基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法、电极

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法、电极，所述基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法包括：CC/GWs/AuPt传感电极的制备；CC/GWs/AuPt传感电极的物理表征及相关电化学性能测试；CC/GWs/AuPt电极上细胞培养及实时检测活细胞释放的H2O2；CC/GWs/AuPt传感电极上细胞生长状态的表征。本发明构建的CC/GWs/AuPt柔性传感平台创造更贴近真实三维生理环境来培养细胞，使得细胞释放的待测物能够直接与传感电极接触，促进电子传递，提高传感电极的检测效率和精确度，在生物分子的原位实时分析检测和动态监测领域具有很大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法、电极。

背景技术

目前，活性氧(ROS)是生物体内氧的单电子还原产物的总称，在细胞信号转导和维持体内平衡中具有非常重要的作用，实例包括超氧阴离子(O

目前，对于细胞内外ROS定量检测采用的分析方法大体有化学反应法、化学发光法、荧光法、分光光度法和电化学方法等。其中，荧光分析法和电化学方法是研究最为广泛的能够实现ROS直接定量检测的方法。荧光分析法是一种比较成熟的检测方法应用于活细胞ROS的实时检测，但是该方法的稳定性和重复性有待提高，加上仪器构制较复杂，实现过氧化氢的实时监测尚存困难，限制其在超低浓度ROS检测的应用。分光光度法由于其采用的探针分子简单、操作方便、分析速度快等优点至今一直是常用的细胞中小分子物质的检测方法之一。但是和荧光法相比其灵敏度较低，而且在检测细胞内活性分子时，染料分子的使用不仅使得检测程序复杂化，而且也会对生理样品等带来毒害作用，因此在以活细胞等生理样品为检测对象时具有较大的局限性。

电化学方法以快速、灵敏、操作简便、灵敏度高及易构造特异性传感界面等优点，已被广泛应用于活细胞释放ROS的原位实时检测。Zhao等研究构建了一种在三维石墨烯上原位生长的超小Fe

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有荧光分析法的稳定性和重复性有待提高，加上仪器构制较复杂，实现过氧化氢的实时监测尚存困难，限制其在超低浓度ROS检测的应用。

(2)分光光度法和荧光法相比其灵敏度较低，而且在检测细胞内活性分子时，染料分子的使用不仅使得检测程序复杂化，而且也会对生理样品等带来毒害作用，因此在以活细胞等生理样品为检测对象时具有较大的局限性。

(3)现有技术并无进行过氧化氢浓度的实时监测的技术，难以建立三维催化传感界面贴近真实生理情况实现细胞培养和检测一体化，进而对活细胞释放的过氧化氢进行原位实时检测。

解决以上问题及缺陷的难度为：过氧化氢分子的半衰期短、活性高、易转化成其他的分子，细胞分泌的过氧化氢分子浓度较低，对传感器的灵敏度要求较高；想要实现活细胞过氧化氢的原位检测具有一定难度，细胞原位生长对检测平台要求比较高，其传感界面要求有好的生物相容性、良好的细胞粘附界面和优异的催化性能等。

解决以上问题及缺陷的意义为：构建具有特异性催化的传感界面，复合纳米材料提高传感器的灵敏度，构建三维的具有良好生物相容性的传感界面用于活细胞直接贴附生长，实现细胞培养与检测的一体化，取代传统的微电极分析方式，原位捕获并实时检测细胞释放出的过氧化氢，建立活细胞释放过氧化氢的实时分析和可控监测平台。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法、电极。

本发明是这样实现的，一种基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法，所述基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法包括：

(1)基于具有独特三维迷宫结构的GWs，构建活细胞直接生长的三维CC/GWs/AuPt生物传感界面用于原位实时检测细胞释放H

(2)采用RF-PECVD法在碳布上进行原位垂直生长GWs；

(3)通过i-t电沉积将AuPt纳米粒子修饰到CC/GWs的骨架及壁上，构建对H

(4)采用CC/GWs/AuPt柔性传感电极对H

(5)以构建的CC/GWs/AuPt传感电极作为细胞的生长平台，并在所述生长平台上培养人体肺癌细胞A549，将细胞生长良好的传感电极制备成为活细胞生物传感器CC/GWs/AuPt/A549，在药物刺激下通过计时电流法对细胞释放的H

