单分子表观遗传定位

摘要

提供了一种用于定位DNA的表观遗传修饰的方法，包括：提供具有至少一个表观遗传修饰的靶DNA链，其中所述靶DNA链退火至非靶DNA链，其中所述靶DNA链和所述非靶DNA链各自用第一荧光团标记；用第二荧光团标记至少一个表观遗传修饰；使第一探针退火至靶DNA链，并使第二探针退火至非靶DNA链；将靶DNA链固定在支持物上；和检测固定在支持物上的第一和第二荧光团。还提供了一种诊断怀疑患有疾病的受试者中的疾病或状况例如癌症的方法，其通过定位来自患者样品的DNA的表观遗传修饰并将其与疾病或状况相关的参考表观遗传特征谱进行比较。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月16日提交的美国临时申请系列号62/746,121的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

申请人通过引用并入了随此提交的CRF序列表，其文件名为Sequence_Listing_10738_758.txt，于2019年10月4日创建。

所附序列表中所列的核酸序列是使用37C.F.R.1.822中定义的标准缩略语示出的。在随附的序列表中：

SEQ ID NO：1代表靶DNA链；

SEQ ID NO：2代表非靶DNA链；

SEQ ID NO：3代表与靶DNA链互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：4代表与非靶DNA链互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：5代表缺少5hmC修饰的靶DNA链；

SEQ ID NO：6代表与靶DNA链SP1互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：7代表非靶DNA链；

SEQ ID NO：8代表与非靶DNA链SP2互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：9代表具有一个5hmC修饰的靶DNA链；

SEQ ID NO：10代表与靶DNA链SP3互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：11代表非靶DNA链；

SEQ ID NO：12代表与非靶DNA链SP4互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：13代表具有两个5hmC修饰的靶DNA链；

SEQ ID NO：14代表与靶DNA链SP5互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：15代表非靶DNA链；

SEQ ID NO：16代表与非靶DNA链SP6互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：17代表具有三个5hmC修饰的靶DNA链；

SEQ ID NO：18代表与靶DNA链SP7互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：19代表非靶DNA链；

SEQ ID NO：20代表与非靶DNA链SP8互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：21代表靶DNA链；

SEQ ID NO：22代表与靶DNA链SP-a互补的单链DNA探针；

SEQ ID NO：23代表非靶DNA链；和

SEQ ID NO：24代表与非靶DNA链SP-b互补的单链DNA探针。

背景

DNA表观遗传修饰在广泛范围内的生理和病理过程中起重要作用，其失调可导致多种人类疾病。5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是哺乳动物DNA的主要表观遗传修饰之一，是由十-十一易位(TET)家族蛋白从5-甲基胞嘧啶(5mC)产生的，并且由于其参与表观遗传重编程和基因表达调控而经常被称为DNA的第六种碱基。5hmC是组织特异性的，并且被认为是发育和疾病中的基因激活标志物。最近，据报道5hmC是几种癌症类型的表观遗传生物标志物。

循环中的无细胞DNA(cfDNA)是血液中循环中的短的、降解的核酸片段。cfDNA的非侵入性可用性使其成为诊断、预后和监测肿瘤演变以及对治疗的反应的有前景的生物标志物。使用敏感的基于化学标记的低输入测序方法，本研究人员先前对cfDNA中的5hmC进行了快速而可靠的测序，并显示无细胞5hmC在几种类型的癌症中显示出独特的特征。Song等人,5-Hydroxymethylcytosine signatures in cell-free DNA provide information abouttumor types and stages,

鉴于单分子光学检测的极高灵敏度和固有的多重复用，以及其在具有成本效益的诊断应用中的潜在效用，单分子光学检测已日益成为分析表观遗传学的有吸引力和具有竞争力的工具。先前已经描述了用于定量和鉴定5hmC和5mC之间相互作用的超灵敏单分子表观遗传学成像。参见Song等人,Simultaneous single-molecule epigenetic imaging ofDNA methylation and hydroxymethylation,

需要单分子成像和表观遗传修饰的定位的改进的方法。

概述

因此，本文描述了一种用于超灵敏的基于光学检测的单分子表观遗传定位(SMEL)的方法，其提供了DNA表观遗传修饰的基因座特异性和链特异性检测。

在一个实施方案中，提供了一种用于定位DNA的表观遗传修饰的方法，该方法包括：提供包含至少一个表观遗传修饰的靶DNA链，其中所述靶DNA链退火至非靶DNA链，其中靶DNA链和非靶DNA链各自在3’末端用第一荧光团标记；用第二荧光团标记所述至少一个表观遗传修饰；使第一探针退火至靶DNA链，并使第二探针退火至非靶DNA链；将靶DNA链固定在支持物上；和检测固定在支持物上的第一和第二荧光团以定位所述至少一个表观遗传修饰。在实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：在固定在支持物上之前，将由第一和第二探针与靶和非靶DNA链的退火产生的反应产物与外切核酸酶一起孵育以消化未退火的单链DNA。

在另一个实施方案中，提供了一种在怀疑患有癌症的受试者中诊断癌症的方法，该方法包括：提供来自该受试者的生物学样品，该样品包含包括至少一个表观遗传修饰的靶DNA链，其中该靶DNA链退火至非靶DNA链；在3'末端用第一荧光团标记靶DNA链和非靶DNA链；使第一探针退火至靶DNA链，并使第二探针退火至非靶DNA链；将靶DNA链固定在支持物上；检测固定在支持物上的第一和第二荧光团，其中检测包括通过基于棱镜的单分子全内反射荧光(TIRF)显微术成像，其中所述成像提供了至少一个表观遗传修饰的基因座特异性和链特异性定位；将基因座特异性和链特异性定位与癌症的参考表观遗传特征谱进行比较；以及当所述至少一个表观遗传修饰的基因座特异性和链特异性定位与癌症的参考表观遗传特征谱相关时，将所述受试者诊断为患有癌症。在实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：在固定在支持物上之前，将由第一和第二探针与靶和非靶DNA链的退火产生的反应产物与外切核酸酶一起孵育以消化未退火的单链DNA。

