一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD50预测方法

摘要

本发明公开了一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD50预测方法，包括：使用能够表达GFP融合蛋白的DNA损伤响应荧光酵母传感器，通过对暴露于亚硝胺化合物后GFP融合蛋白表达水平进行实时监测，采用蛋白总表达水平TEL对遗传毒性进行定量，根据亚硝胺化合物的TEL1.5，对无TD50数据报道的亚硝胺化合物的TD50进行预测。本发明方法具有成本低、省时、信息可靠且样品用量少的优点，可以广泛应用，有利于提高药物研发速度与质量。

说明书

技术领域

本发明属于药品分析检测领域，涉及一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD

背景技术

在药品的生产和储藏过程中，可能会引入具有潜在的致突变性与致癌性的杂质，即遗传毒性杂质(Genotoxic Impurities,GTIs)。遗传毒性杂质通常通过与DNA或其他控制细胞凋亡的靶标相互作用，引起DNA加合物的诱导、链断裂、点突变以及染色体的结构和数值变化

与亚硝胺杂质有关的药物召回事件引发了全球制药行业和全球药物监管机构的关注，以亚硝胺杂质为代表的遗传毒性杂质的相关监管也日益严格

药物杂质的遗传毒性评估面临杂质纯品量少、杂质种类多的问题。目前，采用哺乳动物实验测得致癌性数据TD

因此，为提高药物研发速度与质量，亟需发展一种成本更低、速度更快、信息更可靠的遗传毒性评估方法。

参考文献

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发明内容

本发明针对现有遗传毒性评估方法的不足与缺陷，将表达绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)融合蛋白的荧光酵母传感器应用于亚硝胺杂质遗传毒性评估，为新药研发单位与机构提供一种快速、便捷且成本低的亚硝胺化合物TD

本发明的技术方案如下：

一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD

具体的，一种以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD

步骤(1)、获取GFP荧光响应和OD

步骤(2)、蛋白总表达水平的计算：

(a)、OD

GFP

OD

其中，GFP

(b)、融合蛋白表达水平的计算：

P

其中，P

(c)、融合蛋白表达诱导倍数的计算：

FI

其中，Pi,t-

(d)、融合蛋白表达总水平的计算：

其中，AP

(e)、DNA损伤修复相关蛋白总表达水平的计算：

其中，n表示荧光酵母传感器集合中GFP融合蛋白数量；w

步骤(3)、在GraphPad Prism软件中使用四参数对数非线性回归模型对亚硝胺化合物的浓度-TEL响应曲线进行拟合；遗传阈值设定为1.5，根据拟合曲线计算TEL达到1.5时亚硝胺化合物的对应浓度TEL

步骤(4)、在GraphPad Prism软件中对亚硝胺化合物的TEL

步骤(5)、按照步骤(1)-步骤(4)，使用DNA损伤响应荧光酵母传感器测定无TD

步骤(1)中，所述的DNA损伤响应荧光酵母传感器是能够表达GFP-融合蛋白的酿酒酵母菌株，它通过在染色体基因开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)后插入维多利亚水母gfp基因进行系统性标记构建而成。标记后的基因受内源性启动子调控，能够表达带有荧光标记的GFP融合蛋白，从而使GFP信号能够反映蛋白表达情况。针对目前已知的七种损伤修复途径，分别选择一种GFP标记的特定基因进行指示，GFP融合蛋白表达水平的变化可以表明不同DNA损伤相关修复途径的反应水平。当亚硝胺化合物引起细胞DNA损伤时，相应的损伤修复途径被激活，特定的GFP融合蛋白通过内源性启动子表达。可以通过检测荧光酵母传感器的荧光信号来定量GFP融合蛋白的表达水平，并指示DNA损伤修复途径的反应水平。荧光酵母传感器区别于其他化合物体外遗传毒性评估方法的突出特点是：酵母与人类响应DNA损伤的基本细胞反应相似，两者共享许多保守的生化途径，以酵母活细胞作为实验模型，能够捕获所有类型的损伤信号，直接反映细胞生命活动中DNA损伤情况，具有显著的生物学优势，同时光学传感信号适合高通量检测，所需测试物的用量亦非常微少。

不同DNA损伤修复途径及选择的GFP融合蛋白如下所示：

所述的黑色壁透明底微孔板为96孔黑色壁透明底微孔板。

所述的培养基为SD/-His液体培养基。

待测亚硝胺化合物为N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二正丙胺、N-亚硝基二正丁胺、N-亚硝基-N-甲基苯胺、N-亚硝基吗啉、1-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基二乙醇胺。

