一种集成气路控制的细胞反应模块及采用其进行细胞反应的方法

摘要

本发明提供了一种集成气路控制的细胞反应模块及采用其进行细胞反应的方法，所述的细胞反应模块包括相互贴合的集成气路控制板和细胞反应板，所述的集成气路控制板内部开设有至少两条相互独立的驱动气路通道，所述的细胞反应板与集成气路控制板贴合的一侧表面设置有与驱动气路通道数量相同的试剂槽，每条驱动气路通道独立连通一个试剂槽；所述的细胞反应板远离集成气路控制板的一侧表面开设有反应腔，所述的反应腔与试剂槽连通。本发明通过在集成气路控制板内部开槽的方式，将各条驱动气路通道集成于一体，使得反应试剂的流路控制过程稳定可靠，整体细胞反应模块安装方便且占用空间小。

说明书

技术领域

本发明属于细胞反应技术领域，涉及一种集成气路控制的细胞反应模块及采用其进行细胞反应的方法。

背景技术

细胞是生物学的基本单位，研究人员正更加努力地尝试将它们进行单个分离、研究和比较。单细胞测序是指DNA研究中涉及测序单细胞微生物相对简单的基因组，更大更复杂的人类细胞基因组。

单细胞测序主要包括单细胞基因组测序和转录组测序，通过对单个细胞内的DNA和RNA进行序列分析，分别揭示单个细胞的基因组和转录组的变化情况。单细胞全基因组测序是对选定的目的细胞的全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，随后利用外显子捕获技术进而高通量测序。单细胞转录组测序是利用高通量测序技术进行cDNA测序，从而获取特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，主要用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合，单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。

CN208104383U公开了一种用于高效单细胞液滴制备的微流控芯片，其包括：反应液入口，标记物溶液入口，单细胞入口，其与细胞储液容器相连通，所述细胞储液容器中设置有一搅拌装置；油相入口；单细胞通道，其入口与单细胞入口相连通；液体混合通道，其入口与单细胞通道的出口、反应液入口、标记物溶液入口分别连通；液滴生成通道，其入口与液体混合通道的出口、油相入口相连通，并在液滴生成通道中使油相包裹于单细胞表面，形成单细胞液滴；以及，液滴生成出口，其与液滴生成通道的出口相连通。

CN103571738A公开了一种基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置及制备方法，由PDMS基底层、两对应的微流控芯片模块A和模块B、置于两微流控芯片模块之间的半透膜、顶层盖片和相应进、出样管道组成。微流控芯片模块A用于待处理细胞样本注入及富集分选，模块A中的样品池连接2进样口和2出样口，实现待处理细胞样本的注入和富集于半透膜上的组织干细胞的分选；模块B用于注入趋化因子，借助半透膜在模块A样品池靠近半透膜区域形成趋化效应。注入模块A内部的细胞样本中的多种组织干细胞将在趋化效应下向半透膜运动，并实现与其它细胞的分离，分离后的干细胞和其它细胞样本经不同的出样口收集。

CN108117968A公开了一种基于液滴微流控芯片的高通量自动捕获单细胞的方法。该微流控芯片所述芯片由两层组成，上层为流路出入口层；下层为流路控制层；所述流路出入口层有液体流路通道入口和液体流路通道出口；所述流路控制层由单细胞捕获流路通道、气路通道、液滴生成单元组成。该方法引入了气压可控的气体流路通道，可形成负压流路通道并自动将单细胞悬液吸入捕获阱，便于观察、检测单细胞的增殖、分化以及药物反应等行为。

