急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物及应用

摘要

本发明公开了急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物，包括丙氨酰‑缬氨酸、组氨酸‑亮氨酸、亮氨酸‑赖氨酸和色氨酸‑缬氨酸中的任意一种或几种。本发明还公开了包含所述二肽类代谢物标志物的产品。本发明还公开了急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物在制备急性电离辐射早期肠损伤诊断产品或科学研究中的应用。本发明的二肽类代谢物标志物和方法可实现急性电离辐射早期肠损伤的大批量群体的无创检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物及应用。

背景技术

随着核技术在工业、医学及军事等多领域的广泛应用，核泄漏或核事故等屡见报道，由其导致的生物群体急性电离辐射损伤的发生几率也显著增加。对于急性全身电离辐射损伤，尚缺乏积极有效的治疗手段。对于大批量可能受辐射群体，早期快速地进行筛选诊断有助于科学制定医学救治措施、合理利用救助资源。肠为电离辐射高度敏感组织，而目前急性电离辐射早期肠损伤的检测标志物尚缺乏。

代谢组学是系统生物学的重要组成部分，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后出现的以定量描述生物体内代谢物变化为目标的新兴组学。代谢组处于基因调控网络和蛋白质作用网络的下游，提供的是生物学的终端信息。代谢物与上游基因、蛋白进行相互作用以反馈上游的生命活动网络，以完成机体所赋予的各项功能活动。肠道代谢物种类及相对含量改变与人体健康状态密切相关。研究表明，电离辐射会导致肠道代谢物类型或含量等出现不同程度改变。探索筛选肠道代谢物标志物对于生物体急性电离辐射早期肠损伤检测具有重要意义与实用价值。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物。

本发明另一个目的是提供包含所述二肽类代谢物标志物的产品。

本发明再有一个目的是提供所述二肽类代谢物标志物在制备急性电离辐射早期肠损伤诊断产品或科学研究中的应用。

为了实现根据本发明的目的和其它优点，本发明提供的技术方案为：

急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物，所述二肽类代谢物标志物为丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine中的任意一种或几种。

包含所述二肽类代谢物标志物的产品。

优选的是，所述的产品中，所述产品为急性电离辐射早期肠损伤诊断用产品。

优选的是，所述的产品中，所述产品含有测定样本中所述二肽类代谢物标志物的含量的方法和试剂。

优选的是，所述的产品中，所述急性电离辐射早期肠损伤诊断用产品试剂盒和/或仪器检测平台。

优选的是，所述的产品中，所述仪器检测平台包括：

高通量检测模块，其用于测量样本中所述二肽类代谢物标志物的含量，所述样本包括正常样本和待测样本；

分析模块，其用于分析比较待测样本中所述二肽类代谢物标志物的含量以及正常样本中所述二肽类代谢物标志物的含量高低，根据比较结果判断待测样本的来源生物体是否存在急性电离辐射早期肠损伤，若丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、和/或组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、和/或亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine、和/或色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine的含量低于正常样本中含量的二分之一且具有显著统计学差异，则待测样本的来源生物体存在急性电离辐射早期肠损伤，否则，不存在急性电离辐射早期肠损伤。

优选的是，所述的产品中，所述样本为粪便。

优选的是，所述的产品中，所述二肽类代谢物标志物的含量通过代谢组学高通量检测分析获得。

所述二肽类代谢物标志物在制备急性电离辐射早期肠损伤诊断产品或科学研究中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提出的急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物，二肽类代谢物标志物包括丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine中的任意一种或几种；对于大批量可能受急性全身电离辐射损伤的生物群体，检测所述二肽类代谢物标志物含量并与正常未受辐射生物群体的含量相比，根据含量比率是否低于二分之一且有显著统计学差异，判断其是否受急性电离辐射损伤，实现急性电离辐射早期肠损伤的大批量群体的无创检测。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为发明其中一个实施例中辐射后二肽类代谢物相对含量改变结果图，其中，

图2为本发明其中一个实施例中四种标志物在急性放射性早期肠损伤中预测能力评估的ROC曲线分析图；

图3为本发明其中一个实施例中验证组1中四种代谢物相对含量比率改变结果图，其中

图4为本发明其中一个实施例中验证组2中四种代谢物相对含量比率改变结果图，其中

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供了急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物，所述二肽类代谢物标志物为丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine中的任意一种或几种。

本发明还提供了包含所述二肽类代谢物标志物的产品。

在本发明的其中一些技术方案中，作为优选，所述产品为急性电离辐射早期肠损伤诊断用产品。

在本发明的其中一些技术方案中，作为优选，所述产品含有测定样本中所述二肽类代谢物标志物的含量的方法和试剂。

在本发明的其中一些技术方案中，作为优选，所述急性电离辐射早期肠损伤诊断用产品试剂盒和/或仪器检测平台。

在本发明的其中一些技术方案中，作为优选，所述仪器检测平台包括：

高通量检测模块，其用于测量样本中所述二肽类代谢物标志物的含量，所述样本包括正常样本和待测样本；

分析模块，其用于分析比较待测样本中所述二肽类代谢物标志物的含量以及正常样本中所述二肽类代谢物标志物的含量高低。根据比较结果判断待测样本的来源生物体是否存在急性电离辐射早期肠损伤，若丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、和/或组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、和/或亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine、和/或色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine的含量低于正常样本中含量的二分之一且具有显著统计学差异，则待测样本的来源生物体存在急性电离辐射早期肠损伤，否则，不存在急性电离辐射早期肠损伤。

