一步追踪了其在绿潮过程中的动态变化、评估了其向岸基扩散以及北侵的风险。

尽管SCAR标记具有突出的特异性，但根据漂浮浒苔基因组序列（NCBI序列号：GCA004138255），分析发现SCAR标记为细胞核基因组编码的单拷贝的分子标记。由于拷贝数极低，阳性样本的成功扩增高度依赖于海藻样本较好的生理状态、以及高质量总DNA模板的制备。因此，在对大量样本进行检测时，会产生一定比例假阴性的结果，需要对阴性样本重复检测以进行确认。

为了构建黄海绿潮预警预报的量化模型，需要对浒苔漂浮生态型在绿潮各阶段、尤其是早期阶段的样本占比进行动态、高通量的精准调查，这无疑将依赖于特异分子标记在稳定性、可靠性方面的进一步提升，细胞器基因组来源的分子标记具有高拷贝数的特点，可以满足这一要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄海绿潮致因种——浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记，可以快速、简单、稳定、准确地对引发黄海大规模绿潮的浒苔漂浮生态型进行分子鉴定，弥补SCAR标记在分析大样本量时在稳定性方面的不足，为黄海浒苔绿潮的早期预警、过程跟踪以及浒苔漂浮生态型向其他生境的扩散入侵监测提供重要的分子工具。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记扩增引物，浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记扩增引物为：

上游引物：5’-ACCAACAAATACCCCATTCTTTGA-3’

下游引物：5’-TTTCTCTCCATACCCCCATCG-3’。

所述引物扩增浒苔漂浮生态型（floating ecotype）叶绿体基因组特异分子标记，扩增标记在用于对黄海浒苔绿潮的早期预警、过程跟踪监测，以及浒苔漂浮生态型向其他生境的扩散入侵监测中的应用。

一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记，浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记为SEQ ID NO.1中碱基序列所示。

一种所述浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记的应用，所述浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记用于黄海浒苔绿潮的早期预警，对鉴定浒苔漂浮生态型占比的应用。

一种所述浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记的应用，所述浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记用于黄海浒苔绿潮的过程跟踪监测，对鉴定浒苔漂浮生态型占比的应用。

一种所述浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记的应用，所述浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记用于浒苔漂浮生态型向其他生境的扩散入侵监测，对鉴定浒苔漂浮生态型占比的应用。

一种鉴定漂浮生态型浒苔的检测试剂盒，试剂盒含所述的引物。

所述试剂盒还含有缓冲液、Taq酶等，例如， ddH2O，Taq Master Mix。

一种鉴定漂浮生态型浒苔的方法：

以所述的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记特异引物，对浒苔中提取的总DNA进行PCR扩增；

以浒苔漂浮生态型的基因组为模板、浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记引物对进行扩增，扩增获得一条约966 bp的特异性条带，特征条带即为SEQ ID NO.1中所示的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记，扩增结果为样品阳性；

未扩增出特异性条带，扩增结果为样品阴性。

所述PCR扩增体系为：25 μl，含9.5 μl ddH

引物的PCR扩增程序为：94℃×10 min；94℃×45 s、52.5℃×45 s、72℃×1 min，35个循环；72℃×10 min；4℃保存。

所述通过检测上述的特异性片段来完成，步骤包括待检测浒苔基因组总DNA提取，PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，检测后将目的片段回收，利用克隆载体pGEM-TEasy Vector及大肠杆菌感受态菌株TOP10进行克隆等技术获得。

与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：

1.现有浒苔漂浮生态型特异SCAR分子标记为细胞核基因组编码的单拷贝的分子标记，由于拷贝数极低，阳性样本的成功扩增高度依赖于海藻样本较好的生理状态、以及高质量总DNA模板的制备。因此，在对大量样本进行检测时，会产生一定比例假阴性的结果，需要对阴性样本重复检测以进行确认。而本发明提供了一种叶绿体基因组编码的特异分子标记，除了对漂浮生态型仍保持高度特异性，同时具有高拷贝数的特征，从而显著提升了检测的稳定性和可靠性，提高了工作效率。