目前市面上的单细胞样本制备芯片中有涉及气路系统的部分，大多由注射器连通各类开关阀门和压力传感器等元件，但各零件需要经过接头转换，在转换过程汇总，容易产生不稳定的偏差，如何继承此气路系统为一体，缩小零件体积的同时确保性能稳定，是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种集成气路控制的细胞反应模块及采用其进行细胞反应的方法，本发明通过在集成气路控制板内部开槽的方式，将各条驱动气路通道集成于一体，部分驱动气路通道会经由电磁阀连通，从而通过上位机控制开关，根据需求实现不同驱动气路通道之间的连通或独立，利用驱动气作为注入反应试剂的驱动力进行反应试剂的流路输送。在使用过程中，向不同的驱动气路通道内注入驱动气，可将不同试剂槽内的反应试剂逐一注入反应腔，不同反应试剂的注入过程彼此独立互不影响，使得反应试剂的流路控制过程稳定可靠，整体细胞反应模块安装方便且占用空间小。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种集成气路控制的细胞反应模块，所述的细胞反应模块包括相互贴合的集成气路控制板和细胞反应板，所述的集成气路控制板内部开设有至少两条相互独立的驱动气路通道，所述的细胞反应板与集成气路控制板贴合的一侧表面设置有与驱动气路通道数量相同的试剂槽，每条驱动气路通道独立连通一个试剂槽；所述的细胞反应板远离集成气路控制板的一侧表面开设有反应腔，所述的反应腔与试剂槽连通，所述的试剂槽内预先注入反应试剂，驱动气经驱动气路通道注入试剂槽，试剂槽内的反应试剂在驱动气的压力驱动下流入反应腔。

本发明通过在集成气路控制板内部开槽的方式，将各条驱动气路通道集成于一体，部分驱动气路通道会经由电磁阀连通，从而通过上位机控制开关，根据需求实现不同驱动气路通道之间的连通或独立，利用驱动气作为注入反应试剂的驱动力进行反应试剂的流路输送。在使用过程中，向不同的驱动气路通道内注入驱动气，可将不同试剂槽内的反应试剂逐一注入反应腔，不同反应试剂的注入过程彼此独立互不影响，使得反应试剂的流路控制过程稳定可靠，整体细胞反应模块安装方便且占用空间小。

需要说明的是，本发明对驱动气路通道的开设方式不作具体要求和特殊限定，只要满足驱动气的顺利传输即可。示例性地，可选采用如下两种方案：

方案一：集成气路控制板为一体式结构，驱动气路通道通过浇筑、钻孔或增材制造等方式直接开设于集成气路控制板内部；

方案二：集成气路控制板为分体式结构，由气路上板和气路下板层叠贴合形成，气路上板和/或气路下板之间的贴合面开设有气路凹槽，气路上板和气路下板贴合后，气路凹槽封闭形成驱动气路通道；当然可以理解的是，在本方案中，气路凹槽可以开设于气路上板的下表面或气路下板的上表面，也可以同时开设于气路上板的下表面和气路下板的上表面。

需要说明的是，细胞反应板内同样开设了微流道，供反应试剂流动，微流道的开设方式可参见上述关于驱动气路通道的描述，也即细胞反应板可以为一体式结构或分体式结构，当细胞反应板为一体式结构时，微通道通过浇筑、钻孔或增材制造等方式直接开设于细胞反应板内部；当然，细胞反应板可以由反应上板和反应下板层叠贴合形成分体式结构，在反应上板和/或反应下板的贴合面处开设流道凹槽，反应上板和反应下板贴合后使得流道凹槽封闭形成微通道。

需要说明的是，本发明对试剂槽的数量不作具体要求，试剂槽与驱动气路通道的数量相同，且每一条驱动气路通道的出气端均对应一个试剂槽，本领域技术人员可以根据不同的细胞反应对试剂槽的数量及位置进行针对性设计。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的细胞反应板与集成气路控制板贴合的一侧表面还设置有缓冲槽，所述的试剂槽和反应腔分别独立地连通缓冲槽，沿驱动气的流动方向，所述的驱动气路通道、试剂槽和缓冲槽依次连通，驱动气经驱动气路通道通入试剂槽，各试剂槽内储存的反应试剂逐一进入缓冲槽，并通过缓冲槽注入反应腔。

