从核酸的初始集合中耗尽靶分子的方法、以及用于实践其的组合物和试剂盒

摘要

本发明提供的是从核酸的初始集合中耗尽靶核酸的方法。方法的方面包括以足以从初始集合中耗尽靶核酸的方式，使初始集合与对于靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。取决于给定应用，靶核酸的耗尽可不同，例如其中耗尽可包括切割核酸的初始集合中的靶核酸，或从核酸的初始集合中选择性分离靶核酸。本发明还提供的是用于实践方法的实施例的组合物和试剂盒。

说明书

本申请是2014年12月23日提交的名称为“从核酸的初始集合中耗尽靶分子的方法、以及用于实践其的组合物和试剂盒”，申请号为201480077658.0的中国专利申请的分案申请。

根据35U.S.C.§119(e)，本专利申请要求于2014年2月13日提交的美国临时专利申请序列号61/939,658，以及于2014年8月22日提交的美国临时专利申请序列号62/040,804的优先权；所述专利申请的公开内容以引用的方式并入本文。

背景技术

生物医学研究中的应用通常涉及其他序列的复杂混合物中存在的特异性核酸子集的分析-例如，通过阵列杂交、qPCR或大规模平行测序的基因表达分析。如果目的核酸序列是已知的，则使用特异性引物序列的PCR可用于从混合物中扩增出所需序列。然而，在一些情况下，可能期望分析多重不同序列，可能在序列信息并非完全已知时。例如，真核生物系统中的信使RNA可使用寡核苷酸-dT引物共同扩增且分析，以通过在聚A尾部上引发来起始第一链cDNA合成，由此减少或避免被不需要的核酸-例如核糖体RNA、线粒体RNA和基因组DNA污染。然而，这种方法的要求在于RNA是完整且未降解的，例如聚A尾部未丢失或与RNA信使本体切断。不幸的是，许多本来有用和有利的生物样本-例如作为福尔马林固定和石蜡包埋的组织样品(FFPE样品)保留的活组织检查材料通常受累于此类降解，使得寡核苷酸-dT引发对于此类样品不实际。此外，许多有利的RNA序列没有聚A尾部-例如非编码RNA和非真核生物RNA。在此类情况下，随机引发可用于一般扩增样品中的所有核苷酸种类。然而，随机引发还导致潜在不需要的序列-例如基因组DNA或核糖体RNA的扩增。

发明内容

本发明提供的是从核酸的初始集合(collection)中耗尽靶核酸的方法。方法的方面包括以足以从初始集合中耗尽靶核酸的方式，使初始集合与对于靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。取决于给定应用，靶核酸的耗尽可不同，例如其中耗尽可包括切割核酸的初始集合中的靶核酸，或从核酸的初始集合中选择性分离靶核酸。本发明还提供的是用于实践方法的实施例的组合物和试剂盒。

附图说明

图1示意性举例说明了在本公开内容的某些实施例中有用的核酸引导的核酸酶。

图2示意性举例说明了根据本公开内容的一个实施例，用于产生核酸引导组分的方法。

图3显示了在图2中示意性举例说明的方法中有用的三种示例寡核苷酸。

图4显示了通过凝胶电泳显现的模板核酸的图像。根据本公开内容的一个实施例，模板核酸在通过体外转录产生核酸引导组分中有用。

图5显示了通过凝胶电泳显现的核酸的图像。图像证实根据本公开内容的一个实施例，使用核酸引导的核酸酶的靶核酸切割。

图6显示了通过凝胶电泳显现的核酸的图像。图像证实根据本公开内容的一个实施例，使用核酸引导的核酸酶的两种不同靶核酸的同时切割。

图7提供了根据本公开内容的一个实施例，证实使用核酸引导的核酸酶，用于下一代测序的核酸文库中的靶核酸(在本实例中为18S rRNA)耗尽的数据。小图A显示了指示使用一种或两种示例核酸引导的核酸酶的靶核酸耗尽量的条形图。小图B显示了根据本公开内容的一个实施例，使用渐增量的核酸酶的靶核酸耗尽量。在本实例中，采用核酸引导的核酸酶库(pool)，其中该库包括单一类型的核酸酶组分和不同种类的具有不同核苷酸序列的核酸引导组分。

图8提供了根据本公开内容的一个实施例，证实使用核酸引导的核酸酶的靶核酸耗尽的数据。在本实例中，采用核酸引导的核酸酶库，其中该库包括单一类型的核酸酶组分和不同种类的具有不同核苷酸序列的核酸引导组分。

图9是使用根据本公开内容的一个实施例的方法，显示测序结果且证实从测序文库中耗尽靶核酸的效应的条形图。

图10提供了根据本公开内容的一个实施例，证实使用核酸引导的核酸酶的靶核酸切割的数据。小图A显示了根据本公开内容的一个实施例，证实示例核酸酶组分的纯化的凝胶图像。小图B显示了使用包括小图A中所示的核酸酶组分的核酸引导的核酸酶，证实靶核酸的切割的凝胶图像。

图11显示了根据本公开内容的一个实施例，使用不同量的核酸引导的核酸酶，证实靶核酸的切割的凝胶图像。

图12提供了证实加上6xHN标签的Cas9的D10A/H840A突变体的表达和纯化的数据(小图A)，以及使用与核酸引导组分库组合的突变体从核酸的初始集合中取出靶核酸且产生富含靶核酸的核酸样品的原理证明(小图B)。

具体实施方式

本发明提供的是从核酸的初始集合中耗尽靶核酸的方法。方法的方面包括以足以从初始集合中耗尽靶核酸的方式，使初始集合与对于靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。取决于给定应用，靶核酸的耗尽可不同，例如其中耗尽可包括切割核酸的初始集合中的靶核酸，或从核酸的初始集合中选择性分离靶核酸。本发明还提供的是用于实践方法的实施例的组合物和试剂盒。

在更详细地描述本公开内容的方法和试剂盒之前，应理解方法和试剂盒并不限于所述的特定实施例，因为这些当然可改变。还应理解本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不预期是限制性的，因为方法和试剂盒的范围仅受所附权利要求限制。

当提供值范围时，应理解除非上下文另有明确说明，否则在该范围的上限和下限之间至下限单位十分之一的每个介入值以及该所述范围内的任何其他陈述或介入值，都涵盖在方法和试剂盒内。这些更小范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在方法和试剂盒内，经历所述范围内的任何具体排除的限度。当所述范围包括限度之一或两者时，排除那些所包括限度中的任一或两者的范围也包括在方法和试剂盒中。

某些范围在本文中由术语“约”在前的数值呈现。术语“约”在本文中用于提供它在其之前的确切数目的字面支持，以及接近或近似该术语在其之前的数目的数目。在测定数目是否接近或近似特定叙述数目中，接近或近似未叙述数目可为这样的数目，在其中呈现它的上下文中，所述数目提供了特定叙述数目的实质等价物。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与方法所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管目前描述了代表性举例说明性方法和材料，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法和试剂盒也可用于方法和试剂盒的实践或测试中。

本说明书中引用的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文，如同每个个别出版物或专利特别且个别指出以引用的方式并入，并且以引用的方式并入本文以公开且描述出版物与其结合引用的方法、试剂盒和/或材料。任何出版物的引用均用于在提交日期前的其公开内容，并且不应解释为承认本文方法和试剂盒由于在先发明而无权早于这种出版物。此外，所提供的出版日期可不同于实际出版日期，所述实际出版日期可能需要独立证实。

如本文和所附权利要求中使用的，应注意到单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。还注意到权利要求可拟定为排除任何任选元件。像这样，这种陈述预期充当与请求保护的元件叙述结合的排他性术语例如“单独地”、“唯一”等等的使用，或“负”限制的使用的先行基础。

应了解为了明确起见，在分开实施例的上下文中描述的方法和试剂盒的某些特征还可在单个实施例中组合提供。相反，为了简短起见，在单个实施例的上下文中描述的试剂盒和方法的各种特征也可分开或以任何合适的亚组合提供。所有实施例组合均由本发明具体包含且在本文中公开，正如每个和每一个组合个别且特别公开，至此类组合包含可操作过程和/或装置/系统/试剂盒的程度。另外，描述此类变量的实施例中列出的所有亚组合也由本文方法和试剂盒具体包含，并且在本文中公开，正如每个和每一个此类亚组合个别且明确在本文中公开。

