一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法及其包埋率的计算方法

摘要

一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，它属于生防菌剂领域。本发明目的在于优化固定化菌微球的制备工艺，基于响应面法优化找到最佳的工艺条件，从而提高固定化菌微球在实际应用中的有效性。本发明将粉红粘帚霉菌株在无菌条件下转接于PDA培养中，纯化培养后的菌株转接于添加抗生素的PDB液体培养基中，放置于恒温摇床中振荡培养后，得到粉红粘帚霉发酵液，加入海藻酸钠溶液，用注射器缓慢滴入灭菌的CaCl2溶液中，硬化后形成粉红粘帚霉固定化微球。利用响应面法探索包埋过程中不同条件对粉红粘帚霉包埋率的影响，建立连续变量曲面模型，通过回归方程来拟合，确定最优的包埋条件，发挥微生物的最大效力。

说明书

技术领域

本发明属于生防菌剂领域；具体涉及一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法及其包埋率的计算方法。

背景技术

植物生物防治作为一种新型的病虫害防治方法被广泛应用，因其不会产生耐药性，对人类健康及生态环境友好等诸多优点，成为防治病虫害中极具研发潜力的途径之一。粉红粘帚霉菌作为粘帚霉菌属的一员，可以有效的防治植物灰霉病、叶霉病等严重病害，是一种极具潜力的广谱性抗病生防真菌之一。但在实际应用中，直接喷施游离的生防菌于植物上，会有作用时间短、不易定殖、拮抗作用不明显等问题，会大大降低其生防效率。通过微生物固定的方法可以为生防菌提供良好的生存环境，提升生防菌的作用时间，提高生防效率。目前，微生物固定化的主要特征是通过物理或化学方法，将游离的生防菌固定于载体之上，其方法主要有吸附法、包埋法和交联法。

发明内容

本发明目的是提供了一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法及其包埋率的计算方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将粉红粘帚霉菌株在无菌条件下转接于PDA培养中，置于恒温培养箱纯化培养，纯化培养后的菌株转接于添加抗生素的PDB液体培养基中，放置于恒温摇床中振荡培养后，得到粉红粘帚霉发酵液，待用；

步骤2、将浓度为1-5wt％的海藻酸钠溶液灭菌后，加入步骤1得到的粉红粘帚霉发酵液中搅拌混合，得到粉红粘帚霉混合溶液，待用；

步骤3、将步骤2得到的粉红粘帚霉混合溶液用注射器缓慢滴入浓度为的1-5wt％的灭菌的CaCl

步骤4、将步骤3所得粉红粘帚霉固定化微球洗涤、干燥，得到生防菌固定化微球；

步骤5、采用响应面法，设置四因素三水平试验，计算粉红粘帚霉固定化微球的包埋率，获得生防菌固定化微球的优化方程。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤1中恒温培养箱纯化培养温度为28℃，培养时间为5d，PDB液体培养基中抗生素的添加量为0.1g/L，所述的抗生素为头孢噻肟，恒温摇床设定条件为27℃、180r/min，振荡培养48h。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤2中搅拌条件为100-200r/min，搅拌时间30-60min。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤3中所述注射器的型号为6号，滴入速度为60滴/min，硬化条件为4℃下硬化2-10h。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤4中将硬化后的粉红粘帚霉固定化微球倒在纱布表面，滤掉CaCl

一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤5中生防菌固定化微球的优化方程为：

Y＝90.13-3.90A-2.07B+2.97C-0.45D-2.40AB+0.78AC-0.078AD-0.58BC-0.51BD-2.13CD-14.22A2-4.65B2-3.13C2-4.33D2；

其中Y为固定化菌微球的包埋率，A为海藻酸钠浓度，B为CaCl

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，包括如下步骤：

步骤a、配制Na

步骤b、将生防菌固定化微球放入步骤a配制的解囊液中，使生防菌固定化微球完全溶解于解囊液中，然后取溶解后的解囊液于培养皿表面涂布培养，待菌落长出后利用平板计数法计数；