优选地，所述驱动气路通道的进气端设置有电磁阀，所述的电磁阀用于控制驱动气的通入量。

在本发明中，接入驱动气路通道的电磁阀主要用于控制驱动气的流量，本发明提供的细胞反应模块在使用过程中，试剂槽内储存的反应试剂在驱动气的压力驱动下压入缓冲槽，通过电磁阀调节驱动气的流量，从而改变反应试剂进入至缓冲槽内的注入量，可选地，在本发明提供的集成气路控制板中集成设置有控制模块，控制模块与电磁阀电性连接，从而实现对驱动气流量的自动控制。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的细胞反应板与集成气路控制板贴合的一侧表面还设置有废液槽，所述的废液槽与反应腔连通，所述的集成气路控制板内部开设有废液抽气通道，所述的废液抽气通道与废液槽连通，沿抽气方向，所述的反应腔、废液槽和废液抽气通道依次连通，通过所述的废液抽气通道抽气，将反应腔内反应结束后的废液抽入废液槽。

需要说明的是，本发明提供的废液抽气通道参与了两步工序，具体而言：

其一，在细胞反应过程中，在反应试剂由试剂槽注入缓冲槽后，通过废液抽气通道向外抽气，由于废液槽、反应腔和缓冲槽依次连通，因此缓冲槽内暂存的反应试剂会在吸力的作用下抽入反应腔，但此时需要特别注意抽气负压不能过大，防止进入反应腔的反应试剂进一步抽入废液槽；

其二，在细胞反应结束后，再次通过废液抽气通道向外抽气，反应腔内残留的反应废液在吸力的作用下抽入废液槽。

优选地，所述的废液抽气通道的抽气端设置有电磁阀，所述的电磁阀用于控制抽气量。

在本发明中，接入废液抽气通道的电磁阀主要用于控制抽气量，根据上述分析可知，废液抽气通道参与了两步工序，这两步工序都需要控制抽气量，尤其是在第一步工序中需要严格控制抽气量，防止抽气产生的负压过大，导致反应腔的反应试剂进一步抽入废液槽，因此本发明在废液抽气通道的抽气端设置电磁阀，结合控制模块对抽气量进行自动控制。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的细胞反应板与集成气路控制板贴合的一侧表面还设置有产物槽，所述的产物槽与反应腔连通，所述的集成气路控制板内部开设有产物抽气通道，所述的产物抽气通道与废液槽连通，沿抽气方向，所述的反应腔、产物槽和产物抽气通道依次连通，通过所述的产物抽气通道抽气，将反应腔内得到的反应产物抽入产物槽内。

优选地，所述的产物抽气通道的抽气端设置有电磁阀，所述的电磁阀用于控制抽气量。

在本发明中，接入产物抽气通道的电磁阀主要用于控制抽气量，在细胞反应结束后，通过产物抽气通道对产物槽进行抽气，使得反应腔内的反应产物进入产物槽，为了将反应腔内的反应产物全部抽入产物槽，需要对抽气量进行严格控制，因此本发明在废液抽气通道的抽气端设置电磁阀，结合控制模块对抽气量进行自动控制。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的集成气路控制板和细胞反应板之间夹设有硅胶垫，所述的硅胶垫上开设通孔，通过通路通孔连通集成气路控制板和细胞反应板。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的电磁阀集中布置于集成气路控制板远离细胞反应板的一侧表面。

本发明通过设置不同类型的电磁阀实现了整个流路的控制，不同的电磁阀实现了不同的控制功能，传统的流体电磁阀在安装使用时，存在占用空间大且安装繁琐等问题，本发明在集成气路控制板表面为电磁阀预留了安装位，便于电磁阀的安装和拆卸，同时将电磁阀集成安装于集成气路控制板表面，流体可通过集成气路控制板内部的流路，实现对整个流路的控制。