如阅读本公开内容后对于本领域技术人员显而易见的，本文描述且举例说明的个别实施例各自具有不连续组分和特征，所述不连续组分和特征可与其他几个实施例中的任一个的特征容易分开或组合，而不背离本文方法和试剂盒的范围或精神。任何叙述方法均可以叙述的事件次序或逻辑上可能的任何其他次序进行。

在进一步描述本发明的实施例中，首先更详细地描述主题方法的实施例的方面。其后，更详细地描述用于实践主题方法的试剂盒的实施例的方面。

方法

本发明的方面包括从核酸的初始集合中选择性耗尽靶核酸的方法。“耗尽”靶核酸意指减少核酸的初始集合中的靶核酸量。例如，靶核酸可通过经由一种或多种核酸引导的核酸酶在靶核酸内的一个或多个位置处切割靶核酸得到耗尽，在所述核酸引导的核酸酶中核酸酶组分具有核酸酶活性。初始集合中存在的未耗尽的核酸随后可用于下游目的应用中，例如核酸扩增、核酸测序、基因表达分析(例如通过阵列杂交、定量RT-PCR、大规模平行测序等)、或任何其他下游目的应用。

可替代地，靶核酸可通过从核酸的初始集合中取出(和任选回收)靶核酸得到耗尽。如下文更详细地描述的，在某些方面，使用包括切割缺陷核酸酶的核酸引导的核酸酶实现从初始集合中取出靶核酸，所述核酸酶可包括有助于从核酸的初始集合中取出核酸酶(和相应地，核酸酶与之结合的靶核酸)的异质组分(例如标签)。通过从初始集合中取出/回收靶核酸，可获得富含靶序列的核酸的后续集合。这种富集的样品(例如富含外显子组的样品、富含目的基因实验对象组的样品等)随后可用于下游目的应用中，例如核酸扩增、核酸测序、基因表达分析(例如通过阵列杂交、定量RT-PCR、大规模平行测序等)、或任何其他下游目的应用。

根据某些实施例，耗尽初始集合中存在的靶核酸包括通过切割此类靶核酸来耗尽靶核酸的某些种类，以及通过从核酸的初始集合中取出(和任选回收)此类靶核酸来耗尽靶核酸的某些其他种类。

靶核酸可不同。“核酸”意指任何长度例如为10个碱基或更长、20个碱基或更长、50个碱基或更长、100个碱基或更长、500个碱基或更长、1000个碱基或更长、2000个碱基或更长、3000个碱基或更长、4000个碱基或更长、5000个碱基或更长、10,000个碱基或更长、50,000或更多个碱基的聚合物，所述碱基由核苷酸例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成。在一些情况下，核酸长度为100,000个碱基或更少，例如75,000个碱基或更少，包括50,000个碱基或更少，例如25,000个碱基或更少，例如10,000个碱基或更少、5,000个碱基或更少、2,000个碱基或更少、1,000个碱基或更少、或者500个碱基或更少。

从初始集合中耗尽靶核酸部分减少(如果并非完全消除)集合中靶核酸的存在。在一些情况下，在核酸的初始集合中的给定靶核酸的拷贝数减少5％或更多，例如10％或更多，例如25％或更多，包括50％、75％、90％或更多，包括其中靶核酸的存在完全消除的实施例。耗尽靶核酸减少就样品中的总核酸而言样品中的靶核酸百分比。在某些方面，在靶核酸耗尽后，与样品中的靶核酸的初始量相比较，靶核酸的剩余百分比为50％、40％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，包括0.5％、0.1％、0.01％或更少。通过耗尽初始集合中的靶核酸，核酸类型(例如期望核酸)可在集合中富集。根据某些实施例，在其中靶核酸已耗尽的样品中，某类核酸(例如DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)等等)在样品中富集，使得相对于总数，样品中剩余的该类核酸的百分比为5％或更多，例如10％或更多、25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、75％或更多，包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和99.5％或更多。

使核酸的初始集合与核酸引导的核酸酶接触。如本文使用的，“核酸引导的核酸酶”是包括核酸酶组分和核酸引导组分的结合(例如复合物)。核酸引导的核酸酶可具有核酸酶/切割活性，例如催化靶核酸(例如靶DNA、靶RNA等)水解成两种或更多种产物，由此耗尽靶核酸。需要时，切割产物可从样品中取出(例如以纯化核酸的剩余集合)。在某些实施例中，当期望通过切割耗尽某些靶核酸时，所使用的不同的核酸引导的核酸酶数目和/或被核酸引导的核酸酶切割的靶核酸位置可这样选择，使得所有或几乎所有靶核酸片段足够小，以通过核酸纯化步骤例如乙醇或异丙醇沉淀、旋转柱纯化(例如使用通过ClontechLaboratories,Inc.(Mountain View,CA)的

在某些方面，核酸酶是由于修饰而不具有核酸酶活性(即是切割缺陷的)的经修饰的核酸酶。此类核酸酶可用于耗尽靶核酸，例如在从核酸的初始集合中取出在核酸引导的核酸酶和靶核酸之间形成的复合物中存在的靶核酸后，所述取出在某些方面通过核酸酶上提供的标签(例如表位标签)得到促进。

任何合适的核酸酶组分均可由主题方法的从业者采用。核酸酶组分可为显示出核酸酶活性的野生型酶，或保留其核酸酶活性的其修饰变体。在其他方面，核酸酶组分可为与异质核酸酶(或“切割”)结构域可操作地连接的非核酸酶蛋白质，使得蛋白质能够由于与核酸酶结构域连接而切割靶核酸。合适的切割结构域是已知的，并且包括例如FokI限制性核酸内切酶的DNA切割结构域。例如，在某些方面，核酸引导的核酸酶的核酸酶组分可为Cas9(例如野生型Cas9或切割缺陷Cas9)或与切割结构域可操作地连接的其他核酸酶，例如FokI切割结构域。根据某些实施例，核酸酶是为切割缺陷的突变体，例如Sp、Cas9 D10A突变体、Cas9 H840A突变体、Cas9 D10A/H840A突变体(参见例如Sander&Joung(2014)NatureBiotechnology 32:347–355doi:10.1038/nbt.2842)、或任何其他合适的切割缺陷突变体。此类策略已成功地用于对锌指和转录激活物样效应物(TALE)蛋白质赋予核酸酶活性，以分别生成锌指核酸酶和TALEN，用于基因组改造目的(参见例如Kim等人(1996)PNAS 93(3):1156-1160，以及美国专利申请公开号US2003/0232410、US2005/0208489、US2006/0188987、US2006/0063231和US2011/0301073)。

根据某些实施例，核酸酶结构域来源于核酸内切酶。核酸酶/切割结构域可来源于其的核酸内切酶包括但不限于：Cas核酸酶(例如Cas核酸酶)、Argonaute核酸酶(例如TthAgo、哺乳动物Ago2等)、S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；限制性核酸内切酶；归巢核酸内切酶等等；还参见Mishra(Nucleases:MolecularBiology and Applications(2002)ISBN-10:0471394610)。在某些方面，核酸引导的核酸酶的核酸酶组分是新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)的Cas9核酸酶(或其任何合适变体)，其使用scaRNA来靶向RNA以进行降解(参见Sampson等人(2013)Nature 497:254-257)。

如上所述，根据某些实施例，核酸引导的核酸酶包括CRISPR结合的(或“Cas”)核酸酶。CRISPR/Cas系统是古细菌和许多细菌中与真核生物RNA干扰(RNAi)途径具有相似性的RNA介导的基因组防御途径。途径起于两个进化上(且通常物理上)连锁的基因座：编码系统的RNA组分的CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)基因座；和编码蛋白质的Cas(CRISPR结合的)基因座。

存在全部掺入RNA和Cas蛋白质的三类CRISPR/Cas系统。II型CRISPR系统在四个序贯步骤中进行靶DNA的双链断裂。首先，两种非编码RNA(crRNA前体阵列和tracrRNA)由CRISPR基因座进行转录。其次，tracrRNA与crRNA前体的重复区域杂交，并且介导crRNA前体加工成含有个别间隔物序列的成熟crRNA。第三，经由crRNA上的间隔物和紧靠原间隔物邻近基序(PAM)的靶DNA上的原间隔物之间的沃森-克里克碱基配对，成熟crRNA:tracrRNA复合物将Cas9导向靶DNA，所述PAM是靶识别的另外要求。最后，Cas9介导靶DNA的切割，以在原间隔物内产生双链断裂。