进一步，所述基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法包括以下步骤：

步骤一，CC/GWs/AuPt传感电极的制备；

步骤二，CC/GWs/AuPt传感电极的物理表征及相关电化学性能测试；

步骤三，CC/GWs/AuPt电极上细胞培养及实时检测活细胞释放的H

步骤四，CC/GWs/AuPt传感电极上细胞生长状态的表征。

进一步，步骤二中，所述CC/GWs/AuPt传感电极的物理表征及相关电化学性能测试，包括：

(1)将CC/GWs/AuPt传感电极采用场发射电子显微镜FESEM来分析其表面形貌特征和AuPt纳米颗粒的尺寸及表面分布状态，使用X射线光电子能谱XPS对所制备传感电极的表面元素化学态进行分析；

(2)所有的电化学测试中，循环伏安法CV、交流阻抗法EIS和计时电流法i-t使用CHI 760E电化学工作站，采用由铂丝电极Pt对电极、银/氯化银Ag/AgCl参比电极，CC/GWs/AuPt工作电极构成的三电极系统；

(3)CC/GWs/AuPt电极对H

进一步，所述CV的测试参数为：工作电压范围为-1.0～1.0V，扫描速率为50mV s

进一步，步骤三中，所述CC/GWs/AuPt电极上细胞培养及实时检测活细胞释放的H

(1)在电沉积AuPt之前，将CC/GWs电极先进行在氧气下等离子体表面处理20s，使电极更有利于细胞的粘附和生长；

(2)将CC/GWs/AuPt电极用75％乙醇和紫外光灭菌处理；将预处理好的CC/GWs/AuPt电极置于六孔板中，以1×10

(3)使用的培养基为含有10％的牛胎血清和1％的青霉素/链霉素双抗溶液的RPMI-1640培养基，培养24h后，将生长A549细胞的CC/GWs/AuPt电极置于电化学检测系统中进行细胞释放H

(4)注射4μM fMLP刺激药物到检测系统中，刺激细胞释放H

(5)在相同的实验条件下，同时加入将10μL 200μg mL

进一步，步骤四中，所述CC/GWs/AuPt传感电极上细胞生长状态的表征，包括：

(1)利用Calcein-AM试剂盒对生长在CC/GWs/AuPt电极上的A549细胞进行荧光染色，向5mL D-PBS中加入5μL4mM的Calcein-AM和10μL 2mM的EthD-1，使得Calcein-AM的终浓度为4μM；

(2)培养细胞24h后，吸掉六孔板里的培养基后，用灭菌PBS溶液清洗3次电极，紧接着加入200μL配制好的Calcein-AM/EthD-1染色液，并在37℃培养箱中避光孵育40min，而后取出用灭菌PBS缓冲液清洗3次，置于荧光显微镜下观察细胞在电极上的生长状态；

(3)采用细胞固定液对生长在CC/GWs/AuPt传感电极上的A549细胞进行固定，固定30min后，用0.01M PBS清洗3次；分别用10％、30％、50％、70％、90％、100％的无水乙醇梯度脱水，采用SEM对其生长状态进行进一步的观察。

进一步，步骤(1)中，所述荧光染色为活细胞染色，绿色荧光。

进一步，步骤(3)中，所述细胞固定液为4％多聚甲醛。

本发明的另一目的在于听过一种应用所述的基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法制备得到的电极。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法、电极，基于具有独特三维迷宫结构的GWs，进一步构建了活细胞直接生长的三维CC/GWs/AuPt生物传感界面用于原位实时检测细胞释放H

本发明围绕具有独特三维迷宫结构的GWs，构建了一种纳米颗粒修饰的CC/GWs/AuPt柔性传感电极用于细胞释放H

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法流程图。

图2是本发明实施例提供的细胞直接生长的CC/GWs/AuPt传感电极用于实时检测活细胞释放的H

图3(A)是本发明实施例提供的所制备的柔性CC/GWs实物图(对折)。

图3(B)是本发明实施例提供的柔性CC/GWs裁剪为1cm×1cm的尺寸图。

图4(A)-图4(B)是本发明实施例提供的裸CC的SEM图。

图4(C)-图4(D)是本发明实施例提供的CC/GWs的SEM图。

图4(E)是本发明实施例提供的CC/GWs/AuPt的SEM图。

图4(F)是本发明实施例提供的CC/GWs/AuPt的EDS面扫描结果示意图。

图5(A)是本发明实施例提供的CC/GWs/AuPt的XPS全谱图表征示意图。

图5(B)是本发明实施例提供的C1s的高分辨XPS谱图。

图5(C)是本发明实施例提供的Au 4f的高分辨XPS谱图。

图5(D)是本发明实施例提供的Pt4f的高分辨XPS谱图。

图6(A)是本发明实施例提供的裸CC、CC/GWs、CC/AuPt以及CC/GWs/AuPt电极在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)

图6(B)是本发明实施例提供的裸CC、CC/GWs、CC/AuPt以及CC/GWs/AuPt电极在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)