待测亚硝胺化合物溶液中亚硝胺化合物的浓度为DNA损伤响应荧光酵母传感器的细胞存活率≥95％时亚硝胺化合物的浓度，从而剔除具有细胞毒性的高浓度，在不表现出细胞毒性的浓度下进行后续遗传毒性测试。待测亚硝胺化合物溶液可以为系列浓度样品溶液，也可以为单个浓度样品溶液。

所述的PBS缓冲液为pH 7.2-7.4的PBS缓冲液。

每组(即测试组：某一种DNA损伤响应荧光酵母传感器对应的某一个亚硝胺化合物、某一亚硝胺化合物浓度；空白组；对照组)设置3个平行。

测定测定GFP荧光响应的条件为：激发波长485nm，发射波长535nm。

具体的，获取GFP荧光响应和OD

步骤(3)中，四参数对数非线性回归模型中，四参数指Bottom、Top、EC50和HillSlope，拟合曲线时会给出四个参数的值。

拟合方程为Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-LogX)*HillSlope))

步骤(4)中，TEL

步骤(5)中、按照步骤(1)-步骤(4)，使用DNA损伤响应荧光酵母传感器测定无TD

和现有相比，本发明在评估亚硝胺化合物时具有以下有益效果：

本发明以荧光酵母传感器为基础的亚硝胺TD

(1)、所用的酿酒酵母易于培养、生长迅速，具有坚韧的细胞壁，耐受性良好，是优异的生物传感材料；作为真核生物，与哺乳动物细胞响应DNA损伤的基本反应相似；基因组小，遗传背景相对简单，易于进行遗传操作。

(2)、所用的表达GFP-融合蛋白的酿酒酵母菌株已经商品化，易于获得；菌种可以传代后反复使用，制备成甘油菌能够长期保存，而测定过程只需酶标仪即可实现，具有成本低、操作便捷、省时的优势。

(3)、系列化合物溶液通过逐级稀释实现，配制标准液的样品用量最低仅需几十毫克，具有样品用量低的优点。

(4)、荧光酵母传感器能够直接反应细胞生命活动，捕获各种类型的DNA损伤信号，与哺乳动物细胞的生理活动相似。

(5)、荧光酵母传感器的信号识别与转导单元集于一体，能够与高通量的微孔板模式兼容，适合种类繁多的杂质化合物的高通量筛选。

附图说明

图1.化合物24小时孵育测试(

图2.N-亚硝基二甲胺(NDMA)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。X轴顶部：每种化合物的浓度；X轴底部：测试时间；Y轴：指示DNA损伤修复途径的GFP融合蛋白。

图3.N-亚硝基二乙胺(NDEA)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图4.N-亚硝基二丙胺(NDPA)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图5.N-亚硝基二丁胺(NDBA)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图6.N-亚硝基-N-甲基苯胺(NMPhA)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图7.N-亚硝基吗啉(NMOR)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图8.1-亚硝基吡咯烷(NPYR)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图9.N-亚硝基二乙醇胺(NDELA)的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图10.水杨酸的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图11.双酚A的实时DNA损伤修复蛋白表达谱，诱导倍数的自然对数(ln FI，n＝3)表示蛋白质表达改变的幅度，黑色表示GFP融合蛋白表达水平上调，白色表示GFP融合蛋白表达水平下调。

图12.化合物的浓度-响应曲线(

图13.TEL

具体实施方式

1.1.仪器

THZ-100恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；SpectraMax M2e多功能酶标仪(美国Molecular Devices仪器有限公司)；GI54DS高压灭菌器(美国Zealway仪器有限公司)；AB135-S型电子分析天平(d＝0.01mg)(瑞士METTLER TOLEDO集团)。

1.2.试剂

N-亚硝基二甲胺(NDMA，99％)、N-亚硝基二乙胺(NDEA，99％)、N-亚硝基二丙胺(NDPA，98％)、N-亚硝基二丁胺(NDBA，99％)、N-亚硝基-N-甲基苯胺(NMPhA，≥98％)和1-亚硝基吡咯烷(NPYR，99％)购自上海麦克林生化科技有限公司；N-亚硝基吗啉(NMOR，>99％)和N-亚硝基二乙醇胺(NDELA，>97％)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜(DMSO，99％)、水杨酸(≥99.5％)和双酚A(BPA，≥99.5％)购自南京试剂有限公司；PBS缓冲液(pH 7.4)购自上海生工生物工程股份有限公司；SD/-His培养基购自上海艾礼生物科技有限公司。所有化学品未经进一步纯化即可使用。