通过阅读以下详细描述和所附权利要求，这些和其他目的、特征、实施方案和优点对于本领域普通技术人员将变得明显。

附图说明

图1A描绘了5hmC的单分子表观遗传定位(SMEL)的方法的实施方案。与非靶标链(NTS)退火的靶DNA链(TS)在3’末端用Cy3标记，而5hmC用Cy5标记。单链DNA探针(SP)在3’末端用生物素标记，并退火至TS。互补单链DNA探针(CSP)退火至NTS。退火的dsDNA可以固定在显微镜载玻片上，并用单分子全内反射荧光(TIRF)显微术成像。

图1B描绘了单分子成像结果表明仅固定的TS显示Cy5(5hmC)信号。

图1C描绘了图1B所示的NTS和TS的Cy5信号的代表性图像。

图1D描绘了不同比率的SP和TS的退火和固定效率。

图1E显示在10

图1F显示了该方法的检测限对TS为约1pM。在没有TS的情况下为0pM，同时添加成像缓冲液用于影像记录。所有误差条表示S.E.M。P值：通过双尾学生t检验****p<0.0001。

图2A描绘了提高检测限的纯化方法的实施方案的示意图。

图2B显示，在纯化之前，SP ssDNA与TS竞争，并占据负责固定的大多数中性抗生物素蛋白位置。底部图显示了纯化前1pM TS的5hmC信号图像。

图2C显示纯化后，SP ssDNA被消化，并且超纯的TS dsDNA被回收用于单分子成像。纯化将检测限提高到渺摩尔水平。纯化后的5hmC信号图像显示在底部图上。

图2D显示纯化后，可以检测到样品的渺摩尔浓度。在没有TS的情况下为0pM，同时添加成像缓冲液用于影像记录。所有误差条表示S.E.M。P值：通过双尾学生t检验****p<0.0001。

图3A描绘了通过SMEL从mESC基因组DNA和人cfDNA中检测5hmC的方法的实施方案。在mESC gDNA和人cfDNA中5hmC表观遗传修饰的单分子定位的示意图。

图3B描绘了单个和多个Cy5荧光团的光漂白迹线的实例，其表示mESC基因组的单个DNA序列内的一个或多个5hmC修饰。

图3C描绘了与针对gDNA的SP3-4、SP5-6和SP7-8探针有关的Cy5斑点(5hmC修饰)的圆形图。

图3D描绘了与针对cfDNA的SP-a和SP-b探针有关的Cy5斑点(5hmC修饰)的圆形图。

图4描绘了标记的DNA的吸收光谱。具有一个5hmC修饰的DNA在3’末端用Cy3标记，而5hmC用Cy5标记。使用DNA、Cy3和Cy5的消光系数计算浓度。

图5A示出了在退火之前，在存在SP和TS的情况下无法观察到Cy5(无论它们的添加顺序如何)。

图5B示出了Cy3斑点的数量。

图5C描绘了针对总DNA的示例性Cy3通道图像，其显示TS和NTS都可以分别被SP和CSP固定。

图5D描绘了FRET直方图，其显示TS的高FRET(右图)，但NTS没有FRET(左图)。

图5E描绘了代表性的单分子时间迹线，其示出了每个Cy5信号来自一个单个荧光团。

图6A是在纯化前来自1pM TS或在纯化后来自100aM TS的Cy3斑点数的柱状图。在不存在TS的情况下为0pM。

图6B描绘了图6A中所示的Cy3信号(总DNA)的代表性图像。所有误差条表示S.E.M。P值：通过双尾学生t检验****p<0.0001。

图7A描绘了来自mESC的gDNA中5hmC表观遗传修饰的单分子定位的示意图。

图7B示出对于仅SP1-2、仅gDNA、以及SP1-2和非TS DNA没有Cy3或Cy5信号。非TSDNA与SP1-2不匹配，但用Cy3末端标记，并且5hmC位点用Cy5标记。对于SP1-2和gDNA，只能检测到Cy3(总DNA)。对于SP3-8，可以观察到Cy3和Cy5信号两者。

图7C描绘了对于SP1-2和SP3-8的代表性Cy3(总DNA)和Cy5(5hmC)图像。

图7D显示了纯化之前和之后对于SP1-2和SP3-8的mESC DNA片段的Cy5斑点。纯化过程提高了检测限。所有误差条表示S.E.M。P值：通过双尾学生t检验****p<0.0001。

图8A描绘了针对不同SP的mESC DNA片段的Cy3斑点。对于总DNA，显示了相似水平的Cy3斑点。

图8B描绘了针对不同SP的mESC DNA片段的Cy5斑点。对于SP1或SP2，无法检测到对应于5hmC的Cy5斑点。

图9A描绘了一个和两个Cy5荧光团的光漂白迹线的实例，其表示人cfDNA中的一个和两个5hmC修饰。

图9B描绘了分别与SP-a和SP-b ssDNA探针有关的cfDNA的示例Cy5(5hmC)图像。

图10描绘了基因组浏览器视图，其显示了小鼠胚胎干细胞中探针区域之内和附近的5hmC水平。

图11描绘了基因组浏览器视图，其显示了来自健康供体的cfDNA中的探针区域之内和附近的5hmC水平。

发明详述

在本文件中阐述了当前公开的主题的一个或多个实施方案的细节。在研究了本文提供的信息之后，对本文中描述的实施方案的修改以及其他实施方案对本领域普通技术人员而言将是明显的。