CRISPR系统I型和III型两者均具有加工crRNA前体的Cas核酸内切酶，当所述crRNA前体完全加工成crRNA时，装配能够切割与crRNA互补的核酸的多Cas蛋白质复合物。在II型CRISPR/Cas系统中，crRNA通过下述机制产生：在所述机制中与crRNA前体中的重复序列互补的反式激活RNA (tracrRNA)，在Cas9蛋白质的存在下触发通过双链特异性RNA酶III的加工。Cas9随后能够以取决于crRNA和靶DNA之间的碱基配对的方式，切割与成熟crRNA互补的靶DNA，并且crRNA中的短基序的存在被称为PAM序列(原间隔物邻近基序)。

crRNA-tracrRNA复合物的需求可通过使用crRNA和tracrRNA的改造融合物得到避免，以形成包含通常通过crRNA和tracrRNA的退火形成的发夹的“单引导RNA”(sgRNA)。参见例如Jinek等人(2012)Science 337:816-821；Mali等人(2013)Science 339:823-826；和Jiang等人(2013)Nature Biotechnology 31:233-239。当双链RNA:DNA异二聚体在Cas结合的RNA和靶DNA之间形成时，sgRNA指导Cas9来切割靶DNA。包括Cas9蛋白质和含有PAM序列的改造sgRNA的这种系统已用于RNA引导的基因组编辑，其中编辑效率类似于ZFN和TALEN。参见例如Hwang等人(2013)Nature Biotechnology 31(3):227。

根据某些实施例，核酸引导的核酸酶的核酸酶组分是CRISPR结合的蛋白质，例如Cas蛋白质。Cas蛋白质的非限制性例子包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修饰形式。在某些方面，核酸引导的核酸酶的核酸酶组分是Cas9。Cas9可来自任何目的生物，包括但不限于具有NGG的PAM序列的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(“spCas9”,Uniprot Q99ZW2)；具有NNNNGATT的PAM序列的脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)(“nmCas9”,Uniprot C6S593)；具有NNAGAA的PAM序列的嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)(“stCas9”,Uniprot Q5M542)，以及具有NAAAAC的PAM序列的齿垢密螺旋体(Treponema denticols)(“tdCas9”,Uniprot M2B9U0)。图1中示意性举例说明了包括Cas9核酸酶和sgRNA引导组分的示例核酸引导的核酸酶，其中sgRNA引导组分与一般化靶核酸的互补区对齐。

在某些方面，核酸引导的核酸酶的核酸酶组分是Argonaute(Ago)核酸酶。Ago蛋白质是对RNA干扰(RNAi)平台以及微小RNA(miRNA)功能和生物发生关键的进化上保守的蛋白质家族。它们最为已知的是作为小RNA介导的基因调节机制所需的RNA诱导沉默复合物(RISC)的核心组分。在转录后基因沉默中，通过小RNA(例如siRNA、miRNA、piRNA等)引导的Ago经由碱基配对与互补转录物结合，并且充当召募蛋白质以有助于基因沉默的平台。

哺乳动物具有八种Argonaute蛋白质，其分成两个亚家族：Piwi进化枝和Ago进化枝。在野生型Ago蛋白质(Ago1-4或EIF2C1–4)中，仅Ago2具有核酸内切酶活性。全长人Ago2(Uniprot Q9UKV8)的晶体结构已得到分辨。参见例如Elkayam等人(2012)Cell 150(1):100-110。类似于细菌配对物，人Ago2是包含N末端(N)、PAZ、MID和PIWI结构域的二裂片结构。PAZ结构域锚定小RNA的3'末端，并且对于Ago2的催化活性是可有可无的。然而，PAZ结构域缺失破坏非催化Ago展开小RNA双链体且形成功能RISC的能力。

当核酸引导的核酸酶的核酸酶组分是Ago核酸酶时，核酸酶可为切割DNA双链体、RNA双链体、或DNA-RNA双链体的Ago核酸酶。Ago核酸酶可来源于任何合适的生物，例如原核生物或真核生物。在某些方面，Ago是原核生物Ago。目的原核生物Ago包括但不限于嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)Ago(“Tth Ago”)，例如Wang等人(2008)Nature 456(7224):921-926；和Wang等人(2009)Nature 461(7265):754-761中所述的Tth Ago核酸酶。使用TthAgo和长度为13-25个核苷酸的5'磷酸化DNA引导的DNA引导的体内DNA干扰近期由Swarts等人(2014)Nature 507:258-261描述。

核酸引导的核酸酶可包括具有核酸酶活性(例如催化靶核酸(例如靶DNA、靶RNA等)的水解)的核酸酶，或可为由于修饰而不具有核酸酶活性(例如是切割缺陷的)的经修饰的核酸酶。在一些情况下，核酸酶组分(例如Cas核酸酶组分)是切割缺陷突变体，并且该方法导致包含靶核酸/核酸引导的核酸酶复合物的产物组合物的产生。当是所得的复合物的部分时，靶核酸在核酸集合中不再游离，并且因此已从核酸的初始集合中耗尽。在其他方面，复合物的核酸酶组分是有切割能力的核酸酶，但核酸引导的核酸酶在靶核酸切割后保持与靶核酸的片段结合。在一些情况下，该方法还包括使靶核酸/核酸引导的核酸酶复合物(例如包括有切割能力的核酸酶组分和/或切割缺陷核酸酶组分，例如D10A Cas9突变体、H840A Cas9突变体、D10A/H840A Cas9突变体等等)与产物组合物的其他组成成分分开(例如取出)。需要时，核酸酶组分可包括标签，例如表位标签、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S-标签、SBP标签、Sof标签、GST标签、GFP标签、生物素、链霉亲和素、6-His标签等，例如以有助于复合物与初始集合的其他组分分开(例如通过亲和纯化)。

根据某些实施例，当该方法涉及靶核酸/核酸引导的核酸酶复合物的形成时，该方法还包括从复合物中回收靶核酸。可采用用于回收靶核酸的任何合适策略。此类策略可包括使复合物与组合物的其他组成成分分开，并且随后使靶核酸与核酸引导的核酸酶解离。在某些方面，核酸引导的核酸酶的核酸酶组分包括标签(例如表位标签)，并且复合物可通过亲和纯化与其他组成成分分开。例如，复合物可固定到固相(例如柱、板、珠(例如琼脂糖珠或磁珠)等等)的表面上，所述固相包括标签的结合配偶体(例如抗体或结合标签的其他合适的结合配偶体)，并且随后洗涤以去除组合物的任何残留组成成分。随后可使用合适的洗脱缓冲液(例如包括蛋白质变性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液)，使用包括消化核酸酶组分的试剂(例如蛋白酶K)的缓冲液，使用热变性等等，以破坏靶核酸和核酸引导的核酸酶之间的相互作用，从核酸引导的核酸酶中回收靶核酸。用于亲和纯化和从蛋白质复合物中回收核酸的方法例如在Methods for Affinity-Based Separations of Enzymesand Proteins(Munishwar Nath Gupta,编辑，

如上文概述的，在某些方面，核酸引导的核酸酶包括核酸引导组分。可采用能够将核酸酶组分导向靶核酸的任何合适的核酸引导组分。如对于采用的特定核酸酶组分适当的，核酸引导组分可为单链或双链的。

核酸引导组分可为任何合适长度的一种或多种核酸聚合物。在某些方面，核酸引导组分是长度为10至200个核苷酸的核酸聚合物(例如单链或双链RNA或DNA)，例如长度为10至150个核苷酸，包括长度为10至100、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、10至25、10至20、或10至15个核苷酸。

核酸引导组分的至少一部分与目的靶核酸的至少一部分互补(例如100％互补或小于100％互补)。核酸引导组分的全部或一部分的序列可通过主题方法的从业者进行选择，以与目的靶核酸充分互补，从而将核酸酶组分特异性导向靶核酸。目的靶核酸的核酸序列由资源可容易获得，所述资源例如美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)(NCBI)、欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所(European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute)(EMBL-EBI)等等的核酸序列数据库。例如，当目的靶核酸是人18S rRNA(1.9kb)和/或人28SrRNA之一或两者时，18S rRNA的核苷酸序列分别作为NCBI参考序列NR_003286.2和NR_003287.2的那些容易获得。