2.本发明提供的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记，可为黄海浒苔绿潮的早期预警、过程跟踪以及浒苔漂浮生态型向其他生境的扩散入侵监测提供重要的分子工具。

附图说明

图1为本发明实施例提供的对比细胞核编码SCAR标记（A）与叶绿体编码新标记（B）在黄海漂浮浒苔中的扩增。M：Trans2K Plus II DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；1-5：5个2020年黄海绿潮浒苔单株；6-13，18-39：30个2019年黄海绿潮浒苔单株；14-17：4个2018年黄海绿潮浒苔单株；PC：阳性对照；BC：空白对照。

图2为本发明实施例提供的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记在多年黄海绿潮漂浮浒苔（

图3为本发明实施例提供的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记在浒苔定生群体样本中的扩增。M：Trans2K Plus II DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；1-18：山东威海群体18个样本；19-20：浙江宁波群体2个样本；21-22：江苏盐城群体2个样本；23-25，56，72-74，76：福建福州群体8个样本；26-32：福建宁德群体7个样本；33：日本群体1个样本；34：韩国群体1个样本； 35-37：浙江舟山群体3个样本；38-44，57-71：福建厦门群体12个样本；45-55：福建东山群体11个样本；75：福建泉州群体1个样本；PC：阳性对照；BC：空白对照。

图4为本发明实施例提供的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记在中国沿海具有广泛代表性的其他石莼属（

图5为本发明实施例提供的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记在紫菜筏架附生绿藻各物种中的扩增。M：Trans2K Plus II DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司); M：Trans2K Plus II DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；1-2，8-22，27-33，35-66：46个曲浒苔

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用做进一步详细说明。

本发明利用所述引物进行扩增，从浒苔漂浮生态型基因组中可获得一条约966 bp的特异性条带，而以浒苔定生群体样本或石莼属其他物种的基因组为模板，扩增结果为阴性，说明该标记是浒苔漂浮生态型特异分子标记（SEQ ID NO.1）。由此本发明提供的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异性引物或分子标记，可为黄海浒苔绿潮的早期预警、过程跟踪以及浒苔漂浮生态型向其他生境的扩散入侵监测提供重要的分子工具。

实施例1：浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记的设计、筛选与验证

以石莼属浒苔（

再利用第二代高通量测序技术分别进行测序，基于NCBI已经公开的石莼属物种叶绿体基因组（如KP720616、NC036137、NC030312等）为参考序列，对二者分别进行叶绿体基因组序列的拼接、组装和注释，从而分别获得上述浒苔漂浮生态型样本、以及浒苔定生群体样本的叶绿体基因组完成图。

以此为基础，利用比较基因组研究方法，对二者的基因组结构变异 (SV)、indel、SNP、简单重复序列（SSR)等指标进行了比较与分析，获得了二者的序列变异特征，明确了二者间主要的核苷酸序列差异及其位置。基于上述生物信息学分析结果，针对选定的多个差异序列，利用Primer 3软件共设计、合成特异性扩增引物，引物设计原则是：1）在浒苔漂浮生态型样本叶绿体基因组中可完全同源匹配；2）在浒苔定生群体样本、以及NCBI中石莼属其他物种的叶绿体基因组中均不能匹配。

最终确定浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记的扩增引物为：

上游引物：5’-ACCAACAAATACCCCATTCTTTGA-3’

下游引物：5’-TTTCTCTCCATACCCCCATCG-3’

再以上述样本材料，利用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒，按照其说明分别制备各样本的基因组总DNA模板，利用上述获得引物分别进行扩增检验。

25 μl PCR反应体系包括：9.5 μl ddH

引物的PCR扩增程序为：94℃×10 min；94℃×45 s、52.5℃×45 s、72℃×1 min，35个循环；72℃×10 min；4℃保存。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的条带，经克隆测序获得引物扩增产物966 bp，即浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记（SEQ ID NO.1）。