步骤c、利用平板计数法计算包埋率。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，步骤a中Na

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，步骤b准确称取1g生防菌固定化微球，加入到10ml解囊液中，在27℃、180rpm恒温摇床上振荡溶解，待生防菌固定化微球完全溶解后，取0.2ml溶液梯度稀释10

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，包埋率＝(微球中包埋的活菌数/起始添加的活菌数)*100％。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，采用响应面法确定微球制备的最佳条件，设置四因素三水平的试验方式进行重复试验获得实验结果，计算出固定化菌微球的包埋率，再采用软件进行多元回归分析，得出试验因素对响应值影响的回归方程。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，所用的菌株为东北农业大学园艺园林学院番茄课题组保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的粉红粘帚霉菌株(Clonostachys rosea)WY-1，保藏编号为CGMCC No.1977。所述的粉红粘帚霉菌株(Clonostachys rosea)WY-1，为一种丝状真菌，广泛存在于土壤中的拮抗性重寄生生防真菌，在PDA培养基中，菌丝初为白色，边缘整齐，较疏松，后菌丝变为粉红色；分生孢子梗扫帚状分枝，分生孢子呈椭圆形，聚集成团状，菌丝无色，有隔膜。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，海藻酸钠作为一种天然多糖，具有价格低廉，对细胞毒性小，物理性质稳定，对微生物的富集程度高等特点，能够被作为包埋剂广泛应用于废水处理、土壤修复等。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对固定化菌微球的制备工艺进行优化。本发明采用响应面法确定固定化菌微球的变量参数，选取制备固定化菌微球所用主要材料和外部条件作为四个因素，包括海藻酸钠浓度、CaCl

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，借助Design-expert软件进行响应面分析，简单、可靠的对工艺条件进行了优化，并取得了较好的效果，为固定化菌微球的制备奠定了基础。

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，最终确定的优化条件为：海藻酸钠浓度3.897％、CaCl

本发明所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，通过包埋法将粉红粘帚霉固定化制成微球，利用响应面法探索包埋过程中不同条件对粉红粘帚霉包埋率的影响，建立连续变量曲面模型，通过回归方程来拟合多个响应表量和一系列变量之间的关系，确定最优的包埋条件，发挥微生物的最大效力。

附图说明

图1为具体实施方式一方法制备的利用响应面法优化的生防菌固定化微球的实物照片；

图2为具体实施方式一方法制备的利用响应面法优化的生防菌固定化微球的带标尺的实物照片；

图3为具体实施方式一方法制备的利用响应面法优化的生防菌固定化微球的高倍率SEM照片；

图4为具体实施方式一方法制备的利用响应面法优化的生防菌固定化微球的低倍率SEM照片；

图5为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的影响柱状图；

图6为具体实施方式三方法中CaCl

图7为具体实施方式三方法中硬化时间对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的影响柱状图；

图8为具体实施方式三方法中投菌量对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的影响柱状图；

图9为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度与CaCl

图10为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度与CaCl

图11为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度与硬化时间对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的响应面图；

图12为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度与硬化时间对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的等高线图；

图13为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度与投菌量对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的响应面图；

图14为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度与投菌量对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的等高线图；

图15为具体实施方式三方法中CaCl

图16为具体实施方式三方法中CaCl

图17为具体实施方式三方法中CaCl

图18为具体实施方式三方法中CaCl

图19为具体实施方式三方法中硬化时间与投菌量对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的响应面图；

图20为具体实施方式三方法中硬化时间与投菌量对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的等高线图。

具体实施方式

具体实施方式一：

一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将粉红粘帚霉菌株在无菌条件下转接于PDA培养中，置于恒温培养箱纯化培养，纯化培养后的菌株转接于添加抗生素的PDB液体培养基中，放置于恒温摇床中振荡培养后，得到粉红粘帚霉发酵液，待用；