虽然相信以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是列出了定义以促进对当前公开的主题的解释。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质例如反应条件等的数量的所有数字在任何情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和权利要求书中示出的数字参数是近似值，其可以随着寻求通过当前公开的主题获得的期望特性而变化。

如本文所用，术语“约”在指代质量、重量、时间、体积、pH、尺寸、浓度或百分比的值或量时，意在涵盖从指定量的在一些实施方案中±20％，在一些实施方案中±10％，在一些实施方案中±5％，在一些实施方案中±1％，在一些实施方案中±0.5％，和在一些实施方案中±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。

应当理解的是，贯穿本说明书给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，就好像这类较低的数值限制在本文中明确写出一样。贯穿本说明书给出的每个最小数值限制将包括每个更高的数值限制，就好像这类更高的数值限制在本文中明确写出一样。贯穿本说明书给出的每个数值范围将包括落入该较宽数值范围内的每个较窄数值范围，就好像这类较窄数值范围均在本文中明确写出一样。

如本文所用，“受试者”是指哺乳动物受试者。任选地，受试者是人类或非人类的灵长类动物。任选地，受试者选自小鼠，大鼠，兔，猴，猪和人。在一个具体的实施方案中，受试者是人。

如本文所用，术语“治疗/处理”、“医治”和“疗治”是指减轻或消除受试者中的疾病、病症和/或其症状的方法。

如本文所用，“有效量”是指引起期望的生物学应答的物质(例如，治疗化合物和/或组合物)的量。在一些实施方案中，物质的有效量是当施用至患有或易患疾病、病症和/或状况的受试者时足以治疗、诊断、预防和/或延迟和/或减轻疾病、病症和/或状况的一种或多种症状的量。如本领域普通技术人员将理解的，物质的有效量可以取决于诸如期望的生物学终点、待递送的物质、靶细胞或靶组织等因素而变化。例如，治疗疾病、病症和/或状况的制剂的量是减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征、延迟其发作；降低其严重性和/或降低其发生率的量。此外，可以在治疗方案内通过单剂量或通过多剂量施用有效量。在一些实施方案中，当个体剂量或组合物包含在治疗方案的上下文中有效用作剂量的量时，它们被认为包含有效量。本领域普通技术人员将理解，当被施用至患者群体时被证明或已被证明显示出统计学上显著的有效性时，该剂量或量可以被认为是有效的；不需要在特定的个体患者中获得特定的结果以使某个量被认为是如本文所述的有效的。

如本文所用，“表观遗传修饰”是指可遗传但是不涉及核苷酸序列的改变的基因组的修饰。表观遗传修饰可能与基因活性和表达有关，或可能促成其他表型性状。已知各种表观遗传修饰，包括DNA甲基化、RNA修饰和组蛋白修饰，它们在不修饰基础核苷酸序列的情况下改变基因的表达方式。当前公开的方法适用于检测表观遗传修饰，包括例如核酸的甲基化。通过本发明的方法可检测的DNA的表观遗传修饰包括例如5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5-甲基胞嘧啶(5mC)，5-甲酰基胞嘧啶(5fC)，5-羧基胞嘧啶(5caC)等。通过本发明的方法可检测的RNA的表观遗传修饰包括例如N

如本文所用，“基因组DNA(gDNA)”是指携带从一代传给下一代的遗传生物信息的染色体DNA。

如本文所用，“靶DNA链(TS)”是指包含至少一个表观遗传修饰的感兴趣的编码DNA链。如本文所用，“非靶DNA链(NTS)”是指可退火至靶DNA链的非编码DNA链。

术语“退火”和“杂交”在本文中可互换使用，并且是指互补核酸链通过氢键键合以形成双链多核苷酸的现象。如果两个核酸是“互补的”，则一个核酸的每个碱基与另一个核酸中的相应核苷酸碱基配对。两个核酸不需要完全互补以彼此杂交。

如本文所用，“生物样品”是指获自受试者的用于本发明方法的临床样品。在实施方案中，生物样品包含核酸，例如靶DNA和/或非靶DNA。在特定的实施方案中，生物学样品选自细胞，组织，体液和粪便。感兴趣的体液包括但不限于血液，血清，血浆，唾液，粘液，粘液质，脑脊髓液，胸膜液，眼泪，乳导管液，淋巴液，痰，滑液，尿液，羊水和精液。在一个具体的实施方案中，生物学样品选自血液，血清，血浆，尿，组织和培养的细胞。

如本文所用，“全内反射荧光(TIRF)显微术”是指一种显微术方法，该方法允许通过利用有限标本区域中的诱发的消逝波或场的独特性质来对样本的薄区域进行成像，该有限标本区域紧邻具有不同折射指数的两种介质之间的界面(例如，标本与玻璃盖玻片或组织培养容器之间的接触区域)。由于消逝波激发提供的高信噪比，利用TIRF可以可视化单分子荧光，对于动态研究具有足够的时间分辨率。

如本文所用，“抗生物素蛋白-生物素配对”是指亲和标签配对，其中该配对的第一成员是生物素部分，而该配对的第二成员选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的其他修饰形式。

如本文所用，术语“生物素部分”是指以下亲和标签，其包括生物素或生物素类似物，例如脱硫生物素、氧代生物素、2-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等。生物素部分以至少10

如本文所用，术语“支持物”是指结合生物素或生物素部分的支持物(例如，平面支持物例如显微镜载玻片)。在实施方案中，支持物与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的其他修饰形式连接。在一个具体的实施方案中，支持物是聚合物包被的石英表面。