图7(A)是本发明实施例提供的裸CC、CC/GWs、CC/AuPt和CC/GWs/AuPt传感电极在含有5mM H

图7(B)是本发明实施例提供的裸CC、CC/GWs、CC/AuPt和CC/GWs/AuPt传感电极在含有5mM H

图7(C)是本发明实施例提供的柔性CC/GWs/AuPt电极在含有0、1、2和5mMH

图8(A)是本发明实施例提供的柔性CC/GWs/AuPt传感电极在含有2mMH

图8(B)是本发明实施例提供的峰值电流与扫描速率之间的线性关系示意图。

图9(A)是本发明实施例提供的不同工作电位下，柔性CC/GWs/AuPt传感电极对H

图9(B)是本发明实施例提供的图9(A)对应的拟合散点图(n＝3)。

图10(A)是本发明实施例提供的在-0.32V工作电压下，柔性CC/GWs/AuPt传感电极在N

图10(C)是本发明实施例提供的图10(A)的低浓度区放大图。

图10(B)-图10(D)是本发明实施例提供的图10(A)和图10(C)的响应电流与H2O2浓度的线性关系曲线示意图。

图11(A)是本发明实施例提供的柔性CC/GWs/AuPt传感电极对H

图11(B)是本发明实施例提供的5支CC/GWs/AuPt传感电极对0.1mM H

图12(A)是本发明实施例提供的A549细胞显微镜图。

图12(B)-图12(D)是本发明实施例提供的柔性CC/GWs/AuPt传感电极上培养A549细胞的荧光显微镜图。

图12(E)-图12(F)是本发明实施例提供的柔性CC/GWs/AuPt传感电极上培养的A549细胞的SEM图。

图13(A)是本发明实施例提供的柔性CC/GWs/AuPt传感电极上培养的A549细胞的实物照片。

图13(B)是本发明实施例提供的传统三电极系统下测试装置照片。

图13(C)是本发明实施例提供的药物刺激下，柔性CC/GWs/AuPt传感电极上细胞释放H

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法、电极，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基于三维传感的活细胞中过氧化氢浓度的监测方法包括以下步骤：

S101，CC/GWs/AuPt传感电极的制备；

S102，CC/GWs/AuPt传感电极的物理表征及相关电化学性能测试；

S103，CC/GWs/AuPt电极上细胞培养及实时检测活细胞释放的H

S104，CC/GWs/AuPt传感电极上细胞生长状态的表征。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

1、发明概述

理想的电化学生物传感检测平台不仅需要具有良好的催化性能和优异的选择性的同时，更需具备良好的生物相容性和贴近真实生理情况的生长环境。本发明基于具有独特三维迷宫结构的GWs，进一步构建了活细胞直接生长的三维CC/GWs/AuPt生物传感界面用于原位实时检测细胞释放H

2、发明内容

2.1实验部分

2.1.1试剂和仪器(见表1-2)

表1主要试剂

表2主要设备

2.1.2CC/GWs/AuPt传感电极的物理表征及相关电化学性能测试

所制备的CC/GWs/AuPt传感电极采用场发射电子显微镜(FESEM)来分析其表面形貌特征和AuPt纳米颗粒的尺寸及表面分布状态，使用X射线光电子能谱(XPS)对所制备传感电极的表面元素化学态进行分析。所有的电化学测试如循环伏安法(CV)、交流阻抗法(EIS)和计时电流法(i-t)等使用CHI 760E电化学工作站，采用由铂丝电极(Pt)对电极、银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极，CC/GWs/AuPt工作电极构成的三电极系统。CC/GWs/AuPt电极对H

2.1.3CC/GWs/AuPt电极上细胞培养及实时检测活细胞释放的H

为了研究活细胞在CC/GWs/AuPt传感电极上的生长状态和特性。首先，在电沉积AuPt之前，将CC/GWs电极先进行在氧气下等离子体表面处理20s，使电极更有利于细胞的粘附和生长。然后，将CC/GWs/AuPt电极用75％乙醇和紫外光灭菌处理。预处理好的CC/GWs/AuPt电极置于六孔板中，随后以1×10