一旦选择靶核酸，并且基于靶核酸的可得序列信息，核酸引导组分可这样设计，使得核酸引导组分的全部或一部分与靶核酸的靶区域足够互补，以在杂交条件下将核酸引导的核酸酶特异性导向靶核酸的靶区域，例如用于通过核酸酶在靶区域处切割，以耗尽靶核酸。

“杂交条件”可包括其中核酸引导组分与靶核酸的靶区域特异性杂交、靶核酸和核酸酶组分之间的相互作用或两者的条件。核酸引导组分是否与靶核酸特异性杂交通过因素例如核酸引导组分和靶核酸之间的互补性程度和长度、以及杂交/接触在其下发生的温度进行测定，所述温度可通过与靶核酸的靶区域互补的核酸引导组分的区域的解链温度(T

根据某些实施例，核酸引导组分是RNA引导组分(或“引导RNA”)。RNA引导组分可包括一种或多种RNA分子。例如，RNA引导组分可包括两种分开转录的RNA(例如crRNA和tracrRNA)，其形成将核酸酶组分(例如Cas9)导向靶核酸的双链体。在其他方面，RNA引导组分是单一RNA分子，其可对应于野生型单一引导RNA，或可替代地，可为改造的单一引导RNA。根据某些实施例，核酸引导组分是包括与tracrRNA部分融合的crRNA部分的经改造的单一引导RNA，所述单一引导RNA能够将核酸酶(例如Cas9)导向靶核酸。

在某些方面，核酸引导组分是DNA引导组分，例如单链或双链引导RNA。根据某些实施例，引导DNA在一个或两个末端处是磷酸化的。例如，引导DNA可为任何合适长度(例如上文阐述的长度中的任一种，包括例如长度为10至30个核苷酸)的5'磷酸化的引导DNA寡核苷酸。本发明人已证实基于引导DNA寡核苷酸和目的靶核酸之间的互补性，包括此类磷酸化的引导DNA寡核苷酸和Tth Ago的核酸引导的核酸酶，从核酸的初始集合中有效耗尽目的靶核酸(参见例如本文的实例部分)。

如上文概述的，本公开内容的方法包括以足以从初始集合中耗尽靶核酸的方式，使核酸的初始集合与对于目的靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。在某些方面，使核酸的初始集合与核酸引导的核酸酶接触包括在反应混合物中组合核酸的初始集合、核酸引导组分和核酸酶组分。在加入反应混合物之前，核酸引导组分和核酸酶组分可稳定结合(例如作为复合物)，或这些组分可分开加入用于彼此的后续结合和靶核酸的靶向/耗尽。在某些方面，接触步骤的至少一部分在其中核酸酶组分是活性的且能够切割靶核酸的条件下发生。

在其下核酸的初始集合与核酸引导的核酸酶接触的条件可不同。例如，条件可包括在其下核酸引导组分与靶核酸特异性杂交的温度，例如0℃至10℃(例如4℃)、10℃至20℃(例如16℃)、20℃至30℃(例如25℃)、30℃至40℃(例如37℃)、40℃至50℃、50℃至60℃、60℃至70℃、或70℃至80℃。用于实现核酸引导组分和靶核酸之间的特异性杂交的因素和方法在上文描述。在某些方面，核酸的初始集合的核酸是变性的(例如热变性的)，以在接触步骤之前生成单链核酸，从而有助于核酸引导组分与靶核酸的杂交。

根据其中核酸酶组分切割靶核酸的实施例，接触条件可包括在其下采用的特定核酸酶是活性，例如具有核酸酶活性的温度。此类温度可不同，并且在某些方面包括0℃至10℃(例如4℃)、10℃至20℃(例如16℃)、20℃至30℃(例如25℃)、30℃至40℃(例如37℃)、40℃至50℃、50℃至60℃、60℃至70℃、或70℃至80℃的温度。

某些核酸酶的核酸酶活性取决于一种或多种辅因子的存在。当此类核酸酶组分用于实践主题方法时，接触条件可包括对反应混合物提供任何必要辅因子。在某些方面，辅因子是一种或多种二价阳离子，例如Mg

反应混合物可包括一种或多种缓冲液(例如Tris缓冲液、PBS缓冲液等等)，以确保接触在例如在其下核酸酶显示出核酸酶活性的合适pH下发生。例如，接触条件可包括pH4.5至8.5，例如4.5至5.5、5.5至6.5、6.5至7.5、或7.5至8.5的反应混合物pH。

接触步骤可这样执行，使得核酸的初始集合、核酸引导组分和核酸酶组分的最终浓度适合耗尽靶核酸。例如，核酸的初始集合的最终浓度可为0.1pg/μl至10μg/μl，核酸引导组分的最终浓度可为25pM至50μM，并且核酸酶组分的最终浓度可为25pM至50μM。

本发明的方面包括制备核酸引导的核酸酶，例如本文其他地方描述的核酸引导的核酸酶中的任一种的方法。用于制备核酸引导的核酸酶的方法可不同。在某些方面，该方法包括由相同或不同表达质粒表达核酸引导组分和核酸酶组分。用于表达核酸引导组分和/或核酸酶组分的质粒和相关方案是商购可得的，并且包括例如

根据某些实施例，本公开内容提供了产生对于目的靶核酸特异性的核酸引导组分的基于PCR的方法。此类方法的一个实施例在图2中示意性举例说明。如所示的，使用者可设计包括下述的寡核苷酸引物(此处显示为正向“F”引物)：与目的启动子序列互补的序列(例如T7、U6、T3或其他启动子)；与对于目的靶核酸特异性的sgRNA引导序列互补的序列(例如对于由rRNA转录的靶cDNA特异性的)；和与sgRNA支架序列的至少一部分互补的序列。这种正向引物可与寡核苷酸引物(此处显示为反向“R”引物)结合使用，所述寡核苷酸引物具有与sgRNA支架序列的至少一部分互补的序列，以及用于产生sgRNA的任何其他有用的序列(例如聚dT束)。使用这些引物以及包括支架和任何其他期望元件的模板的PCR扩增产生模板(在图2中指定为“sgRNA的DNA模板”)，特定sgRNA可通过体外转录由所述模板转录，并且与核酸酶结合用于例如根据本公开内容的方法的靶核酸的选择性耗尽。图3中所示的是用于产生模板的示例正向(T7-T1-AcGFP和T7-T2-AcGFP)和反向(T7-Rev)寡核苷酸，sgRNA可通过体外转录由所述模板产生，例如根据图2中所示的实施例。用虚线三角形概述的序列是T7启动子序列。有下划线的序列是20bp crRNA序列。聚A序列用实心三角形概述。

核酸的初始集合可不同。目的核酸的初始集合的例子包括双链核酸(例如双链DNA)的集合、单链核酸(例如单链RNA或DNA)的集合、双链核酸和单链核酸的混合集合等。初始集合的复杂性也可不同，其中在一些情况下，集合包括5种或更多种、10种或更多种、25种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、250种或更多种、500种或更多种、1000种或更多种、5,000种或更多种，包括10,000种、100,000种或更多种、500,000种或更多种、1百万种或更多种、1亿种或更多种、或者10亿种或更多种不同序列的不同核酸。核酸的初始集合可包括脱氧核糖核酸、核糖核酸或其混合物。

在某些方面，目的核酸的初始集合是从目的核酸源中分离的核酸(例如不需要的核酸和需要的核酸)集合，包括但不限于从单一细胞、多重细胞(例如培养细胞)、组织、器官或生物例如细菌、酵母或生物集合(例如宏基因组样品，例如含有多重生物的海水、含有许多不同细菌种类的粪便样品、颊拭子等)等等中分离的核酸样品。如本文使用的，术语“样品”指材料或材料混合物，尽管不一定，但通常采取液体形式，含有需要从初始集合中耗尽(例如通过如本文其他地方描述的切割或取出)的核酸和/或蛋白质。在某些方面，核酸样品从哺乳动物(例如人、啮齿类动物(例如小鼠)、或任何其他目的哺乳动物)的细胞、组织、器官等等中分离。在其他方面，核酸样品从除哺乳动物外的源分离，所述源例如细菌、酵母、昆虫(例如果蝇)、两栖动物(例如蛙(例如非洲爪蟾(Xenopus)))、病毒、植物或任何其他非哺乳动物核酸样品源。根据某些实施例，目的核酸的初始集合不是基因组DNA。

可采用用于从此类源中分离核酸的任何方便的方案，以及设计用于从此类源中分离核酸的试剂和试剂盒。例如，用于从目的源中分离核酸的试剂盒是商购可得的，所述试剂盒例如Clontech Laboratories,Inc.(Mountain View,CA)的