如本文所用，“定位化”和“定位”是指确定表观遗传修饰在靶DNA链上的位置。在实施方案中，所公开的方法允许基因组和cf DNA的离散表观遗传修饰(例如5hmC，5mC等)的链特异性和/或基因座特异性定位。

本文公开了单分子表观遗传定位(SMEL)的方法，其是用于基因座特异性和链特异性表观遗传修饰成像的基于单分子光学检测的方法。SMEL实现了渺摩尔超灵敏性，并在此应用于成像基因组DNA和cfDNA以证明其效用和临床应用。

在一个实施方案中，提供了用于定位DNA的表观遗传修饰的方法，该方法包括：(a)提供包含至少一个表观遗传修饰的靶DNA链，其中所述靶DNA链退火至非靶DNA链，其中靶DNA链和非靶DNA链各自用第一荧光团在3'末端标记；(b)用第二荧光团标记至少一个表观遗传修饰；(c)将第一探针退火至靶DNA链，并将第二探针退火至非靶DNA链；(d)将靶DNA链固定在支持物上；和(e)检测固定在支持物上的第一和第二荧光团以定位至少一个表观遗传修饰。

DNA链可包括来自真核来源(包括但不限于植物，动物(例如爬行动物，哺乳动物，昆虫，蠕虫，鱼等)，真菌(例如酵母)等)的基因组DNA和/或cfDNA，以及从组织样品中分离的基因组DNA。在某些实施方案中，在所公开的方法中使用的DNA源自从哺乳动物例如人获得的生物样品。

在一些实施方案中，生物样品获自患有或怀疑患有与表观遗传修饰有关的疾病或状况(例如癌症，炎性疾病或妊娠)的受试者。在一些实施方案中，可以通过从新鲜的或存档的患者样品例如福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中提取片段化的DNA来制备生物样品。在其他实施方案中，生物样品可以是来自体液例如外周血的cfDNA样品。

在该方法的初始步骤中使用的DNA包括未扩增的DNA，并且在某些实施方案中，未经过预先变性。

在实施方案中，将DNA片段化以用于本发明的方法。可以机械地(例如，通过超声处理、雾化或剪切)或酶促地(使用双链DNA片段化酶(New England Biolabs，Ipswich MA))将DNA片段化。在其他实施方案中，初始样品中的DNA可能已经被片段化(例如，如FFPE样品和cfDNA例如ctDNA(循环肿瘤DNA)的情况)。

在一些实施方案中，初始样品中的片段可以具有小于1kb的中值大小(例如，在50bp至500bp，80bp至400bp或100-1,000bp的范围内)，尽管可以使用具有超出此范围的中值大小的片段。无细胞DNA或循环中的肿瘤DNA(ctDNA)(即在癌症患者血液中游离循环的肿瘤DNA)是高度片段化的，平均片段大小约为165-250bp。cfDNA可以通过离心全血以去除所有细胞，然后解析剩余的血浆来获得。

第一和第二荧光团是在光学上可区分的，使得可以独立地检测用第一和第二荧光团标记的部分。各种荧光团对是本领域已知的并且适用于本发明的方法。用于公开的方法的合适的可区分的荧光标记对包括但不限于，Cy-3和Cy-5(Amersham Inc.，Piscataway，N.J.)，Quasar 570和Quasar 670(Biosearch Technology，Novato，CA)，Alexa Fluor 555和Alexa Fluor 647(Molecular Probes,Eugene,OR)，BODIPY V-1002和BODIPY V-1005(Molecular Probes,Eugene,OR)，POPO-3和TOTO-3(Molecular Probes,Eugene,OR)，PO-PRO3 TO-PRO3(Molecular Probes,Eugene,OR)等。其他合适的可区分的可检测标记可以在Kricka,Stains,labels and detection strategies for nucleic acid assays,

靶DNA链和非靶DNA链各自在3’末端用第一荧光团进行末端标记。末端标记DNA的方法是本领域已知的，并且包括例如末端转移酶反应。

在实施方案中，所述至少一个表观遗传修饰选自5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，5-甲基胞嘧啶(5mC)，5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧胞嘧啶(5caC)。在一个具体的实施方案中，所述至少一个表观遗传修饰包括5hmC。

通过将靶DNA与DNAβ-葡萄糖基转移酶和经化学选择性基团修饰的UDP葡萄糖一起孵育，从而用化学选择性基团共价标记羟甲基化的DNA分子，并将第一荧光团与化学选择性修饰的DNA通过环加成反应连接，来标记靶DNA链中的5hmC表观遗传修饰。靶DNA链中的羟甲基化DNA分子用可以参与点击反应的化学选择性基团标记。该步骤可通过将衔接子连接的cfDNA与DNAβ-葡萄糖基转移酶(例如T4DNAβ-葡萄糖基转移酶(可从许多供应商处购买，尽管存在其他DNAβ-葡萄糖基转移酶)以及例如UDP-6-N

本发明的方法利用探针对，其中第一单链DNA探针被设计为与靶DNA链互补，和第二单链DNA探针被设计为与非靶DNA链互补。在实施方案中，第一探针和第二探针彼此互补。

第一探针与靶DNA链的比率被选择为提供过量的探针，以便于促进捕获尽可能多的靶DNA。在实施方案中，第一探针与靶DNA链的比率为约10:1，约100:1，约1000:1或约10,000:1。在一个具体的实施方案中，第一探针与靶DNA的比率为约100:1。