1.3.菌株

DNA损伤响应荧光酵母菌株(No.95702，ATCC 201388)购自美国Invitrogen公司。选用的酵母细胞集合由8种DNA损伤响应荧光酵母菌株组成，涵盖了7条DNA损伤修复途径。

表1.使用的酵母菌株

不同DNA损伤修复途径及选择的GFP融合蛋白如表2所示：

表2.不同DNA损伤修复途径及选择的GFP融合蛋白

1.4.酵母琼脂穿刺复苏

配制SD/-His液体培养基：称取5.58g SD/-His培养基固体粉末，溶于200mL超纯水，121℃灭菌15min制成SD/-His液体培养基，备用。

向灭菌后的试管中加入SD/-His液体培养基。用灭菌牙签分别蘸取每种酵母菌的克隆穿刺后，浸入试管液面以下；试管置于30℃、220rpm条件下振荡培养。待菌液培养至OD

1.5.酵母甘油菌的制备

准备无菌离心管数支，加入一定体积50％(v/v)甘油溶液，备用；每支离心管中加入复苏后酵母菌液，混匀，封口，甘油终浓度为12.5％；取甘油菌管于4℃静置数小时，再于-20℃静置数小时，最后置于-80℃冰箱中冷冻保存。

1.6.测试化合物溶液的配制

精确称取8种亚硝胺化合物与2种阴性对照(水杨酸、双酚A)适量，溶于100％二甲基亚砜(DMSO)，制成储备液；将储备液用PBS溶液逐级稀释，直至得到系列稀释的样品溶液。

系列稀释的样品溶液：

NDMA：1×10

NDEA：1×10

NDPA：5×10

NDBA：1×10

NMPhA：5×10

NMOR：5×10

NPYR：1×10

NDELA：5×10

水杨酸：1×10

BPA：1×10

1.7.化合物细胞毒性测试

以8种亚硝胺化合物(NDMA，NDEA，NDPA，NDBA，NMPhA，NMOR，NPYR和NDELA)和两个阴性对照(水杨酸和BPA)为测试化合物，进行细胞毒性测试。

配制SD/-His固体培养基：称取5.58g SD/-His培养基固体粉末，溶于200mL超纯水，再加20g纯化琼脂，121℃灭菌15min；待温度冷却至55℃时倒入塑料培养皿中冷却至液体凝固制成SD/-His固体培养基，备用；取酵母甘油菌进行平板划线，挑取单菌落，接种至新鲜SD/-His液体培养基中，置于30℃、220rpm条件下振荡培养过夜，备用。

取过夜培养的酵母菌液，更换新鲜SD/-His液体培养基，培养至OD

将微孔板置于30℃、100rpm黑暗条件下振荡培养；24h后取出微孔板，测定OD

细胞存活率＝(OD

图1显示，测试化合物在高孵育浓度下均表现出一定的细胞生长抑制作用，且在荧光酵母传感器中以剂量依赖性方式引起细胞毒性。以存活率曲线达到95％时的浓度量化细胞毒性水平，得到测试化合物细胞毒性排列如下：NDELA

定义最大非细胞毒性浓度为细胞存活率≥95％时测试化合物的浓度。剔除具有细胞毒性的高浓度，在不表现出细胞毒性的浓度下进行后续遗传毒性测试。

1.8.GFP融合蛋白表达测试

取过夜培养的酵母菌液(同“1.7.化合物细胞毒性测试”)，更换新鲜SD/-His液体培养基，培养至OD600值约为0.15；向96孔黑壁透明底微孔板(使用黑壁是为了避免各孔的荧光互相干扰，透明底是为了测量吸光度)加入190μL酵母菌液/孔，每孔再加入10μL PBS或样品溶液分别作为对照组和测试组，设置空白组：每孔加入190μL培养基与10μL PBS；每组设置3个平行。

根据化合物细胞毒性测试测定结果，样品溶液的浓度为：

NDMA：1×10

NDEA：1×10

NDPA：5×10

NDBA：1×10

NMPhA：5×10

NMOR：5×10

NPYR：1×10

NDELA：5×10

水杨酸：1×10

BPA：1×10

将96孔黑壁透明底微孔板置于酶标仪中，振荡1min后，每间隔5min在黑暗条件下测定一次GFP荧光响应(激发波长485nm，发射波长535nm)和OD

如图2-图11，实时DNA损伤修复蛋白表达谱显示出不同化合物的损伤机制和损伤水平。特定蛋白的表达具有浓度依赖性，损伤修复反应强度与化合物的测试浓度有关，通常随着浓度增加，蛋白质表达的幅度也随之增加。对于某些化合物的特定蛋白质表达，如NDEA中的MLH2-GFP和NDPA中的RAD30-GFP，在最高暴露浓度下，蛋白质表达的上调幅度降低，甚至变为下调。这可能是由于在高暴露浓度下细胞内反应由特异性化学反应转变为细胞毒性反应。