根据某些实施例，目的核酸的初始集合由目的核酸的前体集合产生。例如，目的核酸的初始集合可为由目的核酸(例如RNA)的前体集合转录的DNA(例如cDNA)集合。在某些方面，目的核酸的初始集合是由目的RNA的前体集合转录的cDNA集合，其中目的RNA的前体集合包括mRNA、miRNA、rRNA等等，并且待耗尽的靶核酸是由核酸前体集合中存在的rRNA转录的cDNA。

由目的RNA的前体集合生成目的cDNA集合可包括在适合于聚合酶介导的延伸反应发生的条件下，通过组合目的RNA的前体集合与合适的聚合酶、dNTP、建立适当pH的缓冲液组分、一种或多种盐(例如KCl)、一种或多种金属辅因子(例如Mg

在由目的RNA的前体集合生成目的cDNA集合中有用的聚合酶包括但不限于逆转录酶，例如逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II组内含子衍生的逆转录酶，以及其突变体、变体衍生物或功能片段。例如，逆转录酶可为莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV RT)或家蚕(Bombyx mori)逆转录酶(例如家蚕R2非LTR元件逆转录酶)。在某些方面，聚合酶能够模板转换。模板转换聚合酶是商购可得的，并且包括可得自Clontech Laboratories,Inc.(Mountain View,CA)的SMARTScribe

在某些方面，例如当期望控制目的核酸的初始集合中的核酸大小时，通过剪切/断裂目的核酸的前体集合，由目的核酸的前体集合产生目的核酸的初始集合。剪切/断裂策略包括但不限于使目的核酸的前体集合经过微量移液器尖端或细号针头一次或多次，使样品雾化，将样品超声处理(例如使用Covaris,Inc.(Woburn,MA)的聚焦-超声发生器)、珠介导的剪切、酶促剪切(例如使用一种或多种DNA或RNA剪切酶)、基于化学品的断裂例如使用二价阳离子(例如Mg

根据某些实施例，目的核酸的初始集合包括在核酸的一个或两个末端处具有一种或多种测序衔接子构建体的核酸(例如双链DNA，例如双链cDNA)。“测序平台衔接子构建体”意指核酸构建体，其包括由目的测序平台利用的核酸结构域(例如测序平台衔接子核酸序列)或其互补体的至少一部分，所述目的测序平台例如由

当核酸(例如cDNA)的初始集合包括测序平台衔接子构建体时，本公开内容的方法可用于耗尽初始集合中的靶核酸的一个或多个亚群(例如不期望的序列例如由rRNA或其特定亚型转录的cDNA；或通过从初始集合取出而耗尽，回收以产生富含期望核酸的样品的期望序列)，随后为对所需核酸进行测序。在利用在待测序的核酸的两个末端处的衔接子序列的测序平台(例如基于

根据某些实施例，测序平台衔接子构建体包括选自下述的核酸结构域：与表面附着的测序平台寡核苷酸(例如在

在一些情况下，主题方法包括使核酸的初始集合与多个(例如“库”或“文库”)两种或更多种不同的核酸引导的核酸酶接触。核酸引导的核酸酶可在任何需要的方面不同。例如，该方法可采用核酸引导的核酸酶库，其中该库包括单一类型的核酸酶组分(例如可具有核酸酶活性或可替代地是切割缺陷的核酸酶)，以及具有不同核苷酸序列的两个或更多个种类的核酸引导组分。两个或更多个种类的核酸引导组分可这样设计，使得所得到的不同的核酸引导的核酸酶靶向单一靶核酸的多重区域、靶向多重不同靶核酸、靶向多重不同靶核酸的多重区域等。

可替代地或另外，多个两种或更多种不同的核酸引导的核酸酶可包括两个或更多个类型的核酸酶组分。例如，该方法可采用核酸酶的任何所需组合的库/文库，所述核酸酶就核酸酶的起源而言彼此不同(例如来自不同原核生物和/或真核生物物种的核酸酶)、就核酸酶活性而言彼此不同的核酸酶(例如库/文库可包括具有核酸酶活性的一种或多种核酸酶、其为切割缺陷的一种或多种核酸酶、一种或多种缺口酶、或其任何组合)、PAM序列(例如库/文库可包括利用具有不同PAM序列的引导核酸的核酸酶)、以及适合于从初始集合中耗尽一种或多种靶核酸的核酸酶组分的任何其他组合。如上文阐述的，不同核酸酶组分的库可与不同核酸引导组分的库结合使用，以实现所需数目的靶核酸的所需耗尽水平。耗尽可包括切割初始集合中存在的靶核酸(例如一种或多种核糖体和/或线粒体RNA)、从初始集合中取出靶核酸(例如以产生富含从初始集合中取出的靶核酸的核酸样品)或两者。

像这样，本公开内容的方面包括从核酸的初始集合中选择性耗尽核酸亚群(例如rRNA和/或mtRNA衍生的核酸)的方法。在此类实施例中，该方法可包括以足以从初始集合中耗尽亚群的方式，使核酸的初始集合与核酸引导的核酸酶文库接触，其中所述文库包括对于核酸亚群的两个或更多个成员和/或单个成员的多重区域特异性的两种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。在这些实施例中，文库大小可不同。例如，文库可包括2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、25种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、1000种或更多种、10000种或更多种、50000种或更多种、100000种或更多种、500000种或更多种、或者1百万种或更多种不同的核酸引导的核酸酶等。在某些方面，文库包括两种或更多种，但1百万种或更少种、500000种或更少种、100000种或更少种、50000种或更少种、10000种或更少种、1000种或更少种、500种或更少种、100种或更少种、25种或更少种、10种或更少种、5种、4种或3种不同的核酸引导的核酸酶。

本公开内容的方面还包括制备核酸引导的核酸酶文库的方法。此类方法可包括使用图2中显示和上文描述的基于PCR的方法产生多种不同的核酸引导组分。在某些实施例中，该方法以足以产生核酸引导的核酸酶文库的方式，组合多种不同的引导核酸与一种或多种不同的核酸酶。核酸酶可不同，并且在一些情况下，是Cas核酸酶(例如Cas9)或Ago核酸酶，所述核酸酶可独立地具有或不具有切割活性。所产生文库的大小可不同，并且在一些情况下，包括2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、25种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、1000种或更多种、10,000种或更多种、50,000种或更多种、100,000种或更多种、500,000种或更多种、或者1百万种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。在某些方面，所产生的文库包括两种或更多种，但1百万种或更少种、500,000种或更少种、100,000种或更少种、50,000种或更少种、10,000种或更少种、1000种或更少种、500种或更少种、100种或更少种、25种或更少种、10种或更少种、5种、4种或3种不同的核酸引导的核酸酶。在一些情况下，核酸引导包括分开的crRNA和tracrRNA，或者包括其功能元件的组分例如sgRNA。在一些情况下，该方法包括产生核酸引导，例如通过由编码核酸引导的质粒表达核酸引导，或通过PCR和体外转录，例如上文更详细地描述和图2中显示的。根据某些实施例，核酸引导通过固相合成而产生(例如如标准寡核苷酸合成中)。

在一些情况下，所产生文库的核酸引导的核酸酶各自包括核酸引导组分(例如RNA或DNA引导组分)和核酸酶组分，例如Cas核酸酶组分(例如Cas9)、Argonaute核酸酶组分(例如Tth Ago、Ago2等等)。核酸酶组分可显示出切割活性或是切割缺陷突变体。需要时，核酸酶组分还可包括标签，例如上文描述的。

本公开内容还提供的是组合物。在某些方面，组合物包括多种不同的核酸引导的核酸酶。多种不同的核酸引导的核酸酶可包括2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、25种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、1000种或更多种、10,000种或更多种、50,000种或更多种、100,000种或更多种、500,000种或更多种、或者1百万种或更多种不同的核酸引导的核酸酶等。在某些方面，多种不同的核酸引导的核酸酶包括两种或更多种，但1百万种或更少种、500,000种或更少种、100,000种或更少种、50,000种或更少种、10,000种或更少种、1000种或更少种、500种或更少种、100种或更少种、25种或更少种、10种或更少种、5种、4种或3种不同的核酸引导的核酸酶。

