一种3D打印脱细胞基质预防外耳道狭窄支架及制备方法

摘要

本发明公开了一种3D打印脱细胞基质预防外耳道狭窄支架，包括支架帽、支架主体和支架尾部。支架帽呈T型翼状，防止支架脱落和移位。支架尾部呈卷曲半圆形，防止渗液及分泌物流入鼓膜，引起鼓膜炎和鼓膜穿孔，经鼓膜穿孔处流入中耳腔，引起炎症扩散。支架主体呈圆管状，可以起到加压止血的作用，管体上有圆形小孔，可以起到充分引流耳道皮肤渗液及分泌物的作用，也可行耳道内给药。本发明的可降解复合型管状支架的三维多孔状，具有良好的生物相容性及力学性质，兼备弹性与柔韧性，能保持稳定的管状形态。采用本发明进行外耳道重建，可以在手术室的短时间内快速构建，无需进行自体皮肤取材，避免了取材部位可能引起的并发症。

说明书

技术领域

本发明属于植入人体的医疗器械技术领域，涉及外耳道支架以及制备方法，具体是一种用于预防患者外耳道闭锁或狭窄，帮助患者外耳道重建的3D打印外耳道支架。

背景技术

各种原因会导致外耳道闭锁或狭窄，主要是由炎症、外伤、物理化学伤及医源性等原因造成，为肉芽瘢痕软组织填塞。目前主要治疗方式有：采用手术治疗——外耳道成形术；切除瘢痕组织，将深部断面对位缝合；若皮肤部分缺损，无法对位缝合，应尽量去除瘢痕组织，再行植皮手术。但治疗方法仍存在问题：①遭受外伤或烧伤的患者来院治疗时，医师均以抢救生命为主，错过了最佳治疗时机；②外耳道闭锁或狭窄除外耳道成形术外，目前还没有很好的预防和治疗方式。且外耳道成形术也存在不足之处：①感染：炎症因子导致术后再次狭窄或闭锁；②耳道皮肤：健康、完整的耳道皮肤是外耳道成形手术成功的关键，若术后出现皮肤挛缩，导致过多的骨质暴露，会造成骨质增生及肉芽组织形成，从而再次出现纤维狭窄和膜性闭锁。

因创伤、炎症或先天引起的外耳道狭窄是临床常见疾病，由于软骨组织内无血管、神经且结构致密，其自我修复能力非常有限。近年来，利用组织工程技术修复软骨损伤具有很好的应用前景和巨大的临床意义。其中，支架在软骨组织修复中扮演了重要的角色。

目前，一些天然材料（如胶原、明胶、壳聚糖、丝素蛋白等）和合成材料（如聚乳酸、聚己内酯和聚乙烯醇等）都已经被研究者加工制备成各种支架应用于外耳道修复的研究中。但是，天然材料的生物力学强度低，合成材料生物相容性较差。真皮脱细胞基质是天然成分，具有细胞相容性好，促进真皮组织再生等优点，是一种理想的真皮组织工程支架材料。

天然真皮组织经脱细胞后其结构致密，难以满足真皮细胞或者干细胞长入的要求，严重制约了其在组织修复中的应用。研究者将真皮脱细胞基质粉碎后冷冻干燥，制备成多孔海绵，可以满足细胞长入的要求。但是，多孔海绵支架其内部孔径不可控制，且很难制备成复杂形状的支架。且外耳道内支架术后同样存在很多问题，批量化生产的外耳道支架无法准确满足预防外耳道狭窄的个体化需求；儿童病人外耳道狭窄随着生长不断发展，现有的外耳道支架无法很好的保证治疗效果等。

近年来，利用三维（3D）打印技术制备组织工程支架显示了巨大的优势，各种三维打印支架已应用于不同的组织器官的修复研究中。三维打印技术与传统的组织工程支架制备技术相比，具有形状可控和孔径可控的优点，可以个性化仿生制备软骨组织工程支架。目前，利用三维打印技术制备真皮脱细胞基质的研究较少。文献（Nature Communications2014;5:3935）报道了一种三维打印脱细胞基质的方法，该方法只能打印单层的基质，难以打印复杂结构的支架且力学非常弱。为了增强脱细胞基质的力学强度，研究者通过增加打印聚己内酯层来固定脱细胞基质，这显然增大了制备过程的复杂程度，以及大大延长了支架材料的降解时间，这将会影响支架在真皮组织的修复效果。