步骤2、将浓度为3wt％的海藻酸钠溶液灭菌后，加入步骤1得到的粉红粘帚霉发酵液中搅拌混合，得到粉红粘帚霉混合溶液，待用；

步骤3、将步骤2得到的粉红粘帚霉混合溶液用注射器缓慢滴入浓度为的2.5wt％的灭菌的CaCl

步骤4、将步骤3所得粉红粘帚霉固定化微球洗涤、干燥，得到生防菌固定化微球；

步骤5、采用响应面法，设置四因素三水平试验，计算粉红粘帚霉固定化微球的包埋率，获得生防菌固定化微球的优化方程。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤1中恒温培养箱纯化培养温度为28℃，培养时间为5d，PDB液体培养基中抗生素的添加量为0.1g/L，所述的抗生素为头孢噻肟，恒温摇床设定条件为27℃、180r/min，振荡培养48h。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤2中搅拌条件为100r/min，搅拌时间30min。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤3中所述注射器的型号为6号，滴入速度为60滴/min，硬化条件为4℃下硬化5h。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤4中将硬化后的粉红粘帚霉固定化微球倒在纱布表面，滤掉CaCl

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤5中生防菌固定化微球的优化方程为：

Y＝90.13-3.90A-2.07B+2.97C-0.45D-2.40AB+0.78AC-0.078AD-0.58BC-0.51BD-2.13CD-14.22A2-4.65B2-3.13C2-4.33D2；

其中Y为固定化菌微球的包埋率，A为海藻酸钠浓度，B为CaCl

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，制备的微球颗粒呈平滑球状，直接在0.3cm-0.4cm，半透明状，具有一定弹性。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法制得的微球颗粒的实物照片如图1、图2所示，扫描电镜照片如图3、图4所示。

具体实施方式二：

根据具体实施方式一方法制备的利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，包括如下步骤：

步骤a、配制Na

步骤b、将生防菌固定化微球放入步骤a配制的解囊液中，使生防菌固定化微球完全溶解于解囊液中，然后取溶解后的解囊液于培养皿表面涂布培养，待菌落长出后利用平板计数法计数；

步骤c、利用平板计数法计算包埋率。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，步骤a中Na

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，步骤b准确称取1g生防菌固定化微球，加入到10ml解囊液中，在27℃、180rpm恒温摇床上振荡溶解，待生防菌固定化微球完全溶解后，取0.2ml溶液进行稀释10

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，待菌落长出后，计数。每毫升中孢子数＝(培养皿上菌落数ⅹ稀释倍数)/0.2ml。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，包埋率＝(微球中包埋的活菌数/起始添加的活菌数)*100％。

具体实施方式三：

一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将粉红粘帚霉菌株在无菌条件下转接于PDA培养中，置于恒温培养箱纯化培养，纯化培养后的菌株转接于添加抗生素的PDB液体培养基中，放置于恒温摇床中振荡培养后，得到粉红粘帚霉发酵液，待用；

步骤2、将海藻酸钠溶液灭菌后，加入步骤1得到的粉红粘帚霉发酵液中搅拌混合，得到粉红粘帚霉混合溶液，待用；

步骤3、将步骤2得到的粉红粘帚霉混合溶液用注射器缓慢滴入灭菌的CaCl

步骤4、将步骤3所得粉红粘帚霉固定化微球洗涤、干燥，得到生防菌固定化微球；

步骤5、采用响应面法，设置四因素三水平试验，计算粉红粘帚霉固定化微球的包埋率，获得生防菌固定化微球的优化方程。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，图5为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度对利用响应面法优化的生防菌固定化微球包埋率的影响柱状图；图6为具体实施方式三方法中CaCl

设置四因素三水平试验如下：

海藻酸钠浓度：确定CaCl

CaCl

投菌量：确定海藻酸钠浓度为3％，CaCl

硬化时间：确定海藻酸钠浓度为3％，CaCl

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，采用响应面法确定微球制备的变数参量，设置四因素三水平的试验方式进行重复试验获得实验结果，计算出固定化菌微球的包埋率，再采用软件进行多元回归分析，得出试验因素对响应值影响的回归方程为：

Y(％)