在本发明的其中一些技术方案中，作为优选，所述样本为粪便。

在本发明的其中一些技术方案中，作为优选，所述二肽类代谢物标志物的含量通过代谢组学高通量检测分析获得。

本发明还提供所述的二肽类代谢物标志物在制备急性电离辐射早期肠损伤诊断产品或科学研究中的应用。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

实施例1

1、实验模型小鼠制备

将16只体重为18±2克的二级雄性C57BL/6N小鼠(购自维通利华实验动物公司)，随机分为对照组和辐射组，每组8只。采用军事医学研究院

2、小鼠肠道粪便样品收集

在辐射后第1天，将小鼠全部麻醉处死，取出全肠，于超净台中收集肠道所有粪便至冻存管中，迅速放入超低温冰箱中冻存。待所有样品收集完毕，将样品进行代谢组学高通量检测。

3、小鼠肠道粪便代谢组学高通量检测

3.1非靶向代谢组学代谢物的提取

称取0.1克的粪便样品，进行液氮研磨。向样品加入120微升50％甲醇，震动充分混匀，提取样品中的代谢物，常温静置10分钟。提取液放-20度过夜，沉淀样品中的蛋白质。高速离心20分钟，转移上清液代谢物提取液到96孔板。每个样品等量取出10微升稀释液混合成质控样品。所有代谢物样品在上样前放-80度冰箱保存。

3.2液相部分

采用超高压液相，采集时柱温设置为35度，流速为0.4毫升每分钟。采用的流动相为A相：水(1％甲酸)；B相：乙腈(1％甲酸)。液相梯度设置为：

3.3质谱部分

采用高分辨率飞行时间质谱对样本进行正离子模式采集，离子源的遮蔽气压为30磅每平方英寸，辅气和鞘气压力均设置为60磅每平方英寸。源温度650度，电压为正5000伏，采集数据的模式为信息依赖性采集。在一个采集循环中，一级采集范围为60-1200道尔顿，一级采集时间为150毫秒，然后从一级图谱中挑选带一个正电荷并且每秒信号积累强度超过100的前12个信号离子进行二级碎裂扫描。在采集过程中每间隔10个样本进行一次仪器准确度校正和一次质控品的扫描，来校正整批实验的系统误差。

4、生物信息学分析

4.1代谢物峰提取

利用Proteowizard的MSConver软件将原始文件转换成mzXML文件，导入XCMS软件进行峰提取、保留时间矫正。

4.2代谢物注释

利用CAMERA软件进行代谢物同位素、加和离子分析。利用metaX软件结合KEGG、HMDB数据库进行物质注释。将质谱二级碎片数据与in-house代谢物标准品二级图谱库进行匹配打分，提取相似性大于80％的代谢物。

4.3代谢物定量

①将XCMS提取所有样品的所有代谢物强度输入metaX软件。

②去缺失值严重的代谢物。首先去掉在50％质控样品中缺失的代谢物，去掉在80％样品中缺失的代谢物，这些代谢物是个别样品存在，不能进行样品定量分析。

③补充缺失值。利用KNN(k-nearest neighbor)算法，对剩下来的缺失值进行补充。

④数据归一化。利用PQN(probabilistic quotient normalization)算法对所有样品进行数据归一化。再利用质控样品进行QC-RSC(QC-robust spline batchcorrection)校正。

⑤去掉不稳定的代谢物。将在质控样品中RSD(relative standard deviations)>30％的代谢物去掉。理论上质控样品所有的代谢物的信号都比较一致，由于非生物因素，如仪器噪音，实验过程引入不确定物质等，造成这些物质在质控样品强度不稳定，将这些物质去掉，得到高质量代谢物。

5、差异代谢物筛选及比较分析

对二级代谢物进行单变量分析，主要计算代谢物强度(即相对含量)在两表型间的比率，并利用T检验进行统计学分析。其中二肽类代谢物丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine的相对含量比率结果见图1。

由图1结果可以看出，急性电离辐射(Radiation)样本中的二肽类代谢物丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine的相对含量低于正常对照(Control)样本相对含量的二分之一，且均具有显著统计学差异。因此，丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine可作为生物群体急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物。

6、各标志物预测能力评估

通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线及计算ROC曲线下面积AUC，来评估各标志物预测急性放射性损伤的诊断价值。在AUC大于0.5的情况下，AUC越接近于1说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，在0.7～0.9时有一定准确性，在0.9以上时有较高准确性。上述4种标志物在进行急性放射性损伤预测的ROC曲线如图2。

由图2结果可知，上述四种标志物ROC曲线下面积AUC均为1，表明两个群组完美区分，该标志物能准确应用于急性电离辐射早期肠损伤的诊断。

实施例2

为了进一步验证实施例1确定的二肽类代谢物丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine能够作为不同辐射剂量条件下急性电离辐射早期肠损伤检测的代谢物标志物，发明人另取了23只体重为18±2克的二级雄性C57BL/6N小鼠(购自维通利华实验动物公司)，随机分为验证组1(8只)、验证组2(8只)和对照组(7只)。具体的，采用军事医学研究院

验证结果见图3和图4。从图3和图4结果可知，两个不同辐射剂量验证组中代谢物丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine的相对含量均低于正常对照样本相对含量的二分之一，且均具有显著统计学差异。与实施例1中的结果保持一致。表明二肽类代谢物丙氨酰-缬氨酸Alanyl-Valine、组氨酸-亮氨酸Histidinyl-Leucine、亮氨酸-赖氨酸Leucyl-Lysine和色氨酸-缬氨酸Tryptophyl-Valine能够作为不同辐射剂量条件下急性电离辐射早期肠损伤检测的代谢物标志物，用于诊断急性电离辐射早期肠损伤。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的急性电离辐射早期肠损伤检测二肽类代谢物标志物及应用的修改和变化等对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。