发明内容

本发明目的是针对现有补片材料取量受限、取材部位易引起并发症的不足之处，提供一种可降解的复合型管状支架及制备方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种3D打印脱细胞基质预防外耳道狭窄支架，包括圆管状的支架主体，所述支架主体前端呈T型设有翼圆状的支架帽，所述支架主体尾端呈内卷曲半圆形；所述支架主体采用可降解的高分子材料和真皮脱细胞基质制成。

进一步优选的，可降解的高分子材料采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA。所述真皮脱细胞基质采用包皮手术切除的废弃皮肤经脱细胞处理制备而成的基质。所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA与脱细胞基质的质量比为1:3。

该可降解的组织工程支架包括支架帽、支架主体和支架尾部。支架帽呈T型翼状，防止支架脱落和移位。支架尾部呈卷曲半圆形，防止渗液及分泌物流入鼓膜，引起鼓膜炎和鼓膜穿孔，经鼓膜穿孔处流入中耳腔，引起炎症扩散。支架主体呈圆管状，可以起到加压止血的作用，管体上均布有圆形小孔，可以起到充分引流耳道皮肤渗液及分泌物的作用，也可行耳道内给药。

上述3D打印脱细胞基质预防外耳道狭窄支架的制备方法，包括如下步骤：

（1）、制备真皮脱细胞基质

将真皮首先放于钴

（2）、制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA

聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA由聚乳酸PLA和聚羟基乙酸PGA按照75:25的摩尔比组成；

（3）、制备生物墨水

将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶液中加入NaCl颗粒，其中NaCl颗粒与PLGA的质量比为0.5~2:1，干燥后将PLGA浸泡在1%戊二醛溶液中交联，温度为4℃，时间为24h，然后用无水乙醇清洗3次，真空干燥48h得复合纳米纤维膜，将复合纳米纤维膜置于叔丁醇中，用匀浆机分散得到短纤维分散液，去除叔丁醇，再将短纤维置于水中浸泡10h以去NaCl颗粒得到多孔的短纤维，干燥得到干态的短纤维；

将真皮脱细胞基质颗粒、干态的短纤维和透明质酸水溶液混合搅拌，作为纤维基墨水；

（4）、制备三维支架

通过患者健侧外耳道的CT结果进行三维重建，根据三维重建数据制定支架的长度和直径；按照支架参数调整打印的参数，通过3D打印得到用于患侧的三维支架，将三维支架用化学试剂交联，冷冻干燥即得。

本发明方法制备的可降解复合型管状支架的三维多孔状，具有良好的生物相容性，通过CCK-8实验，发现支架在体外细胞培养过程中，MSCs细胞增殖良好。具备良好的支撑力学强度，防止瘢痕组织挛缩，抗压强度为2.4~6.0MPa，并且随着NaCl比例的提高，材料的抗压强度反而增加，根据不同年龄段患者皮肤的收缩能力，适当调整材料比例，达到防止狭窄的目的，最佳的PLGA/NaCl的质量比为2:1~1:1。兼备弹性与柔韧性，具有良好的机械强度，可顺应吞咽活动及瘢痕挛缩而作相应的应变，能保持稳定的管状形态。防止由于机械运动引起支架的断裂和塌陷。采用本外耳道支架进行外耳道重建，可以在手术室的短时间内快速构建，无需进行自体皮肤取材，避免了取材部位可能引起的并发症。随着时间的推移，人体细胞可以长入支架，同时支架发生降解，避免二次手术的损伤，为预防各种原因造成外耳道狭窄提供了新思路和有效的预防治疗手段。

本发明设计合理，该外耳道支架生物相容性较好，可以有效的促进细胞增殖再生、加快创面的愈合和抑制创面渗血，并具有良好的力学性能，除可应用于防止外耳道狭窄外，还可以根据临床需求，经过3D打印后，用于防止鼻腔、尿道和祈祷等管腔性器官狭窄相关领域，具有很好的实际应用价值。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

一种3D打印脱细胞基质预防外耳道狭窄支架，包括圆管状的支架主体，支架主体前端呈T型设有翼圆状的支架帽，支架主体尾端呈内卷曲半圆形；具体结构请参见201922150238.3。其中，支架帽呈T型圆翼状，可防止支架脱落和移位；支架尾部呈卷曲半圆形，可防止渗液及分泌物流入鼓膜，引起鼓膜炎和鼓膜穿孔，经鼓膜穿孔处流入中耳腔，引起炎症扩散；支架主体呈圆管状，既可以起到加压止血的作用，管体上有圆形小孔，可以起到充分引流耳道皮肤渗液及分泌物的作用，也可行耳道内给药。预防外耳道狭窄的支架采用复合可降解材料3D打印制备而成，例如采用可降解的高分子材料和真皮脱细胞基质制成。