根据某些实施例，不同的核酸引导的核酸酶基于下述是不同的：具有不同核酸酶组分的核酸引导的核酸酶；和/或具有不同核苷酸序列的核酸引导组分的核酸引导的核酸酶。例如，基于具有与相同靶核酸的不同区域互补的不同序列的引导组分，不同的核酸引导的核酸酶可靶向相同靶核酸的不同区域，和/或，基于具有与不同靶核酸互补的不同序列的引导组分，和/或具有不同的PAM序列需求以便扩宽靶序列阵列的不同核酸酶种类(例如不同Cas9种类)，不同的核酸引导的核酸酶可靶向不同靶核酸。

主题组合物可存在于任何合适的环境中。根据一个实施例，组合物存在于反应管(例如0.2mL管、0.6mL管、1.5mL管等等)或孔中。在某些方面，组合物存在于两个或更多个(例如多个)反应管或孔(例如板，例如96孔板)中。管和/或板可由任何合适的材料例如聚丙烯等等制成。在某些方面，组合物存在于其中的管和/或板提供了对组合物的有效热传递(例如当置于加热块、水浴、热循环仪等等中时)，使得组合物的温度可在短时间段内改变，所述时间段例如如对于特定酶促反应发生所需的。根据某些实施例，组合物存在于薄壁聚丙烯管，或具有薄壁聚丙烯孔的板中。在某些实施例中，反应在固体表面或珠上发生可为方便的，在此类情况下，核酸或核酸引导的核酸酶的初始集合可通过本领域已知的方法(例如生物素连接或通过共价键)附着至固体支撑物或珠，并且反应允许在支撑物上进行。

用于主题组合物的其他合适环境包括例如微流控芯片(例如“微流控芯片实验室装置”)。组合物可存在于配置为使组合物达到所需温度的仪器中，例如温度控制水浴、加热块等等。配置为使组合物达到所需温度的仪器可配置为使组合物达到一系列不同的所需温度，各自用于合适的时间段(例如仪器可为热循环仪)。

被靶向以耗尽的核酸可为通过主题方法的从业者选择的任何靶核酸。根据一个实施例，靶核酸是初始RNA(例如rRNA或mtRNA，而不是RNA的逆转录产物)。在某些方面，靶核酸是初始RNA(例如rRNA或mtRNA)的逆(DNA)转录产物。RNA(例如初始转录的RNA)可为任何类型的RNA(或其亚型)，包括但不限于核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA(mtRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、长的非编码RNA(lncRNA)、非编码RNA(ncRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反式激活小干扰RNA(ta-siRNA)、天然小干扰RNA(nat-siRNA)、转移信使RNA(tmRNA)、前体信使RNA(mRNA前体)、小卡哈尔体特异性RNA(scaRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核糖核酸内切酶制备的siRNA(esiRNA)、小时序RNA(stRNA)、信号识别RNA、端粒RNA、核酶、以及其RNA类型或其亚型的任何组合。当靶核酸是初始RNA的转录产物时，该方法可包括耗尽样品中所有类型的此类转录产物(例如核糖体RNA、转移RNA、微小RNA等等)、或者一种或多种特定类型的此类转录产物。在某些方面，靶核酸是核糖体RNA(rRNA)模板的转录产物。在此类情况下的rRNA模板可为真核生物28S、26S、25S、18S、5.8S、5S rRNA或其任何组合。在其他方面，rRNA模板可为原核生物23S、16S、5S rRNA或其任何组合。主题方法在耗尽除由核糖体RNA产生的那些外的RNA转录产物中有用。例如，靶核酸可为信使RNA(mRNA)的转录产物，例如来自总RNA或mRNA库的高度表达但临床上无关的mRNA(例如总或聚A

在某些方面，当需要通过切割初始集合中存在的内含子或基因间DNA，或通过直接捕获外显子序列，使样品富含外显子DNA(例如使样品富含对应于目的种类的外显子组的核酸)时，靶分子是靶核酸，并且靶核酸是脱氧核糖核酸(DNA)，例如内含子或基因间DNA。在某些方面，基于DNA的质粒/载体例如用于体外转录的那些可被靶向以通过切割耗尽，例如在体外转录反应完成后，以使核酸样品富含新近转录的RNA。

当实践本公开内容的方法时，核酸引导的核酸酶可这样设计，使得切割频率和所得到的特定靶核酸的片段大小通过主题方法的从业者加以选择。例如，如上所述，当期望将靶核酸切割成3个或更多个片段时，靶向靶核酸内的不同序列的两种或更多种核酸引导的核酸酶可以多路化方式使用。靶核酸的被靶向序列可选择为产生所需大小的片段，例如足够小以使用旋转柱、乙醇沉淀等等从样品中取出的片段。

效用

主题方法在各种不同应用中有用，例如当期望从目的样品中耗尽无关和/或不需要的分子时；当期望通过从样品中取出目的核酸而耗尽目的核酸以进行后续回收(由此产生富含目的核酸的样品；等等)时。通过耗尽无关和/或不需要的分子，或取出期望分子以产生富集样品，样品的复杂性减少并且样品富含目的分子。当目的分子是核酸时，目的核酸的复杂性减少和富集可有助于和/或改善下游应用的结果，所述下游应用例如核酸扩增、核酸测序、基因表达分析(例如，通过阵列杂交、定量RT-PCR、大规模平行测序等)、其中包括目的治疗性核酸的药物组合物的制备、以及其中目的核酸的样品复杂性减少和富集是有益的任何其他应用。

例如，主题方法的某些实施例包括从测序文库中耗尽核酸。例如，初始集合可为在目的测序平台(例如高流通量或“下一代”测序平台，例如基于

在某些方面，靶核酸(例如无关/不期望的核酸，例如来源于rRNA、mtRNA的核酸等等)的耗尽致使靶核酸对于测序平台不可见。即，耗尽的(例如切割的)靶核酸不再适合于在目的测序平台上测序。例如，基于

在某些方面，当目的测序平台仅需要核酸包括在核酸的单一末端处的衔接子时，可致使靶核酸不适合于在平台上测序，通过例如切割靶核酸，使得大多数或所有所得到的片段的长度太短而无法在测序平台上测序。这可通过在靶核酸内的单一位置处、或者在两个或更多个位置处切割靶核酸来完成，以生成长度不足以在测序平台上测序的片段(例如因为平台需要更大长度的核酸)，或片段在测序前的纯化程序(例如珠纯化，例如基于SPRI珠的纯化)期间丢失。待切割的位置和切割位点之间的距离可通过主题方法的从业者加以选择，以生成所需长度的切割片段，例如使用对于目的靶核酸可获得的核酸序列信息，且设计与所选择的切割位点具有序列互补性的核酸引导组分。以这种方式，致使靶核酸对测序平台不可见，并且在测序平台上的负荷和测序结果的复杂性减少。

如上所述，本公开内容的方法还在从核酸的初始集合中选择性回收一个或多个类型的目的核酸中有用。例如，在某些方面，从核酸的初始集合中耗尽一个或多个类型的靶核酸包括经由形成靶核酸/核酸引导的核酸酶复合物来捕获靶核酸，并且随后从复合物中回收靶核酸例如用于下游分析(例如定量分析、序列分析等等)。用于靶核酸捕获和回收的方法包括例如基于亲和力的方法(在某些方面，其通过包括表位/亲和标签的核酸酶组分得到促进)，如在上文描述的。相应地，主题方法在从核酸集合中选择性获得一种或多种目的靶核酸中有用，在某些方面，所述核酸集合是复杂的核酸集合(例如通过总RNA样品的逆转录产生的cDNA集合、来自基因组文库的外显子、或任何其他复杂的目的核酸集合)。

试剂盒

本公开内容还提供的是可用于实践主题方法的试剂盒。试剂盒可包括上文与主题方法和组合物有关描述的任意组分中的一种或多种。例如，试剂盒可包括用于生成PCR扩增产物的引物和模板，核酸引导组分可通过体外转录由所述PCR扩增产物产生。此类试剂可包括在实践方法中有用的任何试剂，所述方法用于产生图2中显示和上文描述的核酸引导组分(例如sgRNA)。根据某些方面，试剂盒包括用于与由试剂盒的使用者提供的正向引物结合使用的反向引物，其中正向引物的至少一部分包括与由使用者选择用于耗尽的靶核酸互补的核酸序列。