优选地，所述的集成气路控制板上还开始有观察窗，通过所述观察窗观察反应腔内的反应情况。

第二方面，本发明提供了一种采用第一方面所述的细胞反应模块进行细胞反应的方法，所述的方法包括：

试剂槽内预先注入反应试剂，驱动气经驱动气路通道注入试剂槽，试剂槽内的反应试剂在驱动气的压力驱动下流入反应腔，进行细胞反应。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的方法具体包括：

(Ⅰ)驱动气经电磁阀通入驱动气路通道，驱动气沿独立的驱动气路通道注入对应的试剂槽，试剂槽内储存的反应试剂在驱动气的压力驱动下压入缓冲槽；

(Ⅱ)通过废液抽气通道对废液槽进行抽气，使得缓冲槽内的反应试剂抽入反应室内完成试剂注入；

(Ⅲ)重复进行步骤(Ⅰ)和步骤(Ⅱ)，使得各个试剂槽内的反应试剂均注入反应腔内，进行细胞反应。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的方法还包括：在细胞反应结束后，再次通过废液抽气通道对废液槽进行抽气，使得反应腔内的废液进入废液槽内。

作为本发明一种优选的技术方案，所述的方法还包括：在细胞反应结束后，通过产物抽气通道对产物槽进行抽气，使得反应腔内的反应产物进入产物槽。

所述系统是指设备系统、装置系统或生产装置。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过在集成气路控制板内部开槽的方式，将各条驱动气路通道集成于一体，部分驱动气路通道会经由电磁阀连通，从而通过上位机控制开关，根据需求实现不同驱动气路通道之间的连通或独立，利用驱动气作为注入反应试剂的驱动力进行反应试剂的流路输送。在使用过程中，向不同的驱动气路通道内注入驱动气，可将不同试剂槽内的反应试剂逐一注入反应腔，不同反应试剂的注入过程彼此独立互不影响，使得反应试剂的流路控制过程稳定可靠，整体细胞反应模块安装方便且占用空间小。

附图说明

图1为本发明一个具体实施方式提供的细胞反应板的结构示意图；

图2为本发明一个具体实施方式提供的细胞反应板的俯视图；

图3为本发明一个具体实施方式提供的集成气路控制板的结构示意图；

图4为本发明一个具体实施方式提供的集成气路控制板的俯视图；

其中，1-细胞反应板；2-试剂槽；3-缓冲槽；4-废液槽；5-产物槽；6-反应腔；7-集成气路控制板；8-电磁阀；9-观察窗；10-驱动气路通道。

具体实施方式

需要理解的是，在本发明的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本领域技术人员理应了解的是，本发明中必然包括用于实现工艺完整的必要管线、常规阀门和通用泵设备，但以上内容不属于本发明的主要发明点，本领域技术人员可以基于工艺流程和设备结构选型进可以自行增设布局，本发明对此不做特殊要求和具体限定。

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

在一个具体实施方式中，本发明提供了一种集成气路控制的细胞反应模块，所述的细胞反应模块包括相互贴合的集成气路控制板7(如图1所示)和细胞反应板1(如图3所示)，集成气路控制板7内部开设有至少两条相互独立的驱动气路通道10，细胞反应板1与集成气路控制板7贴合的一侧表面设置有与驱动气路通道10数量相同的试剂槽2，每条驱动气路通道10独立连通一个试剂槽2；细胞反应板1远离集成气路控制板7的一侧表面开设有反应腔6，反应腔6与试剂槽2连通，试剂槽2内预先注入反应试剂，驱动气经驱动气路通道10注入试剂槽2，试剂槽2内的反应试剂在驱动气的压力驱动下流入反应腔6。