第一和第二探针用生物素部分标记以使得能够捕获到合适的支持物上，该支持物相应地用结合生物素部分的表面系链(tether)部分标记。在实施方案中，第一探针和第二探针用生物素标记，并且支持物包含选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白的表面系链部分。以这种方式，靶DNA链可以通过抗生物素蛋白-生物素配对被捕获并固定在支持物上。

为了制备用于单分子成像的DNA片段，将标记的DNA片段与相应的单链DNA探针在退火条件下以不同的摩尔比混合。例如，将标记的DNA片段与相应的单链DNA探针在退火缓冲液中混合，加热以使DNA片段变性，然后冷却以促进分别将第一和第二探针分别退火至靶标和非靶标DNA链的每种。然后，新退火的DNA(荧光团标记的并与生物素部分缀合)准备好用于固定和成像。

任选地，在固定和成像之前，可以将从上述退火步骤得到的产物进一步纯化以提高测定的检测水平。具体地，退火步骤的产物任选地与外切核酸酶一起孵育以消化过量的单链DNA。在一个具体的实施方案中，将退火步骤的产物与大肠杆菌外切核酸酶I一起孵育以消化单链DNA。有利地，包括该纯化步骤以去除过量的单链DNA将SMEL的检测限提高至渺摩尔水平。

将标记的DNA分子固定在支持物(如显微镜载玻片)上是使用在针对添加至DNA分子的捕获标签的结合伴侣中包被的载玻片实现的。例如，在一些实施方案中，可以将用生物素部分标记的DNA分子捕获到在抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白中包被的载玻片上。这些载玻片可以通过首先将载玻片在聚乙二醇(PEG)mPEG-SVA和生物素-PEG-SVA(以例如99:1(mol/mol)的比率)的混合物中钝化以降低DNA的非特异性结合，然后在抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白中包被载玻片而制得。标记的DNA分子可以例如以10-300pM(例如30-100pM)的浓度在载玻片表面上固定一段时间，例如5分钟至1小时，例如15分钟。洗涤支持物以除去未结合的DNA。

表观遗传修饰的DNA的个体分子以单分子分辨率在支持物上成像。成像可以使用任何灵敏的、高分辨率的荧光检测器，其配备用于激发第一和第二荧光团中的每一个的装置。应该使用适当的滤光器，以便可以分别检测和成像来自第一和第二荧光团的信号。在一个实施方案中，成像采用全内反射荧光(TIRF)显微术。对于TIRF显微术，使用双激光激发系统来激发第一和第二荧光团中的每一个。来自第一和第二荧光团的总荧光信号由水浸物镜收集，并通过陷波滤波器以阻挡激发光束。来自第二荧光团的发射信号(即，标记的一个或多个表观遗传修饰)被二向色镜分离，并被电子倍增电荷耦合器件照相机检测。记录数据以提供个体分子的荧光强度信号和/或时间轨迹。

在标记的DNA分子已经成像之后，该方法可以进一步包括对用第一和第二荧光团标记的个体分子的数量进行计数，从而确定样品中表观遗传修饰的DNA分子的数量。

成像提供了DNA的至少一个表观遗传修饰的基因座特异性和/或链特异性定位。

上述方法通常可以应用于分析生物DNA样品。例如，在一些实施方案中，该方法中的方法包括：(a)使用上述方法定位：(i)DNA的第一样品中的表观遗传修饰和(ii)DNA的第二样品中的表观遗传修饰；和(b)比较在步骤(a)中获得的结果，以确定样品之间的表观遗传特征谱(profile)是否存在差异。样品中的至少一个是临床样品，该样品包含获自患者的DNA。

如本文所用，“表观遗传特征谱”是指通过本发明的方法对于给定的DNA样品确定的基因座特异性和链特异性表观遗传修饰签名。在实施方案中，癌症或特定类型癌症的“参考表观遗传特征谱”是通过对一个或多个对照样品进行所公开的方法来确定的。从参考群体中收集基因座和链特异性表观遗传修饰数据，以提供参考表观遗传特征谱。在实施方案中，对照是外部对照，使得将从要诊断的受试者获得的成像数据与来自已知患有给定状况或已知处于给定状况的风险的个体(即，参考群体)的成像数据进行比较。在其他实施方案中，将从要诊断的受试者获得的成像数据与来自正常健康个体的成像数据进行比较。应当理解，参考群体可以由大约20、30、50、200、500或1000个个体或它们之间的任何值组成。

在一些实施方案中，不同的样品可以由“实验”样品即感兴趣的样品和可以与实验样品进行比较的“对照”样品组成。在实施方案中，不同的样品是成对的细胞类型或其级分，一种细胞类型是感兴趣的细胞类型，例如异常细胞，而另一种是对照例如正常细胞。如果将细胞的两个级分进行比较，则这些级分通常是来自两个细胞的每个细胞的相同级分。然而，在某些实施方案中，可以比较同一细胞的两个级分。示例性的细胞类型对包括例如，从组织活检(例如，从患有诸如结肠、乳腺、前列腺、肺、皮肤癌症或被病原体感染等的疾病的组织)分离的细胞和来自相同组织(通常来自同一个患者)的正常细胞；在组织培养中生长的永生的(例如，具有增殖突变或永生化转基因的细胞)、感染病原体的、或经过处理(例如，使用环境或化学试剂，例如肽、激素、温度变化、生长条件、物理应激、细胞转化等)的细胞，以及正常细胞(例如，与实验细胞除了不是永生的、感染的或经处理的等等以外在其他方面相同的细胞)；从患有癌症、疾病的哺乳动物、老年性哺乳动物或暴露于某种条件下的哺乳动物中分离的细胞，以及来自健康或年轻的相同物种，优选相同家族的哺乳动物的细胞；以及来自同一哺乳动物的分化细胞和未分化细胞(例如，一个细胞是哺乳动物中另一个细胞的祖细胞)。在一个实施方案中，可以使用不同类型的细胞(例如神经元和非神经元细胞)，或不同状态的细胞(例如，在细胞刺激之前和之后)。在本发明的另一个实施方案中，实验材料是易受病原体例如病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)等感染的细胞，而对照材料是对病原体感染具有抗性的细胞。在本发明的另一个实施方案中，样品对由未分化的细胞例如干细胞和分化的细胞表示。