在一些情况下，试剂盒包括：包含sgRNA支架模板结构域的载体；配制用于与载体一起在PCR反应中使用的反向引物；以及RNA聚合酶。在一些情况下，反向引物包括聚A结构域和sgRNA支架结构域。虽然RNA聚合酶可不同，但在一些实施例中，RNA聚合酶是T7聚合酶。需要时，试剂盒还包括DNA聚合酶中的一种或多种；PCR缓冲液；可具有或不具有切割活性的核酸酶(例如Cas、Ago或其他核酸酶)；对照核酸等。

主题试剂盒的组分可存在于分开的容器中，或多重组分可存在于单一容器中。例如，当试剂盒包括用于生成RNA引导组分通过体外转录由其产生的模板DNA的引物时，引物可在分开的容器中或包括试剂盒的第二组分(例如缓冲液等等)的容器中提供。

除上述组分之外，主题试剂盒还可包括用于使用试剂盒的组分实践主题方法的说明书。用于实践主题方法的说明书可记录在合适的记录介质上。例如，说明书可打印在基质例如纸或塑料等上。像这样，说明书可作为包装说明书存在于试剂盒、试剂盒或其组分的容器的标记中(即与包装或分包装结合)等。在其他实施例中，说明书作为合适的计算机可读存储介质上存在的电子存储数据文件呈现，所述计算机可读存储介质例如便携式闪存驱动器、DVD、CD-ROM、磁盘等。在另外其他实施例中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供用于从遥远源例如经由因特网获得说明书的手段。该实施例的例子是包括网址的试剂盒，其中说明书可由所述网址察看和/或可由所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段记录在合适基质上。

下述实例提供作为举例说明而不是限制。

实验

在本实例中，产生核酸引导的核酸酶，并且作为概念证明，用于耗尽具有对应于rRNA序列的靶序列的PCR产物。使用图2中概述和上文描述的方法，通过PCR使用

随后就其当与Cas9(500ng)组合时，切割具有的序列对应于rRNA序列的PCR产物(260ng)能力，测试体外转录的CMBO640(72ng/μl)和CMBO641(90ng/μl)sgRNA。结果在图5中提供。如所示的，组合Cas9、COMBO640和/或COMBO641 sgRNA以及PCR产物导致PCR产物的切割。

在本实例中，显示具有不同靶序列特异性的两种不同的sgRNA可结合(即以多路化方式)使用，以耗尽具有对应于全长18S rRNA的序列的靶DNA。如图6中提供的凝胶图像中所示，包括Cas9和第一sgRNA(“sgRNA1”，从左起的第四泳道)的核酸引导的核酸酶，以及包括Cas9和第二sgRNA(“sgRNA2”，从左起的第五泳道)的核酸引导的核酸酶，分开地能够在不同位置处切割具有对应于全长18S rRNA的序列的靶DNA。当两种核酸引导的核酸酶均与靶DNA(从左起的第六泳道)组合时，靶DNA在两个分别的切割位点处切割，指示发生多路化靶耗尽。

在本实例中，测试了核酸引导的核酸酶从下一代测序文库中耗尽不需要的序列的能力。由人脑总RNA转录的cDNA的下一代测序文库用sgRNA/Cas9核酸引导的核酸酶处理，以在对文库进行测序之前，通过在对应于18S rRNA的cDNA的位置1022-1041处切割，来耗尽对应于18S rRNA的cDNA。所得到的序列对rRNA作图，并且与1022-1041重叠的读数数目除以对rRNA作图的读数总数目。将比率标绘且对于对照标准化。

如图7的小图A中所示，靶序列的耗尽仅在用Cas9和特异性引导RNA两者处理的文库中发生。

在分开的实验中，对应于18S rRNA的靶cDNA使用沿其长度约每50bp靶向靶cDNA的sgRNA库进行降解。通过PCR扩增35种sgDNA模板(使用图2中所示的方法)，并且随后在合并的体外转录反应中体外转录相应35种sgRNA来生成库。这是图2中所示的本公开内容方法的关键优点之一，因为不同sgRNA序列的大量复杂集合可在单一反应中产生，用于使用sgRNA集合耗尽单一靶(通过跨越靶用具有不同靶特异性序列的sgRNA平铺(tiling))或耗尽多重靶。

在该实验中，使用包括对应于全长18S RNA(25ng)和55ng 5800bp质粒iPCR产物(用作28S rRNA的替代物)的靶的模型靶。这个比率接近不经耗尽的20nM RNA-Seq文库中的18S和28S rRNA比率(以质量表示)。如图7的小图B中所示，18S片段通过用sgRNA库处理充分耗尽/降解，而iPCR片段不受影响。靶核酸的耗尽导致靶不能在测序仪(例如

在该实验中，使用SMARTer Stranded RNA-Seq试剂盒(Clontech)，由100ng人脑总RNA(Clontech)生成测序文库。70ng文库与0、2或5μg重组纯化的Cas9，以及先前实验中所述的0或191ng 35sgRNA库一起在20μl 1X NEB3.1缓冲液中在37℃下温育一小时。Cas9随后在70℃下热失活10分钟。文库随后合并且在MiSeq仪器上测序。所得到的序列使用STAR对准物(aligner)针对人基因组hg19和rRNA转录物同时进行作图。图8举例说明了仅产生于用Cas9和sgRNA库两者处理的18S rRNA转录物的序列覆盖中的减少。对18S rRNA作图的测序读数数目对图9中测序且标绘的读数总数目标准化，证实对18S转录物作图的序列中的～75％减少。

实例1-4：序列信息

实例1-4中描述的sgRNA含有图1中所示的sgRNA支架，伴随下述靶特异性序列：

实例1和2中使用的sgRNA1：UUAUCAGAUCAAAACCAACC(SEQ ID NO:01)

实例1、2和3中使用的sgRNA2：UAAUCAAGAACGAAAGUCGG(SEQ ID NO:02)

实例3和4中使用的35sgRNA库：(SEQ ID NO:03至37)

GACAAGCAUAUGCUACUGGC CGGCGCAAUACGAAUGCCCC

CGGUACAGUGAAACUGCGAA CGCUCUGGUCCGUCUUGCGC

GGAGAGGAGCGAGCGACCAA UAAUCAAGAACGAAAGUCGG

UAGAGCUAAUACAUGCCGAC CGGUCGGCAUCGUUUAUGGU

UUAUCAGAUCAAAACCAACC GUUUCCCGGAAGCUGCCCGG

GGGGCGGGCGCCGGCGGCUU CUGAAACUUAAAGGAAUUGA

CGAUCGCACGCCCCCCGUGG GGCUUAAUUUGACUCAACAC

GGUAGUCGCCGUGCCUACCA CUGUCAAUCCUGUCCGUGUC

UCAGGGUUCGAUUCCGGAGA GCAUGGCCGUUCUUAGUUGG

UGCGCGCCUGCUGCCUUCCU GCCAGAGUCUCGUUCGUUAU

AACAAUACAGGACUCUUUCG GCGUCCCCCAACUUCUUAGA

CCUCGUUAAAGGAUUUAAAG UGUUAUUGCUCAAUCUCGGG

UAUUGGAGCUGGAAUUACCG AGCGUGUGCCUACCCUACGC

AAAGCUCGUAGUUGGAUCUU CCGUUGAACCCCAUUCGUGA

CAAGGGGCGGGGACGGGCGG UACUGGGAAUUCCUCGUUCA

UCUUAGCUGAGUGUCCCGCG GGCGGUGUGUACAAAGGGCA

CAAAGCAGGCCCGAGCCGCC GGCCCUCGGAUCGGCCCCGC

GGACCGCGGUUCUAUUUUGU

在本实例中，评价了Argonaute(Ago)蛋白质耗尽靶核酸的能力。将加上His标签的Tth Ago表达且纯化(图10，小图A)。通过组合500nM单链DNA、Tth Ago和100nM 5’磷酸化的与靶单链DNA互补的靶向寡核苷酸进行5’FAM标记的ssDNA代表性靶的耗尽，并且在75℃下温育一小时。如图10，小图B中所示，单链靶在不存在Ago(最右侧的泳道)的情况下不切割，但在Ago和以不同Ago浓度的靶向寡核苷酸的存在下切割。图11证实相似实验，但采用20nMssDNA靶和50nM引导DNA，以代表耗尽的常见文库浓度。

在实例5中，引导DNA寡核苷酸是：

/5’Phos/TGAGGTAGTAGGTTGTATAGT(SEQ ID NO:38)；并且靶向寡核苷酸是：

/5’6-FAM/AGGTGATAAGACTATACAACCTACTACCTCGAATGTCCGT(SEQ ID NO:39)