通过在集成气路控制板7内部开槽的方式，将各条驱动气路通道10集成于一体，各条驱动气路通道10之间彼此独立互不连通，利用驱动气作为注入反应试剂的驱动力进行反应试剂的流路输送。在使用过程中，向不同的驱动气路通道10内注入驱动气，可将不同试剂槽2内的反应试剂逐一注入反应腔6，不同反应试剂的注入过程彼此独立互不影响，使得反应试剂的流路控制过程稳定可靠，整体细胞反应模块安装方便且占用空间小。

需要说明的是，在本具体实施方式中，驱动气路通道10的开设方式采用如下两种方案：

方案一：集成气路控制板7为一体式结构，驱动气路通道10通过浇筑、钻孔或增材制造等方式直接开设于集成气路控制板7内部；

方案二：集成气路控制板7为分体式结构，由气路上板和气路下板层叠贴合形成，气路上板和/或气路下板之间的贴合面开设有气路凹槽，气路上板和气路下板贴合后，气路凹槽封闭形成驱动气路通道10；当然可以理解的是，在本方案中，气路凹槽可以开设于气路上板的下表面或气路下板的上表面，也可以同时开设于气路上板的下表面和气路下板的上表面，如图4所示，气路凹槽开设于气路上板的下表面，图中未示出气路下板，但也可以理解的是，当气路下板与气路上板相对贴合后，图4中示出的气路凹槽则被气路下板封闭从而形成驱动气路通道10。

需要说明的是，细胞反应板1内同样开设了微流道，供反应试剂流动，微流道的开设方式可参见上述关于驱动气路通道10的描述，也即细胞反应板1可以为一体式结构或分体式结构，当细胞反应板1为一体式结构时，微通道通过浇筑、钻孔或增材制造等方式直接开设于细胞反应板1内部；当然，细胞反应板1可以由反应上板和反应下板层叠贴合形成分体式结构，在反应上板和/或反应下板的贴合面处开设流道凹槽，反应上板和反应下板贴合后使得流道凹槽封闭形成微通道，如图2所示，流道凹槽开设于反应上板的下表面，图中未示出反应下板，但也可以理解的是，当反应下板与反应上板相对贴合后，图2中示出的流道凹槽则被反应下板封闭从而形成微通道。

细胞反应板1与集成气路控制板7贴合的一侧表面还设置有缓冲槽3，试剂槽2和反应腔6分别独立地连通缓冲槽3，沿驱动气的流动方向，驱动气路通道10、试剂槽2和缓冲槽3依次连通，驱动气经驱动气路通道10通入试剂槽2，各试剂槽2内储存的反应试剂逐一进入缓冲槽3，并通过缓冲槽3注入反应腔6。驱动气路通道10的进气端设置有电磁阀8，电磁阀8用于控制驱动气的通入量。在细胞反应过程中，试剂槽2内储存的反应试剂在驱动气的压力驱动下压入缓冲槽3，通过电磁阀8调节驱动气的流量，从而改变反应试剂进入至缓冲槽3内的注入量，可选地，在本发明提供的集成气路控制板7中集成设置有控制模块，控制模块与电磁阀8电性连接，从而实现对驱动气流量的自动控制。

细胞反应板1与集成气路控制板7贴合的一侧表面还设置有废液槽4，废液槽4与反应腔6连通，集成气路控制板7内部开设有废液抽气通道，废液抽气通道与废液槽4连通，沿抽气方向，反应腔6、废液槽4和废液抽气通道依次连通，通过废液抽气通道抽气，将反应腔6内反应结束后的废液抽入废液槽4。废液抽气通道的抽气端设置有电磁阀8，所述的电磁阀8用于控制抽气量。

需要说明的是，废液抽气通道参与了两步工序，具体而言：

其一，在细胞反应过程中，在反应试剂由试剂槽2注入缓冲槽3后，通过废液抽气通道向外抽气，由于废液槽4、反应腔6和缓冲槽3依次连通，因此缓冲槽3内暂存的反应试剂会在吸力的作用下抽入反应腔6，但此时需要特别注意抽气负压不能过大，防止进入反应腔6的反应试剂进一步抽入废液槽4；