上述方法可用于鉴定与表型(例如疾病、状况或临床结果等)相关的表观遗传修饰签名或特征谱。在一些实施方案中，该方法可包括(a)对多个DNA样品执行上文所述的方法，其中所述DNA样品是从具有已知表型例如疾病、状况或临床结果的患者中分离的，从而确定来自每个患者的DNA中的表观遗传修饰的签名；和(b)鉴定与表型相关的表观遗传特征谱。

在一些实施方案中，表观遗传特征谱可以是诊断性的(例如，可以提供疾病或状况或疾病或状况的类型或阶段等的诊断)，预后的(例如，指示临床结果，例如在一定时间范围内存活或死亡)或治疗诊断性的(例如，指示哪种治疗最有效)。

还提供了一种用于分析患者样品的方法。在该实施方案中，该方法可以包括：(a)使用上文所述的方法鉴定患者DNA中的表观遗传特征谱；(b)将所鉴定的序列与参考表观遗传特征谱进行比较，该参考表观遗传特征谱与表型例如疾病、状况或临床结果等相关；和(c)提供表明与表型相关性的报告。该实施方案可以进一步包括基于比较的结果进行诊断、预后或治疗诊断。应当理解，本发明的方法适用于以核酸的表观遗传修饰为特征的广泛范围的疾病、状况或临床结果。

在一个具体的实施方案中，该方法包括(a)提供从怀疑患有癌症的受试者获得的生物样品，其包含含有至少一个表观遗传修饰的靶DNA链，其中所述靶DNA链退火至非靶DNA链；(b)在3’末端用第一荧光团标记靶DNA链和非靶DNA链；(c)将第一探针退火至靶DNA链，并将第二探针退火至非靶DNA链；(d)将靶DNA链固定在支持物上；(e)检测固定在支持物上的第一和第二荧光团，其中检测包括通过基于棱镜的单分子全内反射荧光(TIRF)显微术成像，其中成像提供至少一个表观遗传学修饰的基因座特异性和链特异性定位；(f)将基因座特异性和链特异性定位与癌症的参考表观遗传特征谱进行比较；和(g)当步骤(e)的基因座特异性和链特异性定位与癌症的参考表观遗传特征谱相关时，诊断该受试者患有癌症。任选地，该方法包括在固定靶DNA之前通过用外切核酸酶消化来纯化退火步骤(c)的产物。

在实施方案中，当受试者的表观遗传特征谱与癌症的参考表观遗传特征谱一致时，诊断该受试者患有癌症。在一个具体的实施方案中，当受试者的表观遗传特征谱与参考表观遗传特征谱至少80％一致时，诊断该受试者患有癌症。

如本文所用，“一致”是指所比较的数据集之间的同一性程度，所述数据集包括成像或表观遗传特征谱数据集。在某些实施方案中，一致是指至少25％，至少50％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少98％，至少99％或100％的同一性。

在实施方案中，该方法进一步包括用有效量的对所诊断的癌症特异的治疗剂治疗所诊断的患者。

尽管癌症是应用本发明方法的示例性疾病，但是应该理解，所公开的方法可以应用于以核酸的表观遗传修饰为特征的任何疾病、状况或临床结果。可以使用单链探针通过SMEL评估此类疾病、状况或临床结果，所述单链探针被设计为与具有与所述疾病、状况或临床结果相关的表观遗传修饰的已知基因组区域互补。

在其他实施方案中，当前公开的方法适用于鉴定来自其他物种(包括植物和动物物种)的DNA的表观遗传模式或特征谱。例如，被设计为与具有表观遗传修饰的已知基因组区域互补的单链探针可用于本发明的方法中以快速确定DNA的来源。

实施例

下列实施例以举例说明的方式给出，并且绝不旨在限制本公开内容的范围。

实施例1.材料和方法

在补充有15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1x非必需氨基酸、1x青霉素/链霉抗生物素蛋白、0.1mMβ-巯基乙醇、10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、1μM PD0325901和3μM CHIR99021的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中在明胶包被的板上培养小鼠胚胎干细胞(mESC)E14。

按照制造商的方案，使用Quick-DNA Plus试剂盒(Zymo Research)提取基因组DNA。用dsDNA片段化酶(NEB)将基因组DNA片段化，并用AMPure XP珠粒(Beckman Coulter)将大小选择为50-200bp片段。

通过将1μg DNA与1×末端转移酶反应缓冲液(NEB)、0.25mM CoCl

通过将20ng cfDNA与1×末端转移酶反应缓冲液(NEB)、0.25mM CoCl

所有3’末端带有生物素的单链DNA探针均从Integrated DNA Technologies(IDT)获得。为了制备用于单分子成像的DNA片段，将带有或不带有5hmC的标记的DNA片段与相应的单链DNA探针以不同的摩尔比在退火缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH 8.0)中混合，加热3分钟，然后缓慢冷却至室温约2小时。新的退火的DNA(染料标记的并与生物素缀合)准备好用于单分子成像。