亚硝胺化合物对所有七个DNA损伤修复途径均具有一定程度的活化作用。PHR1-GFP和MAG1-GFP融合蛋白的高表达水平表明，直接逆向修复(DRR)和碱基切除修复(BER)途径被激活。这与N-亚硝胺化合物代谢形成α-羟基亚硝胺相一致，后者可在分解后使遗传物质烷基化。RAD2-GFP和RAD52-GFP融合蛋白高表达，它们分别代表核苷酸切除修复(NER)和双链断裂修复(DSBR)途径，这与亚硝胺化合物能够引起DNA断裂相一致。本发明获得的DNA损伤修复蛋白表达图谱的激活信息与文献报道的遗传毒性机制一致，因此可用于分析尚未充分研究的亚硝胺化合物的DNA损伤机制。暴露于所有测试的亚硝胺化合物后，指示DNA损伤信号(DDS)的CHK1-GFP融合蛋白的表达上调幅度较小，这表明DNA损伤修复中由亚硝胺化合物引起DDS的激活水平可能不高，而RAD30-GFP融合蛋白的普遍上调反映了跨损伤DNA合成(TLS)的普遍激活。NDEA，NDPA，NMPhA，NMOR和NDELA的暴露实验中指示错配修复(MR)的MLH2-GFP融合蛋白的上调幅度较低，表明错配可能不是大多数亚硝胺化合物的主要DNA损伤机制。对于大多数测试的亚硝胺化合物(例如NDMA，NDEA，NDBA，NMPhA和NMOR)，指示非同源末端连接(NHEJ)的YKU70-GFP融合蛋白的上调水平通常比RAD52-GFP等其他蛋白弱，这表明亚硝胺化合物诱导的DSBR中，同源重组(HR)反应强于NHEJ。

测试的亚硝胺化合物均能高度激活DSBR，这不仅与DNA结构的直接破坏有关，而且可能受到其他DNA损伤激活的间接影响。亚硝胺化合物诱导了更加广泛的DNA损伤修复途径的激活，表明它们的遗传毒性与亚硝胺的结构有关，后者通常会导致细胞DNA结构的破坏。不同衍生物对DNA损伤的方式和程度存在差异，这可能与其结构中取代基有关。

水杨酸和BPA两种阴性对照中大部分GFP融合蛋白的表达水平下调，且随着暴露浓度增加，下调幅度增加，表明显示阴性对照的DNA修复途径未被激活。

1.9.数据处理

1、蛋白总表达水平的计算：

(a)、OD

GFP

OD

其中，GFP

(b)、融合蛋白表达水平的计算：

P

其中，P

(c)、融合蛋白表达诱导倍数的计算：

FI

其中，Pi,t-

(d)、融合蛋白表达总水平的计算：

其中，AP

(e)、DNA损伤修复相关蛋白总表达水平的计算：

其中，n表示荧光酵母传感器集合中GFP融合蛋白数量，n＝8；w

2、在GraphPad Prism软件中使用四参数对数非线性回归模型对亚硝胺化合物的浓度-TEL响应曲线进行拟合；拟合方程为：

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-LogX)*HillSlope))

遗传阈值设定为1.5，根据拟合曲线计算TEL达到1.5时亚硝胺化合物的对应浓度TEL

每种亚硝胺化合物的TEL值的剂量响应曲线均表现出对称的S形，非线性回归模型拟合结果如图12所示。TEL量化了测试浓度范围内的测试化合物在暴露时间内诱导的DNA损伤修复途径相关蛋白的整体表达效果。TELmax表示蛋白质集合在测试浓度范围内的最高表达总水平。对于八种亚硝胺化合物，根据剂量响应曲线获得的TELmax均超过阈值1.5，表明所测试的亚硝胺化合物均具有遗传毒性。相应地，两种阴性对照的剂量响应曲线的TELmax均小于1.5。低浓度下亚硝胺化合物的TEL值均低于1.5，随着浓度增加，TEL值逐渐增大，与实时蛋白质表达谱的趋势相一致。

3、亚硝胺化合物的TEL

TD

表3.测试化合物的TEL

注：a表示数据来自Lhasa致癌性数据库(https://carcdb.lhasalimited.org/)；ND表示未检出；-表示不适用。

在GraphPad Prism软件中对亚硝胺化合物的TEL

图13表明：TEL

基于本发明的TEL