其二，在细胞反应结束后，再次通过废液抽气通道向外抽气，反应腔6内残留的反应废液在吸力的作用下抽入废液槽4。

细胞反应板1与集成气路控制板7贴合的一侧表面还设置有产物槽5，产物槽5与反应腔6连通，集成气路控制板7内部开设有产物抽气通道，产物抽气通道与废液槽4连通，沿抽气方向，反应腔6、产物槽5和产物抽气通道依次连通，通过产物抽气通道抽气，将反应腔6内得到的反应产物抽入产物槽5内。产物抽气通道的抽气端设置有电磁阀8，所述的电磁阀8用于控制抽气量。在细胞反应结束后，通过产物抽气通道对产物槽5进行抽气，使得反应腔6内的反应产物进入产物槽5，为了将反应腔6内的反应产物全部抽入产物槽5，需要对抽气量进行严格控制，通过在废液抽气通道的抽气端设置电磁阀8，结合控制模块对抽气量进行自动控制。

集成气路控制板7和细胞反应板1之间夹设有硅胶垫，硅胶垫上开设通孔，通过通路通孔连通集成气路控制板7和细胞反应板1。电磁阀8集中布置于集成气路控制板7远离细胞反应板1的一侧表面。通过设置不同类型的电磁阀8实现了整个流路的控制，不同的电磁阀8实现了不同的控制功能，本具体实施方提供的细胞反应模块中，在集成气路控制板7表面为电磁阀8预留了安装位，便于电磁阀8的安装和拆卸，同时将电磁阀8集成安装于集成气路控制板7表面，流体可通过集成气路控制板7内部的流路，实现对整个流路的控制。集成气路控制板7上还开始有观察窗9，通过所述观察窗9观察反应腔6内的反应情况。

在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种采用上述具体实施方式提供的细胞反应模块进行细胞反应的方法，所述的方法包括：

(1)驱动气经电磁阀8通入驱动气路通道10，驱动气沿独立的驱动气路通道10注入对应的试剂槽2，试剂槽2内储存的反应试剂在驱动气的压力驱动下压入缓冲槽3；

(2)通过废液抽气通道对废液槽4进行抽气，使得缓冲槽3内的反应试剂抽入反应室内完成试剂注入；

(3)重复进行步骤(1)和步骤(2)，使得各个试剂槽2内的反应试剂均注入反应腔6内，进行细胞反应；

(4)在细胞反应结束后，再次通过废液抽气通道对废液槽4进行抽气，使得反应腔6内的废液进入废液槽4内；通过产物抽气通道对产物槽5进行抽气，使得反应腔6内的反应产物进入产物槽5。

本应用例提供了一种具体的细胞反应方法，所述的方法包括：

(1)细胞反应板1内的各个试剂槽2中预先注入各类反应试剂，包括细胞缓冲液、芯片表面处理溶剂、细胞裂解液、反转录试剂、反转录清洗液和标签磁珠9种试剂；

(2)驱动气经电磁阀8通入驱动气路通道10，驱动气沿独立的驱动气路通道10注入对应的试剂槽2，试剂槽2内储存的反应试剂在驱动气的压力驱动下压入缓冲槽3；

(3)通过废液抽气通道对废液槽4进行抽气，使得缓冲槽3内的反应试剂抽入反应室内完成试剂注入；

(4)重复进行步骤(2)和步骤(3)，使得各个试剂槽2内的反应试剂均注入反应腔6内，将细胞反应的温度控制在42℃，反应1.5h后得到DNA产物；

(5)在细胞反应结束后，再次通过废液抽气通道对废液槽4进行抽气，使得反应腔6内的废液进入废液槽4内；通过产物抽气通道对产物槽5进行抽气，使得反应腔6内的反应产物进入产物槽5。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。