SEQ ID NO.1：

ACCAACAAATACCCCATTCTTTGAAAATAGATAGGTTCAAAGTTTTGTTCAAATTTAAAGGAAAACCAGCAAACTTGACCTATAGTAAGTTCAAAAAAGAAAAAGAATATTTAGAAAACCGTTACGGTTTCAATATAGAAGATTTTGCCTCGATAGTGGGTGTTTCAATGGCTGGGTTAGAGTTGATATCGCCAAATAATAAATATGATTTGTGTGAGGTGGATTTTGACAAATTCAATAAATTCTTCACCGAATCGAAGGTTAATAATATTTTGGAGTTAAAATATTTTGAAAATTTAACTTACAAAGAGCTTTTGGTTGAATTGTTTGAAGAGCGTAGTTATCGCGAGCGCACTATATACAATAAATCTTTAAATGAGGATGGTTTGAAAAAAATGCACATTTTTAATACAAATAAATATGATATAAGCGAAAATGATTTCGACCTTAAGCTAACAAAAACTAAATGGTTTTGTTCGGTAAACCAAACACAGTACGATATATAAATGATTGTTCGGTCGAACAATCATTTATAATAAAGTTAGCCCGAAAGAACAAAAGCTTTTATACTTTGTTCGGAAGTATAAAATACATAATTTAAAAATCTAAAAAAAAGCATTTTTAATCGATGCGATTAAGCGAACATTTAAAAACGACTTTGTTCGCTTAATCTAACAAAAACACTTTTCATCTGTTCTTATTACAAAACATAATATATGTTCTGTTCTTTCTCAGAGTAAAGCATTTTGTTATAAAAAATTACTTTAAAAAAAAATTTTTTAATTTAAAAATTATTTTTTAAAAATACCAAAATTACTGATTTTAAAAATTTACATTGATTTGCGATTTCGACCAAATTTTTATTGATGTATTAAAAAAGGAAAACAAACTCAATCTAACCCTAGATAATTTAAACTTAATAAAAGAATATTATTCATACCCCTACGATGGGGGTATGGAGAGAAA

（a）序列特征：

●长度：966 bp

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：浒苔（

序列结构特点：无

实施例2：对比细胞核编码SCAR标记与叶绿体编码新标记在检测黄海绿潮藻中的效果

根据已公开的黄海漂浮浒苔基因组序列（NCBI序列号：GCA004138255），生物信息学分析发现，之前开发的浒苔漂浮生态型特异SCAR标记为细胞核基因组编码，且为单拷贝的分子标记。由于拷贝数极低，阳性样本的成功扩增高度依赖于海藻样本需具有较好的生理状态、以及高质量总DNA模板的制备。因此，在对大量样本进行检测时，会产生一定比例假阴性的结果，需要重复检测以反复确认。

针对上述问题，随机选择2018-2020年采自黄海绿潮暴发期的39个漂浮绿藻样本，利用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒，按照其说明分别制备各单株样本的基因组总DNA模板。

首先，利用ITS、5S间隔区、

利用上述实施例记载特异性引物进行扩增，扩增体系和程序按照实施例1记载的方式进行；

使用SCAR分子标记进行PCR扩增条件，详见Genetic analyses of floating

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示：1）在所有39个漂浮浒苔样本中（编号为1-39），SCAR分子标记的单次检测阳性率为58.97%，阳性样本均显示有830 bp的特征性条带，共有16个样本的扩增结果为阴性（见图1（A））；2）同一批39个漂浮浒苔样本，使用浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记（SEQ ID NO.1）的单次PCR扩增结果均为阳性，每一泳道均显示扩增有966 bp的特征性条带（见图1（B））。

上述结果表明，本发明的浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记（SEQ IDNO.1），较之前的SCAR分子标记，具有更好的检测灵敏度，检测结果更加真实可靠。

实施例3

由上述实施例本发明获得特异性引物以及标记检测灵敏度更高，检测结果更加真实可靠，进而对于大量样品进行分析：

利用上述实施例1获得引物作为特异性引物，并按照实施例1记载的扩增体系和程序，对采自历年黄海绿潮的浒苔漂浮生态型样本、广泛地理范围采集的浒苔定生群体样本、以及在中国沿海具有广泛代表性的其他石莼属（