为了进行纯化测定，将退火的DNA在反应缓冲液(67mM甘氨酸-KOH，6.7mM MgCl

为了固定DNA样品以用于SMEL检测，首先用97％mPEG(Laysan Bio)和3％生物素PEG(Laysan Bio)的混合物包被石英载玻片，然后使用双面胶带和环氧树脂的条组装流动室。将0.05mg/ml的中性抗生物素蛋白溶液流入每个流动室中并孵育5分钟。如图1A所示，将与生物素缀合的染料标记的DNA注入室中，然后通过生物素-中性抗生物素蛋白相互作用通过15分钟的孵育固定在PEG包被的表面上。洗出游离的DNA后，随后在成像缓冲液中进行单分子成像，该成像缓冲液包含由0.8mg/ml葡萄糖氧化酶、0.625％葡萄糖、3mMTrolox和0.03mg/ml过氧化氢酶组成的除氧系统。

单分子成像是通过棱镜型全内反射荧光(TIRF)显微镜进行的。激发光束聚焦到pellin broca棱镜(Altos Photonics)中，该棱镜放置在石英载玻片上，中间夹有一层薄薄的浸油以匹配折射指数。对于TIRF显微镜，配备了双激光激发系统(532和640nm晶体激光器)来激发Cy3和Cy5荧光团。来自Cy3和Cy5的荧光信号由水浸物镜(60倍，1.2N.A.Nikon)收集，然后通过陷波滤波器以阻挡激发光束。Cy5染料的发射信号由二向色镜(FF662-FDi01；Semrock)分离，并由电子倍增电荷耦合器件照相机(iXon 897；Andor Technology)检测。以200毫秒的时间分辨率将数据记录为成像帧流，并使用以交互数据语言编写的脚本进行分析，以给出个体分子的荧光强度信号或时间轨迹。

对于总DNA信号(Cy3)或5hmC信号(Cy5)，记录了10到20个随机位置的短影像(2秒)，分别由绿色激光器(532nm)和红色激光器(640nm)激发。使用smCamera软件自动进行斑点数的统计分析。对于具有5hmC的个体DNA分子的实时轨迹，记录了5到10个随机位置的长影像(3分钟)，以检测Cy5的光漂白事件。为了考虑实验之间的差异，在测试之前进行了校准对照(在没有染料标记的DNA样品的情况下)，如图1F(0pM)所示。

基本数据分析是用C++(Microsoft)编写的smCamera软件进行的。从至少十部独立的短影像中收集了Cy3/Cy5的斑点数。从至少五部独立的长影像中收集了具有Cy5光漂白的迹线。图3C和3D中使用的分子数显示在下面的表4中。

实施例2.基因座特异性和链特异性成像

当前公开的方法将选择性化学标记策略、单分子荧光成像技术与纯化系统组合以提高检测限。为了光学定位5hmC，每个具有5hmC修饰的靶DNA链(TS)和退火的非靶DNA链(NTS)都用Cy3在3’末端标记，而5hmC用Cy5标记(图4)。设计了单链DNA探针(SP)及其互补的单链DNA探针(CSP)，并用生物素标记并分别与TS和NTS匹配(表1)。以这种方式，通过与生物素标记的SP退火，可以将染料标记的TS通过表面系链的中性抗生物素蛋白捕获在聚合物包被的石英表面上，并用基于棱镜的单分子全内反射荧光(TIRF)显微镜进行成像。通过计数红色通道(Cy5)和绿色通道(Cy3)中的荧光团，可以分别定量包含5hmC的分子的数量和序列特异性DNA片段的总量(图1A)。正如预期的那样，只有退火的TS DNA显示出明显的5hmC(Cy5)信号(图1B和1C和图5A)，而退火的TS和NTS均显示了相似的DNA片段(Cy3)总量(图5B)。由于5hmC位置(Cy5)距Cy3标记的3'末端仅7个碱基对，因此作为双重确认，基于退火的TS而非NTS检测到高FRET(图5C)。

评估了用于退火的SP与TS的合适比率以及该探测策略的检测限(图1D和1E)。所获得的结果证实了所公开的方法是高效的，并且有利地具有高的信噪比。此外，使用光漂白，Cy5强度迹线表明Cy5通道中的每个斑点仅表示一个荧光团(图5D)。为了确定检测限，将不同浓度的退火的TS用于单分子成像，并且结果表明该方法的浓度极限约为1皮摩尔(pM)(图1F)。这些结果表明SMEL能够进行基因座特异性和链特异性5hmC成像。

实施例3.纯化提高了SMEL的检测限

为了实现更灵敏的5hmC修饰检测，任选地将纯化过程应用于退火的TS样品。如图1D所示，比TS多1000倍的SP用于退火，并尽可能多地捕获具有5hmC的TS。但是，大多数表面系链的中性抗生物素蛋白将因此被SP占据，SP在3'末端被生物素标记，并且可以与退火的TS竞争(图2B)。为克服此问题，将退火的TS样品与大肠杆菌外切核酸酶I孵育，以在3'至5'方向上消化单链DNA(ssDNA)(图2A)。该步骤能够有效消除多余的单链SP。有利地，所添加的纯化步骤令人惊讶地将SMEL的检测限提高了10,000倍：从1pM到100渺摩尔(aM)(图2C-2D；图6A-6B)。