2.1.4CC/GWs/AuPt传感电极上细胞生长状态的表征

为了更好地观察A549细胞在CC/GWs/AuPt传感电极上的生长状态，利用Calcein-AM试剂盒对生长在CC/GWs/AuPt电极上的A549细胞进行荧光染色(活细胞染色，绿色荧光)，向5mL D-PBS中加入5μL 4mM的Calcein-AM和10μL 2mM的EthD-1，使得Calcein-AM的终浓度为4μM。培养细胞24h后，吸掉六孔板里的培养基后，用灭菌PBS溶液清洗3次电极，紧接着加入200μL配制好的Calcein-AM/EthD-1染色液，并在37℃培养箱中避光孵育40min，而后取出用灭菌PBS缓冲液清洗3次，置于荧光显微镜下观察细胞在电极上的生长状态。此外，采用细胞固定液(4％多聚甲醛)对生长在CC/GWs/AuPt传感电极上的A549细胞进行固定，固定30min后，用0.01M PBS清洗3次，接下来分别用10％、30％、50％、70％、90％、100％的无水乙醇梯度脱水，采用SEM对其生长状态进行进一步的观察。

2.2结果与讨论

2.2.1CC/GWs/AuPt传感电极的形貌及组成成分表征

通过图3A可观察到，所制备的黑色的柔性CC/GWs具有非常好的柔性，可以承受很大的物理变形，进行对折后仍可以恢复原来的外形。所制备的CC/GWs除了柔性以外还具有易携带、易加工裁剪等性能。图3B为将CC/GWs加工为1cm×1cm的方形，并用环氧树脂进行封边处理后，用铂片电极夹夹住CC/GWs进行进一步电化学沉积和测试实验，使其有效面积约为0.9×0.9cm

采用SEM研究裸CC、CC/GWs和CC/GWs/AuPt电极的微观形貌特征(见图4)。如图4A和B所示，碳布(CC)是由多根表面光滑的碳纤维互相交织形成。而图4C和D展示了大量褶皱的石墨烯纳米片连续垂直生长在平滑的碳纤维上形成了层层叠叠的石墨烯墙(GWs)。这种独特的三维结构提供了巨大的比表面积，有利于AuPt的大量沉积，同时也为细胞的粘附以及生长提供了有利的环境。从图4E的高倍SEM中可以看出，大量AuPt纳米颗粒通过电沉积均匀分布在GWs的骨架和内部壁任意面上，其中纳米颗粒的尺寸分布为20～40nm。进一步图4F的EDS面扫描结果表明CC/GWs/AuPt电极中所含的元素为C、Au和Pt，并且这三种元素在电极表面上分布均匀。

采用X-射线光电子能谱图(XPS)进一步分析所制备CC/GWs/AuPt电极的表面元素化学态和结构组成。图5A的XPS全谱图显示了该电极含有C、Au和Pt元素，其中C来自于碳纤维和石墨烯。从图5B的C1s高分辨XPS谱图中可以观察到，主峰在284.78eV呈现了C-C的特征峰，而结合能为286.28eV对应C-O官能团，可能归因于其表面经过氧气等离子体处理。图5C显示了Au 4f高分辨XPS谱图中的84.13eV和87.78eV结合能分别对应于Au 4f

2.2.2CC/GWs/AuPt传感电极的电化学行为表征

首先，本发明采用CV法研究了裸CC、CC/GWs、CC/AuPt以及CC/GWs/AuPt电极在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)

2.2.3CC/GWs/AuPt传感电极对H

采用CV法和计时电流法(i-t)考察了所制备的柔性CC/GWs/AuPt传感电极在10mL的0.01M PBS(pH 7.4)体系中对H

为了探究H

2.2.4CC/GWs/AuPt传感电极对H

本发明采用计时电流法(i-t)研究了在不同工作电位下，CC/GWs/AuPt传感电极对H

同样地，采用i-t测量了柔性CC/GWs/AuPt传感电极在-0.32V的工作电位下对H

表3在10mL的0.01MPBS水溶液中每间隔100s连续滴加5μL的浓度不断增加的H

表4所制备传感器与其他电化学H

2.2.5CC/GWs/AuPt传感电极的选择性和重现性研究

在实际样品检测中，传感器的选择性与重现性是两个非常重要影响因素。本发明利用i-t曲线记录了几种干扰物质(葡萄糖(Glu)、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、色氨酸(Trp)、抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)和尿酸(UA))对CC/GWs/AuPt传感电极检测H

如图11A所示，在-0.32V工作电压下，当加入150μM H

2.2.6活细胞生长的CC/GWs/AuPt传感电极的H

细胞在传感基质上的附着和生长对于细胞活体释放的目标生物分子的原位检测至关重要。本发明探索了在柔性的CC/GWs/AuPt传感电极上直接进行细胞培养，使传感器能够及时捕获并检测细胞释放的H

A549细胞在柔性CC/GWs/AuPt传感电极上培养24h后，采用计时电流法(i-t)对其细胞释放H

3、结论

本发明围绕具有独特三维迷宫结构的GWs，构建了一种纳米颗粒修饰的CC/GWs/AuPt柔性传感电极用于细胞释放H

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。