其中，支架主体采用可降解的高分子材料和真皮脱细胞基质制成，可降解高分子材料采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA；真皮脱细胞基质采用包皮手术切除的废弃皮肤经脱细胞处理制备而成的基质，有利于种子细胞黏附、增殖和分化，促进周围组织的生长。两种材料在体内可按各自的方式逐步分解为小分子物质而自然吸收，可直接用于修复与重建，适合临床应用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA（可降解的高分子材料）与脱细胞基质所占成分为1:3的质量比，聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA既可以增加支架的力学强度，防止单纯的真皮脱细胞基质无法支撑由于瘢痕挛缩引起的外耳道挛缩，一定比例混合，可以使支架具有力学顺应性，支架植入后可伸缩和弯曲，可顺应机体的吞咽活动及瘢痕挛缩而作相应的应变，可分散及化解这些活动产生的应力，阻止应力撕裂。

具体实施时，先对患者健侧外耳道进行CT扫描，并将结果三维重建，然后根据三维重建数据设计制作用于患侧的支架。

外耳道支架由患者健侧CT结果经过三维重建获得外耳道数据，根据患者健侧的数据制备患侧的外耳道支架，支架主体长度为13~18mm，圆管外直径4.5~8.5mm，内直径3~7mm，支架主体管壁厚度为1.5mm。支架主体管壁有均匀密布的圆孔，为了支架的力学支撑能力，孔隙率为85%，圆孔的孔径为1mm，相邻圆孔的圆心与圆心之间的距离为3mm。

一种3D打印脱细胞基质预防外耳道狭窄支架的制备方法，包括如下步骤：

（1）、制备真皮脱细胞基质

将真皮首先放于钴

（2）、制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA

聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA由聚乳酸PLA和聚羟基乙酸PGA按照75:25的摩尔比组成。

（3）、制备生物墨水

将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶液中加入NaCl颗粒（采用400目筛网过滤），其中NaCl颗粒与PLGA的质量比为1:2、1:1或2:1，干燥后将PLGA浸泡在1%戊二醛溶液中交联，温度为4℃，时间为24h，然后用无水乙醇清洗3次，真空干燥48h得复合纳米纤维膜，将复合纳米纤维膜置于叔丁醇中，用匀浆机分散得到短纤维分散液，去除叔丁醇，再将短纤维置于水中浸泡10h以除去NaCl颗粒得到多孔的短纤维，干燥得到干态的短纤维；

将真皮脱细胞基质颗粒、干态的短纤维和透明质酸水溶液混合搅拌，作为纤维基墨水。

透明质酸水溶液（HA医用交联凝胶浓度为0.85mg/mL）涂敷自体真皮皮片比例为约为0.34mg/cm

（4）、制备三维支架

通过患者健侧外耳道的CT结果进行三维重建，根据三维重建数据制定支架的长度和直径；按照支架参数调整打印的参数，通过3D打印得到用于患侧的三维支架，3D打印时，电纺丝直径为450nm。将三维支架用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺（EDC）交联，其中EDC:（HA+短纤维）=0.4:1.0（质量比），EDC可激活HA（透明质酸）和聚乳酸的羧基，与相邻胶原纤维氨基形成共价键，将HA、聚乳酸与胶原纤维结合在一起。冷冻干燥即得所述三维支架，整个支架经过了伽马射线辐照灭菌。

（5）、大体观察结果

本发明制备支架的方法能成功打印出孔径适中的支架，而且纤维排布规整，外形完好。

（6）、电镜下观察支架

本发明的支架纤维排列规则，有利于细胞生长。支架表面和内部的微孔有利于营养物质运送和代谢产物排出，同时这些微孔有助于细胞贴附。本发明通过加入NaCl，能够有效抑制支架的降解，促使支架的降解速度与修复速度相匹配。

（7）、力学强度测试

当PLGA/NaCl的质量比为2:1~1:1时，该抗压强度高达2.4~6.0MPa，适用于作为外耳道修复支架使用，可考虑作为防止瘢痕挛缩引起外耳道狭窄使用。

（8）、细胞增殖实验

支架在接种骨髓间充质干细胞复合培养l、3、7天后，在培养液内加入200ul CCK-8工作液进行检测。细胞增殖率均大于70%。

本发明方法制备的可降解复合型管状支架的三维多孔状，具有良好的生物相容性及力学性质，兼备弹性与柔韧性，能保持稳定的管状形态。采用本发明进行外耳道重建，可以在手术室的短时间内快速构建，无需进行自体皮肤取材，避免了取材部位可能引起的并发症。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖本发明的权利要求保护范围中。