实施例4.将SMEL应用于gDNA

为了评估SMEL的性能，评估了其检测来自mESC的真实基因组DNA(gDNA)样品中已知5hmC位点的能力。如图7A所示，首先从mESC中提取gDNA，然后将其片段化至50-200bp以用于标记。基于已发表的mESC中5hmC的碱基分辨率测序，设计了一系列ssDNA探针用于单分子光学成像和用于单个或多个5hmC修饰检测(表2和图10)：SP1-2是靶向不包含5hmC的序列的阴性对照；SP3-4、SP5-6和SP7-8靶向分别包含一个、两个和三个5hmC的序列。如上所述，可以通过分别计数红色和绿色通道中的荧光团来确定5hmC的数量和gDNA片段的总量(图7A-7D)。如预期的那样，纯化系统显著改善了SMEL的检测限，而SP1-2探针无法用于5hmC定量(图8A-8B)。除了计算个体gDNA片段中的荧光团数目外，我们还基于光漂白事件检查了单个或多个5hmC修饰(图3B)，这证实了只有SP7-8检测到三个5hmC修饰，而用SP3-4观察到不超过一个5hmC(图3C)。数据证明了SMEL的高效率和超高灵敏度。以这种方式，通过单分子成像以基因座特异性和链特异性方式验证了5hmC的位置。

*带下划线的C表示5hmC修饰。

实施例5.将SMEL应用于cfDNA

超低输入要求使SMEL能够适用于有限和敏感的样品，例如来自人外周血的cfDNA。基于cfDNA 5hmC测序，尤其是最近报道的碱基分辨率测序，探针SP-a、b被设计为分别靶向单(一个)或双(两个)5hmC修饰。然后将SMEL应用于来自健康个体的cfDNA(图3A，表3和图11)。除了计算荧光团外，还计算了具有一个或多个光漂白的迹线数(图9A-9B)。对于SP-b，11.43％显示两步Cy5光漂白，而对于SP-a，只有1.30％(图3D和表4)。结果表明，所公开的单分子光学成像技术适用于与微量cfDNA一起使用。SMEL使确定5hmC的特定基因组位置成为可能，为使用cfDNA的表观遗传修饰进行癌症诊断提供了成像工具。

*带下划线的C表示5hmC修饰。

实施例6.通过SMEL分析诊断癌症

首先，设计与包含表观遗传修饰的已知基因组区域互补的单链DNA探针，所述表观遗传修饰与一种癌症类型有关。含有cfDNA的样品从怀疑患有该癌症类型的患者获得。根据所公开的SMEL方法对cfDNA进行标记和成像，以定位患者的cfDNA中的DNA表观遗传修饰并生成表观遗传特征谱。将患者的表观遗传特征谱与针对所评估的癌症类型的参考表观遗传特征谱进行比较。当患者的表观遗传特征谱和参考表观遗传特征谱基本一致时，诊断该患者患有癌症。使用外部和内部对照，该方法可以进一步用于评估癌症的进展和阶段。

说明书中提到的专利、申请和出版物指示了本发明所属领域的技术人员的水平。这些专利和出版物通过引用并入本文，就如同每个单独的申请或出版物通过引用被具体地和单独地并入在本文一样。

前述描述是对本发明的特定实施方案的举例说明，但并不意味着对其实施的限制。以下权利要求(包括其所有等同物)旨在限定本发明的范围。

序列表

<110> University of Cincinnati

Chancellor, Masters and Scholars of the University of

Oxford

<120> 单分子表观遗传定位

<130> 10738-758; 2019-047

<150> 62746121

<151> 2018-10-16

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

cccgacgcat gatctgtact tgatcgaccg tgcaac 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人

<400> 2

gttgcacggt cgatcaagta cagatcatgc gtcggg 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针

<400> 3

gttgcacggt cgatcaagta cagatcatgc gtcggg 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针

<400> 4

cccgacgcat gatctgtact tgatcgaccg tgcaac 36

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 5

gaaaggtgga gaggcgcgca gggttacccg agtgagctcc ggcaccctga 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP1

<400> 6

tcagggtgcc ggagctcact cgggtaaccc tgcgcgcctc tccacctttc 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 7

gaaatgcttt gcatccctct cgagcctggc catataggta atggctttgc 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP2

<400> 8

gcaaagccat tacctatctg gacaggctcg agagggacgc caagcatttc 50

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 9

ttatcttcaa ggccttcatt gtgccgtcat tgttagcgct ttcaaccttt 50

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP3

<400> 10

aaaggttgaa agcgctaaca atgacggcac aatgaaggcc ttgaagataa 50

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 11

gatcccactg ttaattaaag ctaccgttga acttactgtt taatgatttc 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP4

<400> 12

gaaatcatta aacagtaagt tcaacggtag ctttaattaa cagtgggatc 50

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 13

cccagctcag gctccaccgt ggttacatga cgacacaaat gagaaatgct 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP5

<400> 14

agcatttctc atttgtgtcg tcatgtaacc acggtggagc ctgagctggg 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 15

tgggctaggg caagcacttc ggggagaggt acgagaggga acaaaggcat 50

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP6

<400> 16

atgcctttgt tccctctcgt acctctcccc gaagtgcttg ccctagccca 50

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 17

ctgtgacagc agaaagcgct gcgtacctcc caacgacctt tcaccaaaga 50

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP7

<400> 18

tctttggtga aaggtcgttg ggaggtacgc agcgctttct gctgtcacag 50

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 19

catcgcagct ttcccacgat ggctgccgat tagccgaggt gcgcgttgga 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP8

<400> 20

tccaacgcgc acctcggcta atcggcagcc atcgtgggaa agctgcgatg 50

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 21

cactgcacac acccaccagt gctacccgca taggacagga cactcaggaa 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP-a

<400> 22

ttcctgagtg tcctgtccta tgcgggtagc actggtgggt gtgtgcagtg 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人

<400> 23

tccgtatcgt aaaactatcc tccctgttcg gcgcgttggc acattctgtt 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链DNA探针 SP-b

<400> 24

aacagaatgt gccaacgcgc cgaacaggga ggatagtttt acgatacgga 50