如实例5中证实的，Argonaute能够耗尽溶液中的靶ssDNA分子。如果所需靶是双链，则可通过例如使用热或高pH变性，或通过经由核酸外切酶处理降解非靶链，将双链材料转换为单链。例如，混合物可通过PCR引物的常见对进行扩增，所述PCR引物对中仅一个是5'磷酸化的。扩增产物随后可用λ核酸外切酶处理，以获得ssDNA产物。这种ssDNA产物随后可用作通过Ago切割的底物和靶向寡核苷酸。

在本实例中，加上6xHN标签的Cas9的D10A/H840A突变体(在本文中被称为dCas9)在大肠杆菌(E.coli)中表达且纯化(图12，小图A)。RNA-Seq文库由100ng人脑聚A-plus RNA(Clontech)和SMARTer Stranded RNA-Seq试剂盒(Clontech)生成。使10ng文库与～1.25μgdCas9和76ng 190sgRNA库在10μl 1X NEB3.1中组合，所述190sgRNA库设计在人5S、5.8S、18S、28S、mt12S和mt16S序列上的每～50bp。混合物在37℃下温育一小时。随后加入10μg鲑精DNA(Life Technologies)，并且允许反应在37℃下进行另外30分钟。将在10μl NEB3中平衡的5μl TALON磁珠(Clontech)加入管中，并且在25℃下伴随旋转温育30分钟。珠用200μlNEB洗涤两次。将50μl SeqAmp PCR Mastermix(1X SeqAmp缓冲液、1μl SeqAmp DNA聚合酶、以及250nM Illumina P5和P7 PCR引物)加入洗涤的珠中，并且用15个PCR循环(94℃1分钟、15X(98℃-15秒、55℃-15秒、68℃-30秒))进行扩增。根据制造商的说明书，扩增产物用50μlAMPure珠(Beckman)进行纯化，并且在20μl 10mM Tris-HCl pH8.5 0.1％Tween-20中洗脱。文库随后在MiSeq仪器上测序。所得到的序列使用STAR对准物针对人基因组hg19和rRNA转录物同时作图。通过Picard RNA-Seq Metrics鉴定对rRNA作图的读数，并且对rRNA作图的序列的相对量在图12，小图B中标绘，显示相对于未经处理的文库的～340％富集。本实例证实核酸引导的核酸酶可通过从核酸的初始集合中取出靶核酸用于耗尽靶核酸，以用于富含靶核酸的样品的后续回收和产生。

尽管具有所附条款，本公开内容还通过下述条款进行限定：

1.一种从核酸的初始集合中选择性耗尽靶核酸的方法，所述方法包括：

以足以从所述初始集合中耗尽靶核酸的方式，使所述核酸集合与对于所述靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸是双链核酸。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸是单链核酸。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸引导的核酸酶包含RNA引导组分和核酸酶组分。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸酶组分包括Cas核酸酶组分。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Cas核酸酶组分显示出切割活性，并且所述方法导致所述靶核酸的切割，以耗尽所述靶核酸的初始集合。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述Cas核酸酶组分是切割缺陷突变体，并且所述方法导致产生包含靶核酸/核酸引导的核酸酶复合物的产物组合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括使所述复合物与所述产物组合物的其他组成成分分开。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Cas核酸酶组分还包括标签。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法还包括从所述复合物中回收靶核酸。

12.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸引导的核酸酶包括DNA引导组分和核酸酶组分。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸酶组分包括Tth Ago核酸酶组分。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括使所述核酸的初始集合与多个两种或更多种不同的核酸引导的核酸酶接触。

15.一种从核酸的初始集合中选择性耗尽核酸亚群的方法，所述方法包括：

以足以从所述初始集合中耗尽亚群的方式，使所述核酸的初始集合与核酸引导的核酸酶文库接触，其中所述文库包括对于所述核酸亚群的一种或多种成员特异性的两种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述亚群包括脱氧核糖核酸。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述亚群包括双链核酸。

18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述亚群包括单链核酸。

19.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述文库包括五种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述五种或更多种不同的核酸引导的核酸酶具有不同序列的核酸引导组分。

21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述核酸引导的核酸酶各自包括RNA引导组分和核酸酶组分。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸酶组分包括Cas核酸酶组分。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述Cas核酸酶组分显示出切割活性，并且所述方法导致所述亚群的切割，以耗尽所述亚群的初始集合。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述Cas核酸酶组分是切割缺陷突变体，并且所述方法导致产生包含亚群核酸/核酸引导的核酸酶复合物的产物组合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述方法还包括使所述复合物与所述产物组合物的其他组成成分分开。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述Cas核酸酶组分还包括标签。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法还包括从所述复合物中回收亚群核酸。

28.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述核酸引导的核酸酶各自包括DNA引导组分和Tth Ago核酸酶组分。

29.根据权利要求15-27中任一项所述的方法，其中所述核酸的初始集合包括下一代测序(NGS)核酸集合。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述亚群包括不需要测序的序列。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法还包括对所述亚群耗尽的NGS核酸集合进行测序。

32.一种包含多种不同的核酸引导的核酸酶的组合物。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述组合物包括5种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述组合物包括25种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述组合物包括100种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包括500种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物包括1000种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

38.根据权利要求32-37中任一项所述的组合物，其中所述核酸引导的核酸酶具有不同序列的核酸引导组分。

39.根据权利要求32-38中任一项所述的组合物，其中所述核酸引导的核酸酶各自包括RNA引导组分和核酸酶组分。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述核酸酶组分包括Cas核酸酶组分。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述Cas核酸酶组分显示出切割活性。

42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述Cas核酸酶组分是切割缺陷突变体。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述Cas核酸酶组分还包括标签。

44.根据权利要求32-38中任一项所述的组合物，其中所述核酸引导的核酸酶各自包括DNA引导组分和核酸酶组分。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述核酸酶组分包括Tth Ago核酸酶组分。

46.一种制备核酸引导的核酸酶文库的方法，所述方法包括：

以足以产生核酸引导的核酸酶文库的方式，组合多种不同引导核酸与核酸酶。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述核酸酶是Cas核酸酶。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述Cas核酸酶包含切割活性。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述Cas核酸酶是切割缺陷突变体。

50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述文库包括5种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述文库包括25种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述文库包括100种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述文库包括500种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述文库包括1000种或更多种不同的核酸引导的核酸酶。

55.根据权利要求46-54中任一项所述的方法，其中所述核酸引导包括crRNA和tracrRNA。

56.根据权利要求46-55中任一项所述的方法，其中所述核酸引导包括sgRNA。

57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括产生所述核酸引导。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述核酸引导通过由编码所述核酸引导的载体表达所述核酸引导产生。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述核酸引导使用体外转录方案产生。

60.一种试剂盒，其包括：

包含sgRNA支架模板结构域的载体；

配制用于与载体一起用于PCR反应中的反向引物；和

RNA聚合酶。

61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述反向引物包括聚A结构域和sgRNA支架结构域。

62.根据权利要求60和61中任一项所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶是T7聚合酶。

63.根据权利要求60-62中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括DNA聚合酶。

64.根据权利要求60-63中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括PCR缓冲液。

65.根据权利要求60-64中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括核酸酶。

66.根据权利要求65所述的试剂盒，其中所述核酸酶是Cas核酸酶。

67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中所述Cas核酸酶包含切割活性。

68.根据权利要求66所述的试剂盒，其中所述Cas核酸酶是切割缺陷突变体。

尽管为了清楚理解的目的，本发明已通过举例说明和例子略微详细地描述，但根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员容易显而易见的是，可对其作出某些变化和修饰，而不背离所附权利要求的精神或范围。

相应地，前文仅举例说明本发明的原理。应了解本领域技术人员将能够设计各种排列，尽管在本文中未明确描述或显示，但所述各种排列体现本发明的原理，并且包括在其精神和范围内。此外，本文叙述的所有例子和条件语言原则上预期帮助读者理解本发明的原理和由本发明人贡献的概念，以促进本领域，并且应解释为并不限于此类具体叙述的例子和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施例以及其具体例子的所有陈述预期涵盖其结构和功能等价物两者。另外，预期此类等价物包括目前已知的等价物和未来开发的等价物两者，即执行相同功能的开发的任何元件，与结构无关。本发明的范围因此不预期限制于本文显示且描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神通过所附权利要求体现。