样品采自历年黄海绿潮的浒苔漂浮生态型样本、广泛地理范围采集的浒苔定生群体样本、以及在中国沿海具有广泛代表性的其他石莼属（

结果显示：1）在所有79个浒苔漂浮生态型样本中（编号为1-79），浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记（SEQ ID NO.1）的扩增结果均为阳性，得到966 bp特征性条带（见图1）；2）在总计11浒苔定生群体共76个样本中（编号为1-76），浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记（SEQ ID NO.1）的扩增结果均为阴性（见图2）；3）在中国沿海具有广泛代表性的共73个其他石莼属（

上述结果表明，本发明提供的叶绿体基因组分子标记（SEQ ID NO.1）针对浒苔漂浮生态型具有高度的特异性。

实施例4：新标记在黄海绿潮早期（紫菜筏架附生阶段）监测中的应用

大量研究表明，位于苏北辐射沙洲的大面积条斑紫菜养殖筏架与绠绳，成为石莼属绿藻大量附生的重要基质；另外，伴随紫菜收获以及筏架、绠绳回收清理的生产活动，使得附生绿藻被集中清理入海，成为每年黄海绿潮的重要源头。值得注意的是，筏架附生绿藻由石莼属（

前期研究还表明，筏架附生绿藻的物种组成与所占比例，在不同年份会有较大变化，而浒苔漂浮生态型的占比与当年绿潮规模存在相关性。因此，加强对苏北辐射沙洲紫菜筏架附生绿藻中浒苔漂浮生态型所占比例的早期检测，可以为黄海绿潮的早期监测、规模预测以及预警预报，提供重要的科学依据。

为了验证开展早期监测的实际效果，在苏北辐射沙洲条斑紫菜栽培区，于2020年春季开展了筏架附生绿藻样本的采集，采集后随机选择75个健康、形态完整的绿藻样本，利用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒，按照其说明分别制备各单株样本的基因组总DNA模板，而后对其进行检测分析，具体为：

对选取的样本首先，利用ITS、5S间隔区、

上述结果表明，针对苏北浅滩紫菜筏架附生绿藻现有的物种组成特征，本发明的叶绿体特异分子标记，可用于特异性对浒苔漂浮生态型实现快速、准确的检出，这将为黄海绿潮的早期监测、规模预测以及预警预报，提供重要的分子工具和基础数据。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accaacaaat accccattct ttgaaaatag ataggttcaa agttttgttc aaatttaaag 60

gaaaaccagc aaacttgacc tatagtaagt tcaaaaaaga aaaagaatat ttagaaaacc 120

gttacggttt caatatagaa gattttgcct cgatagtggg tgtttcaatg gctgggttag 180

agttgatatc gccaaataat aaatatgatt tgtgtgaggt ggattttgac aaattcaata 240

aattcttcac cgaatcgaag gttaataata ttttggagtt aaaatatttt gaaaatttaa 300

cttacaaaga gcttttggtt gaattgtttg aagagcgtag ttatcgcgag cgcactatat 360

acaataaatc tttaaatgag gatggtttga aaaaaatgca catttttaat acaaataaat 420

atgatataag cgaaaatgat ttcgacctta agctaacaaa aactaaatgg ttttgttcgg 480

taaaccaaac acagtacgat atataaatga ttgttcggtc gaacaatcat ttataataaa 540

gttagcccga aagaacaaaa gcttttatac tttgttcgga agtataaaat acataattta 600

aaaatctaaa aaaaagcatt tttaatcgat gcgattaagc gaacatttaa aaacgacttt 660

gttcgcttaa tctaacaaaa acacttttca tctgttctta ttacaaaaca taatatatgt 720

tctgttcttt ctcagagtaa agcattttgt tataaaaaat tactttaaaa aaaaattttt 780

taatttaaaa attatttttt aaaaatacca aaattactga ttttaaaaat ttacattgat 840

ttgcgatttc gaccaaattt ttattgatgt attaaaaaag gaaaacaaac tcaatctaac 900

cctagataat ttaaacttaa taaaagaata ttattcatac ccctacgatg ggggtatgga 960

gagaaa 966

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accaacaaat accccattct ttga 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttctctcca tacccccatc g 21