＝90.13-3.90A-2.07B+2.97C-0.45D-2.40AB+0.78AC-0.078AD-0.58BC-0.51BD-2.13CD-14.22A2-4.65B2-3.13C2-4.33D2

其中Y为固定化菌微球的包埋率，变量参数A为海藻酸钠浓度，变量参数B为CaCl

响应面法优化设计

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，根据单因素试验结果，选取海藻酸钠浓度、CaCl

表1试验因素与水平设定

以海藻酸钠浓度(A)、CaCl

表2响应面分析的实验方案与提取率

根据所得数据进行多元回归分析，得到相应变量与固定化菌微球的包脉率之间的多元二次回归方程。

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，根据表3的方差分析结果显示，该二元多次回归模型的F值为28.71，P值<0.0001，说明该模型的拟合结果极显著。其中因素A、B、C、A2、B2、C2、D2对微球的包埋率有极显著的影响(P<0.01)，AB、CD对微球包埋率有显著影响(P<0.05)；该模型拟失项P值为0.3041，不显著，且模型的决定系数(R

表3方差分析结果

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，利用Design-expert软件进行响应面分析，图9为具体实施方式三方法中海藻酸钠浓度与CaCl

本实施方式所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，依据软件分析，得到的最佳条件为：海藻酸钠浓度：3.897％，CaCl

本实施例说明该二次回归模型能较好地预测海藻酸钠浓度、CaCl

具体实施方式四：

一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将粉红粘帚霉菌株在无菌条件下转接于PDA培养中，置于恒温培养箱纯化培养，纯化培养后的菌株转接于添加抗生素的PDB液体培养基中，放置于恒温摇床中振荡培养后，得到粉红粘帚霉发酵液，待用；

步骤2、将浓度为1-5wt％的海藻酸钠溶液灭菌后，加入步骤1得到的粉红粘帚霉发酵液中搅拌混合，得到粉红粘帚霉混合溶液，待用；

步骤3、将步骤2得到的粉红粘帚霉混合溶液用注射器缓慢滴入浓度为的1-5wt％的灭菌的CaCl

步骤4、将步骤3所得粉红粘帚霉固定化微球洗涤、干燥，得到生防菌固定化微球；

步骤5、采用响应面法，设置四因素三水平试验，计算粉红粘帚霉固定化微球的包埋率，获得生防菌固定化微球的优化方程。

具体实施方式五：

根据具体实施方式四所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤1中恒温培养箱纯化培养温度为28℃，培养时间为5d，PDB液体培养基中抗生素的添加量为0.1g/L，所述的抗生素为头孢噻肟，恒温摇床设定条件为27℃、180r/min，振荡培养48h。

具体实施方式六：

根据具体实施方式四所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤2中搅拌条件为100-200r/min，搅拌时间30-60min。

具体实施方式七：

根据具体实施方式四所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤3中所述注射器的型号为6号，滴入速度为60滴/min，硬化条件为4℃下硬化2-10h。

具体实施方式八：

根据具体实施方式四所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤4中将硬化后的粉红粘帚霉固定化微球倒在纱布表面，滤掉CaCl

具体实施方式九：

根据具体实施方式四所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的制备方法，步骤5中生防菌固定化微球的优化方程为：

Y＝90.13-3.90A-2.07B+2.97C-0.45D-2.40AB+0.78AC-0.078AD-0.58BC-0.51BD-2.13CD-14.22A2-4.65B2-3.13C2-4.33D2；

其中Y为固定化菌微球的包埋率，A为海藻酸钠浓度，B为CaCl

具体实施方式十：

根据具体实施方式四所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，包括如下步骤：

步骤a、配制Na

步骤b、将生防菌固定化微球放入步骤a配制的解囊液中，使生防菌固定化微球完全溶解于解囊液中，然后取溶解后的解囊液于培养皿表面涂布培养，待菌落长出后利用平板计数法计数；

步骤c、利用平板计数法计算包埋率。

具体实施方式十一：

根据具体实施方式十所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，步骤a中Na

具体实施方式十二：

根据具体实施方式十所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，步骤b准确称取1g生防菌固定化微球，加入到10ml解囊液中，在27℃、180rpm恒温摇床上振荡溶解，待生防菌固定化微球完全溶解后，取0.2ml溶液进行稀释10

具体实施方式十三：

根据具体实施方式十所述的一种利用响应面法优化的生防菌固定化微球的包埋率的计算方法，包埋率＝(微球中包埋的活菌数/起始添加的活菌数)*100％。